全 文 ：Vol. 35 No. 12
Dec. 2015
第 35卷 第 12期
2015年 12月
中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
Journal of Central South University of Forestry & Technology
Doi:10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.12.001 http: //qks.csuft.edu.cn
收稿日期：2014-09-23
基金项目：国家林业局 948项目（2012-4-33）；江苏省林业三项工程（Lxsx[2008]32）；江苏高校品牌专业建设工程资助项目；江
苏省高校“青蓝工程”资助项目（2012年）；江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）
作者简介：田如男，教授，博士生导师；E-mail：beike0607@aliyun.com
引文格式：田如男，何 宁，徐 宁，等 . 棱角山矾叶片愈伤组织的诱导及其细胞形态学观察 [J].中南林业科技大学学报 ,2015,
35(12): 1-9.
棱角山矾 Symplocos tetragona为山矾科山矾
属常绿乔木，主要分布于我国江西、湖南、福建
及浙江等省海拔 1 000 m以下杂木林中 [1]。树冠呈
圆锥状或卵圆形，外形优美；叶片油绿有光泽；
3～ 4月开花，花白色，有淡淡的清香，白色的花
布满整个树冠，景致优美；枝叶茂密，有隔音功效，
对大气有毒成分有较强抗性，是有前途的观赏生
态环保型树种 [2]。棱角山矾种子有隔年 (2 a)甚至
3 a发芽特性，属综合深休眠型种子，既存在着种
壳导致的强迫休眠，又存在着生理休眠 [3]，这严
棱角山矾叶片愈伤组织的诱导及其细胞形态学观察
田如男，何 宁，徐 宁，霍明霞
(南京林业大学 风景园林学院，江苏 南京 210037)
摘 要：以棱角山矾叶片为外植体进行愈伤组织的诱导与增殖研究，并利用扫描电镜和透射电镜对愈伤组织进
行细胞形态学观察。研究结果表明：叶基和叶中是棱角山矾叶片愈伤组织诱导的最佳部位，且宜选择远轴面向
上的接种方式。棱角山矾叶片表面灭菌最适方法为 70%酒精灭菌 30～ 90 s，再用 2%次氯酸钠灭菌 3 min。愈
伤组织诱导的最适培养基为 B5+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，该培养基上诱导率达
到最高，为91.11%。愈伤组织增殖的最适培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，
该培养基上愈伤组织的增殖系数达到最高，为 1.12，褐变率为 14.29%。棱角山矾愈伤组织最佳的继代周期为 20 d，
以继代 1～ 3次为宜。光暗交替有利于棱角山矾叶片愈伤组织的诱导，而暗培养促进愈伤组织的增殖。5 g/L活
性炭对防止棱角山矾叶片愈伤组织褐化的效果最佳。胚性愈伤组织细胞呈球形、大小均一，多以细胞团形式存在，
内容物丰富；非胚性愈伤组织细胞形状不规则，内含一大液泡，细胞器较少。
关键词：棱角山矾；叶片；愈伤组织诱导；愈伤组织增殖；细胞形态学观察
中图分类号：S722.3+5 文献标志码：A 文章编号：1673-923X(2015)12-0001-09
Induction and cell morphological observation of callus from leaves of
Symplocos tetragona
TIAN Ru-nan, HE Ning, XU Ning, HUO Ming-xia
(College of Landscape Architecture, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, Jiangsu, China)
Abstract: The callus induction and proliferation of leaves of Symplocos tetragona were conducted, and the observations of callus cell
morphology were carried by using scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. The results show that the best
parts of callus induction were in leaf base and leaf midst with method of keeping the leaves’ abaxial face up; The most appropriate
method of surface sterilization on leaves was 70% alcohol for 30 to 90 seconds and 2% NaClO for 3 minutes; The optimal callus
induction medium of leaves was B5+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L NAA+30 g/L sucrose, with a maximum induction rate
of 91.11%; The optimal callus proliferation medium was MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L NAA+30 g/L Sucrose, with
a maximum multiplication factor of 1.12, and the browning rate was 14.29%; The best subculture cycle of callus was 20 days, and
the generation of 1~3 times was appropriate. The culture of alternating light and dark was benefi t to callus induction, however, the
proliferation of callus was promoted under dark culture. The best treatment for inhibiting browning was 5g/L acticarbon. The cells of
embryonic callus are spherical in uniform size with rich inclusions, forming cell masses; While the cells of non-embryonic callus are
irregular, containing a large vacuole, less organelles.
Key words: Symplocos tetragona; leaf; callus induction; callus proliferation; cell morphological observation
田如男，等：棱角山矾叶片愈伤组织的诱导及其细胞形态学观察2 第 12期
重影响了其有性繁殖进程。目前，对棱角山矾繁
殖技术的研究主要集中在扦插繁殖 [4]；组培快繁
方面的研究较少，仅以种子为外植体进行了初步
研究 [5]，但至今尚未建立棱角山矾组培快繁的完
整体系。本研究以棱角山矾的叶片为外植体，从
消毒剂配方、培养基种类、植物生长调节剂配方、
接种部位及接种方向、继代周期及继代次数等方
面，对棱角山矾叶片愈伤组织的诱导和增殖进行
研究，筛选出愈伤组织诱导与增殖的最优方案，
为棱角山矾由愈伤组织诱导体胚发生途径再生植
株提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
采自南京林业大学园林国家级实验教学示范
中心的棱角山矾 3年生实生苗，在生长健壮的植
株上采集新梢嫩叶作为外植体。
1.2 试验方法
1.2.1 外植体最佳灭菌方法的选择
将采集的叶片放在洗洁精水中浸泡 10 min，
不断搅动，用软刷刷洗叶片表面，然后放在流水
下冲洗1 h。预处理之后，将叶片置于超净工作台上，
用 70%的酒精表面杀菌 30、60、90 s，然后用无
菌水冲洗 2～ 3次，再分别转入 2%的次氯酸钠
（NaClO）中消毒 1、3、5、7、10 min，倒掉消毒
液，最后用无菌水冲洗 3～ 4次。将消毒后的叶
片在培养皿中切成 0.5 cm×0.5 cm左右的正方形，
接种到添加 0.5 mg/L 6-BA和 1.0 mg/L NAA的 B5
培养基上，pH值调至 5.8。每处理接种 20瓶，每
瓶 3个外植体，重复 3次。培养条件：温度 25±1 ℃，
光照强度 3 000 lx左右，光照时数 14 h/d。25 d后
统计污染率、死亡率、成活率。
1.2.2 愈伤组织的诱导
1.2.2.1 基本培养基的筛选
将叶片切成 0.5 cm×0.5 cm左右的正方形，
分别接种到添加了 0.5 mg/L 6-BA和 1.0 mg/L NAA
的 MS、WPM、B5 3种不同的基本培养基上。每
处理接种 20瓶，每瓶 3个叶片，重复 3次。培养
条件：温度 25±1 ℃，光照强度 3 000 lx 左右，光
照时数 14 h/d。30 d后统计愈伤组织的诱导率以及
生长状况。
1.2.2.2 植物生长调节剂的配方
根据上述实验结果，在最适培养基上，采用
三因素三水平正交试验进行植物生长调节剂配方
的筛选，每处理接种 20瓶，每瓶 3个叶片，重复
3次。正交试验设计方案见表 1。培养条件：温度
25±1 ℃，光照强度 3 000 lx 左右，光照时数 14 h/d。
30 d后统计出愈伤组织的诱导率以及生长状况。
表 1 6-BA、2,4-D、NAA正交试验设计(L9(34))
Table 1 Orthogonal design program of 6-BA, 2, 4-D and
NAA (L9(34))
水平 6-BA /(mg·L-1) 2,4-D /(mg·L-1) NAA /(mg·L-1)
1 0.1 0.1 0.1
2 0.5 0.3 0.5
3 1.0 0.5 1.0
1.2.2.3 接种部位及接种方向对叶片愈伤组织诱导
的影响
沿垂直主叶脉方向将叶片横切两刀，将其分
为叶尖、叶中、叶基三部分，分别置于最适培养
基上培养，每处理接种 20 瓶，每瓶 3个叶片，重
复 3 次。30 d后统计愈伤组织的诱导率以及生长
状况。
将叶片分别以远轴面向上和近轴面向上置于
最适培养基上培养，每处理接种 20瓶，每瓶 3个
叶片，重复 3次。30天后统计出愈伤组织的诱导
率以及生长状况。
培养条件：温度 25±1 ℃，光照强度 3 000 lx
左右，光照时数 14 h/d。
1.2.2.4 光照和黑暗对叶片愈伤组织诱导的影响
将棱角山矾叶片接种到最适培养基上，分别
进行光暗交替培养和暗培养，每处理接种 20瓶，
每瓶 3个叶片，重复 3次。30 d后统计出愈伤组
织的诱导率以及生长状况。
光暗交替培养条件：温度 25±1 ℃，光照强
度 3 000 lx左右，光照时数 14 h/d。
暗培养条件：温度 25±1 ℃的暗培养箱。
1.2.2.5 蔗糖浓度对叶片愈伤组织诱导的影响
将叶片接种于蔗糖含量分别为 15、30、60、
100 g/L 的最适培养基上。每处理接种 20瓶，每瓶
3个叶片，重复 3 次。培养条件：温度 25±1 ℃，
光照强度 3 000 lx左右，光照时数 14 h/d。30 d后
统计出愈伤组织的诱导率以及生长状况。
1.2.3 愈伤组织的增殖
1.2.3.1 基本培养基的筛选
将初代培养获得的生长状况良好的愈伤组织
切成 0.5 cm直径的小块，分别接种到添加 0.1 mg/L
6-BA 和 0.5 mg/L NAA 的 MS、WPM、B5 3 种 不
同的基本培养基上。每处理接种 20瓶，每瓶 3块
3第 35卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
愈伤组织，重复 3次。培养条件：温度 25±1 ℃，
光照强度 3 000 lx 左右，光照时数 14 h/d。20 d后
统计愈伤组织的增殖系数、褐化率以及愈伤组织
生长状况。
1.2.3.2 植物生长调节剂的配方
采用三因素三水平正交试验，在最适增殖培
养基上进行愈伤组织的增殖培养，每处理接种 20
瓶，每瓶 3块愈伤组织，重复 3次。正交试验设
计方案同表 1。培养条件：温度 25±1 ℃，光照强
度 3 000 lx 左右，光照时数 14 h/d。20 d后统计愈
伤组织的增殖系数、褐化率以及生长状况。
1.2.3.3 继代周期及继代次数对愈伤组织增殖的影
响
将诱导出的生长状况良好的的愈伤组织接种
于最适增殖培养基上，每隔 10、15、20、25、
30、40 d转接一次。每处理接种 20瓶，每瓶 3块
愈伤组织，重复 3次。统计不同继代周期的增殖
系数及褐化率。在相同的继代周期下，对诱导出
的生长状况良好的愈伤组织连续继代 5次，每处
理接种 20瓶，每瓶 3块愈伤组织，重复 3次。统
计每次继代的增殖系数及褐化率。
培养条件：温度 25±1 ℃，光照强度 3 000 lx
左右，光照时数 14 h/d。
1.2.3.4 暗培养天数对愈伤组织增殖的影响
将诱导出的生长状况良好的的愈伤组织接种
于最适增殖培养基上，暗培养天数分别为 5、10、
15、20 d，每处理接种 20瓶，每瓶 3块愈伤组织，
重复 3次。以光暗交替培养为对照。20 d后统计
出愈伤组织的增殖系数、褐化率以及生长状况。
暗培养条件：温度 25±1 ℃的暗培养箱。光暗交
替培养条件：温度 25±1 ℃，光照强度 3 000 lx左
右，光照时数 14 h/d。
1.2.3.5 蔗糖浓度对愈伤组织增殖的影响
将诱导出的生长状况良好的愈伤组织接种于
蔗糖含量分别为 15、20、25、30、35、40、50 g/L
的最适增殖培养基上。每处理接种 20瓶，每瓶 3
块愈伤组织，重复 3次。培养条件：温度 25±1 ℃，
光照强度 3 000 lx 左右，光照时数 14 h/d。20 d后
统计愈伤组织的增殖系数、褐化率以及生长状况。
1.2.4 褐化的抑制
在组织培养过程中，褐化是个很难克服的问
题，本试验中棱角山矾愈伤组织极其容易发生褐
化。试验通过添加维生素C（VC）、活性炭（AC）、
聚乙烯吡咯烷酮（PVP）来减少愈伤组织褐化现象
的发生。试验设计见表 2。培养条件：温度 25±1 ℃，
光照强度 3 000 lx 左右，光照时数 14 h/d。20 d后
统计愈伤组织的褐化率。
表 2 防褐化的试验设计
Table 2 Test design for prevent browning disease
处理 活性炭/(g·L-1) 处理
维生素 C
/(mg·L-1) 处理
PVP
/(mg·L-1)
1 5 4 50 7 50
2 10 5 100 8 100
3 15 6 200 9 200
1.3 数据统计与分析
污染率（%）=接种外植体污染数 /接种外植
体总数；
死亡率（%）=接种外植体死亡数 /接种外植
体总数；
成活率（%）=接种外植体成活数 /接种外植
体总数；
愈伤组织诱导率 (%)=产生愈伤组织的外植体
数 /成活的外植体数；
增殖系数 =（继代后愈伤组织重量 -继代前愈
伤组织重量）/继代前愈伤组织
重量。
实验数据用Microsoft Excel 2003和 SPSS 13.0
统计软件进行计算和方差分析，在方差分析显著
的基础上，用 Duncan法进行多重比较分析。
2 结果与分析
2.1 外植体的灭菌处理
经方差分析可知，不同时间的 70%酒精灭菌
对叶片成活率的影响差异不显著（P＞ 0.05），而
不同时间的 2% NaClO灭菌对叶片成活率的影响
差异极显著（P＜ 0.01）。
由表 3可以看出，随着 2% NaClO灭菌时间
的延长，叶片的污染率呈下降趋势，灭菌 1 min时
污染率最高，达 63%以上；死亡率呈上升趋势，
灭菌 10 min时全部死亡；3 min灭菌时成活率最高，
达 77%以上。因此，棱角山矾叶片表面灭菌适宜
的方法是：用 70%酒精灭菌 30～ 90 s，无菌水冲
洗 2～ 3次，再用 2% NaClO灭菌 3 min，无菌水
冲洗 3～ 4次。
2.2 愈伤组织的诱导
2.2.1 不同基本培养基对叶片愈伤组织诱导的影响
3种基本培养基对棱角山矾叶片愈伤组织诱导
的影响差异显著（P＜ 0.05）。B5基本培养基对
田如男，等：棱角山矾叶片愈伤组织的诱导及其细胞形态学观察4 第 12期
棱角山矾叶片愈伤组织诱导的效果最好，诱导率
达 84.44%，褐化率仅 4.44%，愈伤组织呈黄绿色、
疏松、颗粒状，长势良好，为棱角山矾叶片愈伤
组织诱导的最适培养基（见表 4、图 1）。
表 3 不同灭菌处理对叶片灭菌效果的影响†
Table 3 Effects of different sterilization treatments on tested leaves
处 理 70%酒精 2%次氯酸钠 污染率 /% 死亡率 /% 成活率 /%
1 30 1 64.44±5.09 c 4.44±5.09 a 31.11±2.89 b
2 30 3 13.89±3.47 b 8.89±1.92 ab 77.22±5.09 e
3 30 5 12.22±3.85 b 25.00±1.67 c 62.78±6.31d
4 30 7 8.89±1.92 b 39.45±4.81d 51.67±4.81c
5 30 10 0.00±0.00 a 100.00±0.00 e 0.00±0.00 a
6 60 1 63.33±6.67 c 2.22±1.92 a 34.44±6.67 b
7 60 3 12.78±2.55 b 7.22±2.55 ab 80.00±0.96 e
8 60 5 11.67±2.89 b 27.78±3.85 c 60.56±2.89 cd
9 60 7 9.44±4.19 b 38.33±7.64 d 52.22±1.92 c
10 60 10 0.00±0.00 a 100.00±0.00 e 0.00±0.00 a
11 90 1 65.00±9.28 c 6.11±3.47 ab 28.89±1.92 b
12 90 3 11.11±1.92 b 12.22±1.92 b 76.67±3.33 e
13 90 5 13.33±3.33 b 29.44±5.85 c 57.22±2.55 cd
14 90 7 7.22±2.55 b 36.67±5.77 d 56.11±2.55 cd
15 90 10 0.00±0.00 a 100.00±0.00 e 0.00±0.00 a
† 数据为平均值±标准差；同列不同小写字母之间表示差异显著(P＜0.05)，相同字母之间表示差异不显著(P＞0.05)。下同。
表 4 不同基本培养基对叶片愈伤诱导的影响†
Table 4 Effects of different basic media on callus induction of tested leaves
培养基 诱导率 / % 褐化率 /% 生长状况 生长势
MS 31.98±2.16 c 10.48±0.83 b 白色、疏松、颗粒状 ++
B5 84.44±2.07 a 4.44±1.20 c 黄绿色、疏松、颗粒状 +++
WPM 63.41±1.19 b 26.59±2.08 a 白色、疏松、块状 +
† +长势差； ++长势一般；+++长势良好；++++长势旺盛。下同。
图 1 不同基本培养基对叶片愈伤诱导的影响
Fig.1 Effects of different basic media on callus induction of tested leaves
2.2.2 不同配方植物生长调节剂对叶片愈伤组织
诱导的影响
由方差分析可知，6-BA质量浓度对棱角山
矾叶片愈伤组织诱导率的影响差异不显著（P＞
0.05），2,4-D质量浓度影响显著（P＜ 0.05），
NAA浓度影响极显著（P＜ 0.01）。多重比较（见
表 5）显示，低质量浓度的 2,4-D诱导棱角山矾叶
片愈伤组织的效果较好，水平 1、2之间差异不显
著；NAA质量对愈伤组织诱导的影响较 2,4-D大，
随着 NAA浓度的升高愈伤组织的诱导率呈上升的
变化趋势，水平 3（即 1.0 mg/L）的愈伤组织诱导
率最高，达到 90.86%。
表 5 2,4-D、NAA对愈伤组织诱导影响的多重比较
Table 5 Multiple comparisons of 2,4-D and NAA to callus
induction
水平 2,4-D NAA
1 84.23±8.97 a 75.86±1.56 a
2 83.55±6.91 a 81.89±1.84 b
3 80.82±6.80 b 90.86±2.75 c
表 6显示，7号、5号处理愈伤组织的诱导率
5第 35卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
最高，分别为 93.48%、91.11%；但在 7号处理中
愈伤组织较致密，且生长慢，易褐化，而 5号处
理中愈伤组织呈黄色、疏松、颗粒状，且长势旺盛。
综合愈伤组织的诱导率、生长状况、方差分
析及多重比较分析结果，得出棱角山矾叶片愈伤
组织诱导的最佳植物生长调节剂配方为 5号处理，
即：0.5 mg/L 6-BA、0.3 mg/L 2,4-D 和 1.0 mg/L
NAA。
表 6 6-BA、2,4-D和NAA对愈伤组织诱导的影响
Table 6 Effects of 6-BA, 2,4-D and NAA on callus induction
处理
生长调节剂 /(mg·L-1)
诱导率 /% 生长状况 生长势
6-BA 2,4-D NAA
1 0.1 0.1 0.1 75.56±2.22 ab 黄色、疏松、颗粒 ++
2 0.1 0.3 0.5 82.00±2.00 cd 黄色、疏松、颗粒 +++
3 0.1 0.5 1.0 88.00±0.00 ef 黄色、疏松、颗粒 ++++
4 0.5 0.1 0.5 83.67±2.04 de 黄色、疏松、颗粒 +++
5 0.5 0.3 1.0 91.11±3.85 fg 黄色、疏松、颗粒 ++++
6 0.5 0.5 0.1 74.47±4.26 a 黄色、疏松、颗粒 ++
7 1.0 0.1 1.0 93.48±2.17 g 黄色、致密、颗粒 ++
8 1.0 0.3 0.1 77.55±2.04 abc 黄色、致密、颗粒 +++
9 1.0 0.5 0.5 80.00±2.00 bcd 黄色、致密、颗粒 +++
2.2.3 接种部位及接种方向对叶片愈伤组织诱导
的影响
同一叶片的不同部位诱导愈伤组织的能力不
同，叶基和叶中诱导愈伤组织的能力较叶尖强，
诱导率达 86%以上。从愈伤组织生长状况和生长
势来看，叶基和叶中形成的愈伤组织呈淡黄色、
疏松、颗粒状，长势旺盛，而叶尖形成的愈伤组
织多呈淡褐色，较致密，生长势差（见表 7）。因
此叶基和叶中是棱角山矾叶片愈伤组织诱导的最
佳部位。
表 7 接种部位对愈伤组织诱导的影响
Table 7 Effects of inoculation parts on callus induction rate
接种部位 诱导率 /% 愈伤组织生长状况 生长势
叶尖 60.61±4.01 b 淡褐色、致密、颗粒状 +
叶中 86.89±1.64 a 淡黄色、疏松、颗粒状 ++++
叶基 89.74±2.56 a 淡黄色、疏松、颗粒状 ++++
叶片接种方向对愈伤组织的诱导也有着很大
的影响。在相同的培养基和培养条件下，远轴面
向上接种的叶片诱导率在 88%以上，而近轴面向
上接种的叶片，诱导率仅为 30%左右。因此接种
叶片时均选择远轴面向上的接种方式。
2.2.4 光照和黑暗对叶片愈伤组织诱导的影响
根据上述实验结果，将叶片接种于愈伤组
织诱导的最适培养基（添加 0.5 mg/L 6-BA、0.3
mg/L 2,4-D、1.0 mg/L NAA的 B5培养基）上，分
别进行光暗交替培养和暗培养。光暗交替培养和
暗培养对棱角山矾叶片愈伤组织诱导的影响极显
著（P＜ 0.01），光暗交替培养更有利于棱角山矾
叶片愈伤组织的诱导，暗培养抑制了愈伤组织的
诱导（见表 8）。
表 8 光暗交替培养和暗培养对叶片愈伤组织诱导的影响
Table 8 Effects of light and dark on callus induction rate
处 理 诱导率 /% 愈伤组织生长状况 生长势
光暗交替 89.47±4.56 a 黄绿色、疏松、颗粒状 ++++
黑 暗 14.29±2.86 b 黄褐色、致密、块状 +
2.2.5 蔗糖浓度对叶片愈伤组织诱导的影响
不同浓度的蔗糖对叶片愈伤组织诱导的影响
极显著，随着蔗糖浓度的升高，愈伤组织诱导率
呈先上升后下降的变化趋势，高浓度的蔗糖对叶
片愈伤组织的诱导有抑制作用。诱导棱角山矾叶
片愈伤组织最佳的蔗糖浓度为 30 g/L（见表 9）。
表 9 蔗糖浓度对愈伤组织诱导的影响
Table 9 Effects of sucrose concentration on callus
induction rate
蔗糖质量浓度
/(g·L-1) 诱导率 /% 愈伤组织生长状况 生长势
15 54.76±4.76 c 淡黄色、疏松、颗粒状 ++
30 88.89±3.85 d 淡黄色、疏松、颗粒状 ++++
60 35.90±2.56 b 淡黄色、疏松、颗粒状 +
100 25.00±2.50 a 淡黄色、疏松、颗粒状 +
2.3 愈伤组织的增殖
2.3.1 不同基本培养基对愈伤组织增殖的影响
由表 10可以看出，MS基本培养基为棱角山
矾愈伤组织增殖的最适培养基，其愈伤组织增殖
系数最高，达到 0.89，显著高于 B5和WPM培养
田如男，等：棱角山矾叶片愈伤组织的诱导及其细胞形态学观察6 第 12期
基，且愈伤组织褐化率明显低于 B5培养基，为
15.00%，愈伤组织多呈黄绿色、疏松、颗粒状，
生长状况良好，长势最快。
表 10 基本培养基对愈伤组织增殖的影响
Table 10 Effects of different basic media on callus
proliferation
培养基 增殖系数 褐化率 /% 愈伤组织生长状况
MS 0.89±2.34 c 15.00±4.33 a 黄色、疏松、颗粒状
B5 0.53±0.87 b 40.00±2.50 b 黄褐色、疏松、颗粒状
WPM 0.34±1.06 a 22.50±5.00 a 黄褐色、疏松、块状
2.3.2 不同配方植物生长调节剂对叶片愈伤组织
增殖的影响
由方差分析可知，6-BA质量浓度对棱角山矾
叶片愈伤组织增殖系数的影响差异不显著（P＞
0.05），2,4-D质量浓度影响显著（P＜ 0.05），
NAA质量浓度影响极显著（P＜ 0.01）；而 6-BA
质量浓度对棱角山矾叶片愈伤组织褐变率的影响显
著（P＜ 0.05），2,4-D质量浓度影响极显著（P＜
0.01），NAA浓度影响不显著（P＞ 0.05）。结合
增殖系数和褐变率，1、2水平的 6-BA、1水平的
2,4-D和 2水平的 NAA对棱枝山矾叶片愈伤组织的
增殖效果最好（见表 11）。结合表 12，对棱枝山
矾叶片愈伤组织增殖效果最佳的植物生长调节剂组
合为 4号处理，即 0.5 mg/L 6-BA、0.1 mg/L 2,4-D、
0.5 mg/L NAA。
表 11 植物生长调剂对愈伤组织增殖影响的多重比较
Table 11 Multiple comparisons of growth regulator of
different levels to callus proliferation
水平
增殖系数 褐变率 /%
2,4-D NAA 6-BA 2,4-D
1 0.98±0.13 a 0.88±0.05 a 15.55±3.53 a 13.73±1.76 a
2 0.99±0.06 a 1.07±0.05 c 17.03±3.23 a 17.26±1.89 b
3 0.95±0.09 b 0.98±0.01 b 19.87±4.94 b 21.45±3.21 c
表 12 6-BA、2,4-D和NAA对愈伤组织增殖的影响
Table 12 Effects of 6-BA, 2,4-D and NAA on callus
proliferation
处理 生长调节剂 /(mg·L
-1) 增殖系数 褐变率/%6-BA 2,4-D NAA
1 0.1 0.1 0.1 0.86±0.01a 11.76±2.94 a
2 0.1 0.3 0.5 1.06±0.02 d 16.13±3.23 abc
3 0.1 0.5 1.0 0.99±0.03 bc 18.75±3.13 bc
4 0.5 0.1 0.5 1.12±0.02 e 14.29±2.86 ab
5 0.5 0.3 1.0 0.98±0.08 bc 16.22±2.70 abc
6 0.5 0.5 0.1 0.84±0.02 a 20.59±0.00 cd
7 1.0 0.1 1.0 0.97±0.01 bc 15.15±3.03 ab
8 1.0 0.3 0.1 0.94±0.01 b 19.44±2.78 bc
9 1.0 0.5 0.5 1.02±0.02 cd 25.00±3.13 d
2.3.3 继代周期及继代次数对愈伤组织增殖的影响
2.3.3.1 继代周期对愈伤组织增殖的影响
试验将生长良好的棱角山矾叶片愈伤组织每
隔不同的天数接种到前期实验筛选出的最佳增殖培
养基（MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L
NAA）上，以此研究适合棱角山矾叶片愈伤组织
增殖的最佳继代周期。由表 13可以看出，随着继
代周期的延长，愈伤组织的增殖系数呈先增大后
减小的变化趋势，而褐变率呈不断上升的变化趋
势。继代周期为 20 d时对愈伤组织的增殖最有利，
此时愈伤组织的增殖生长达到最佳状态，与其它
继代周期形成显著差异（P＜ 0.05）。
表 13 继代周期对愈伤组织增殖的影响
Table 13 Effects of numbers of days of subculture cycle on
callus proliferation
继代周期 /d 增殖系数 褐变率 /%
10 0.42±0.02 a 5.00±0.00 a
15 0.73±0.02 b 7.50±2.50 a
20 1.14±0.08 e 12.50±2.50 ab
25 0.95±0.03 d 17.50±5.00 bc
30 0.86±0.0 c 25.00±7.50 c
40 0.78±0.02 b 35.00±6.61 d
2.3.3.2 继代次数对愈伤组织增殖的影响
本试验每一次继代增殖都采用相同的继代培
养基MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D+ 0.5 mg/L
NAA，以研究继代次数对棱角山矾叶片愈伤组织
增殖的影响。由表 14可以看出，继代 1次、2次、
3次的愈伤组织增殖系数之间差异不显著（P＞
0.05），从第 4次继代开始，增殖系数显著下降。
愈伤组织的褐化率随继代次数增加呈缓慢上升的
变化趋势。在继代过程中，愈伤组织本身的生长
状态没有变化，均表现为黄色、疏松、颗粒状（见
图 2）。因此，较好的继代次数为 1～ 3次，不宜
继代过多。
表 14 继代次数对愈伤组织增殖的影响
Table 14 Effects of subculture times on callus proliferation
继代次数 增殖系数 褐变率 /%
1 1.10±0.03 c 10.00±2.00 a
2 1.13±0.03 c 14.00±4.00 ab
3 1.11±0.03 c 16.00±2.00 bc
4 0.97±0.02 b 20.00±4.00 cd
5 0.92±0.03 a 24.00±2.00 d
2.3.4 暗培养天数对愈伤组织增殖的影响
由表 15可以看出，对照（光暗交替培养下）
愈伤组织的增殖系数最低，褐变率最高。随着暗
7第 35卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
培养天数的增加，愈伤组织的增殖系数呈上升趋
势，褐化率呈下降趋势，暗培养促进了棱角山矾
愈伤组织的增殖。
表 15 暗培养天数对愈伤组织增殖的影响
Table 15 Effects of numbers of dark culture days on
callus proliferation
时间 /d 增殖系数 褐变率 /%
CK（光暗交替） 0.68±0.02 a 35.00±6.61 b
5 0.77±0.03 b 30.00±5.00 b
10 0.94±0.03 c 27.50±2.50 b
15 1.00±0.05 c 17.50±5.00 a
20 1.08±0.04 d 15.00±2.50 a
2.3.5 蔗糖质量浓度对愈伤组织增殖的影响
蔗糖质量浓度对愈伤组织褐化率的影响不显
著（P＞ 0.05），但对愈伤组织增殖系数有显著影
响（P＜ 0.05）。随着蔗糖质量浓度的增加，愈伤
组织的增殖系数呈先上升后下降的趋势，棱角山
矾愈伤组织增殖最适宜的蔗糖质量浓度为 30 g/L，
浓度过高或过低均会导致愈伤组织的增殖系数下
降（见表 16）。
表 16 蔗糖质量浓度对愈伤组织增殖的影响
Table 16 Effects of sucrose concentrations on callus
proliferation
蔗糖浓度 /(g·L－ 1) 增殖系数 褐变率 /%
15 0.78±0.04 a 17.50±2.50 a
20 0.88±0.03 b 18.33±1.44 a
25 0.90±0.02 b 16.67±3.82 a
30 1.07±0.03 d 15.83±1.44 a
35 0.99±0.04 c 16.67±3.82 a
40 0.81±0.01 a 18.33±2.89 a
50 0.77±0.03 a 17.50±2.50 a
2.4 不同抗褐化剂对褐化的抑制
由表 17可以看出，添加 AC的培养基中愈伤
组织的褐化率显著低于对照和其他处理，对愈伤
组织的褐化具有较好的抑制作用。但 AC在吸附有
毒物质的同时，也会吸附培养基中的激素和营养
物质，鉴于不同含量活性炭之间差异不显著，因
此认为 5 g/L AC为最佳添加量。添加 VC和 PVP
的培养基中愈伤组织的褐化率较大，与对照差异
不显著（P＞ 0.05），抑制褐化效果较差。
表 17 不同抗褐化剂对褐化的抑制作用
Table 17 Inhibition effects of different anti browning
agents on browning disease
处理 活性炭/(g·L-1)
维生素 C
/(mg·L-1)
PVP
/(mg·L-1) 褐化率 /%
1 0 0 0 15.91±4.55 d
2 5 10.00±2.00 abc
3 10 8.00±2.00 ab
4 15 7.50±2.50 a
5 50 16.28±2.33 d
6 100 13.16±2.63 bcd
7 200 15.00±2.50 cd
8 50 16.67±2.38 d
9 100 14.63±2.44 cd
10 200 15.56±4.44 d
2.5 愈伤组织的细胞形态学观察
从外部形态上看，棱角山矾两种不同类型的
愈伤组织在形态、质地和颜色上有明显的区别，
胚性愈伤组织质地疏松、黄绿色，呈颗粒状。非
胚性愈伤组织质地致密、浅黄色或白色，呈水渍
状（见图 3）。在扫描电镜（SEM-500Philips）下
观察发现，胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织的表
面结构存在较大的差异。胚性愈伤组织表面细胞
饱满，呈规则的颗粒状突起或皱褶结构，细胞大
小近乎相等，容易形成多细胞团，组成细胞团的
细胞之间结合紧密，而细胞团与细胞团之间结合
疏松，中间具有一定的空隙，细胞表面有少量附
着物。非胚性愈伤组织表面结构疏松，呈不规则
球形排列，每个细胞表面有少量附着物，大都以
单个细胞存在（见图 4）。
在透射电镜（HITACHI 7650）下观察发现，
图 2 继代次数对愈伤组织增殖的影响
Fig.2 Effects of subculture times on callus proliferation
田如男，等：棱角山矾叶片愈伤组织的诱导及其细胞形态学观察8 第 12期
胚性细胞中央大液泡开始解体，细胞质浓厚，细
胞质中含有大量线粒体、内质网、质体，质体中
含有体积较大的淀粉粒。非胚性细胞中液泡大，
几乎占据整个细胞，液泡中含有少量的高电子质
密的嗜鹅物质（脂蛋白类物质），细胞器很少，
只有少量的质体、线粒体以及细胞核紧贴细胞壁
排列（见图 5）。
S:淀粉粒 ER:内质网 Mi:线粒体 CW:细胞壁 PL:质体 V:液泡 N:细胞核
图 5 胚性（左，Bear=2.0 μm）、非胚性（右，
Bear=5.0 μm）愈伤组织（透射电镜）
Fig.5 Embryonic callus (left, Bear=2.0 μm) and non-
embryonic callus (right, Bear=5.0 μm)
(transmission electron microscope)
图 4 胚性（左）、非胚性（右）愈伤组织（扫描电镜）
Fig.4 Embryonic callus (left) and non-embryonic callus
(right) ( scanning electron microscope)
灭菌 30～ 90 s、无菌水冲洗 2～ 3次，再用 2%
NaClO灭菌 3 min、无菌水冲洗 3～ 4次，棱角山
矾叶片成活率最高，达 77%以上。
离体培养的成功与培养基的类型有很大的关
系。不同基本培养基中的无机离子、有机营养物
质含量各异，因而外植体对培养基的反应也就不
同。本试验选用含较高浓度硝酸盐和 NH4+的MS
培养基、较低浓度硝酸盐和 NH4+的WPM培养基
以及较高浓度硝酸盐和较低浓度 NH4+的 B5培养
基进行叶片愈伤组织诱导和增殖，结果得出 B5基
本培养基为棱角山矾叶片愈伤组织诱导的最适培
养基，而MS基本培养基为棱角山矾愈伤组织增
殖的最适培养基。可见不同培养阶段对外界离子
的需求不同，棱角山矾愈伤组织增殖培养阶段对
NH4
+的需求显著增加。
植物生长调节剂的种类、质量浓度及配比是
植物愈伤组织诱导成功与否的关键因子。生长调
节剂中的细胞分裂素与生长素配比是诱导器官发
生的关键因素 [6-7]。NAA和 2,4-D是愈伤组织诱导
中最常用的两种生长素，6-BA是愈伤组织诱导中
最常用的细胞分裂素 [8]。本试验结果显示，培养
基中同时添加 6-BA、2,4-D、NAA有利于棱角山
矾愈伤组织的诱导与增殖。6-BA质量浓度大小对
棱角山矾叶片愈伤组织诱导率和增殖系数的影响
不显著（P＞ 0.05），但高质量浓度的 6-BA促使
愈伤组织褐变，且使愈伤组织紧密；高质量浓度
的 NAA有利于棱角山矾叶片愈伤组织的诱导，但
Lin et al.（2010）[9]认为高质量浓度的 NAA抑制
楸树愈伤组织的诱导，且使组织褐化；低质量浓
度的 2,4-D对棱角山矾叶片愈伤组织的诱导和增殖
效果较好，高质量浓度的 2,4-D会引起组织的褐化。
对木本植物愈伤组织增殖研究中发现，采用比愈
伤诱导阶段更低的生长素质量浓度更有利于愈伤
组织的增殖 [10-11]。本试验也得到相同结果，棱角
山矾叶片愈伤组织诱导的最适培养基为 B5+0.5 mg/
L 6-BA+0.3 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L NAA，增殖培养
时降低生长素质量浓度有利于愈伤组织的增殖，
其最适增殖培养基为 MS+0.5 mg/L 6-BA+ 0.1
mg/L 2,4-D+0.5 mg/L NAA。
在组织培养中 , 光影响植物愈伤组织的生长发
育和生理变化，不同的光因子对不同植物愈伤组
织的生长有不同的效应 [12-14]。本试验中光暗交替
培养时棱角山矾叶片愈伤组织的诱导率高，质地
疏松，长势好，与时颂等（2013）[15]对 6个切花
菊品种在不同光照下愈伤组织诱导的结果一致；
暗培养抑制棱角山矾愈伤组织的诱导，但能促进
图 3 胚性（左）、非胚性（右）愈伤组织
Fig.3 Embryonic callus (left) and non-embryonic callus
(right)
3 结论与讨论
外植体的表面灭菌是植物离体培养的第一个
步骤，消毒方法的选择在离体培养中至关重要，
应最大限度地杀灭外植体所带的真菌和细菌，而
对外植体伤害最小。本试验选用对植物伤害较小
的 NaClO作为消毒剂。结果表明，用 70%酒精
9第 35卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
愈伤组织的增殖。目前有关暗培养促进愈伤组织
增殖的机理尚不明确，本试验结果显示，暗培养
促进愈伤组织增殖的原因之一可能是暗培养减轻
了愈伤组织的褐化率。
褐化现象在植物组织培养过程中普遍存在，
而褐化能否得到有效控制是植物组织培养能否成
功的关键所在。褐化现象产生原因很多，因植物
种类、外植体取材季节、生长部位、生理状态以
及消毒方式、培养基配方及培养条件等不同而不
同。木本植物一般比草本植物更容易发生褐化。
本试验研究表明，添加 AC的培养基对棱角山矾叶
片愈伤组织的褐化具有较好的抑制作用，褐化率
显著低于添加 VC和 PVP的培养基，与杜敬然等
（2010）[16]研究结果一致。考虑到 AC会吸附培
养基中的生长调节物质，对外植体的生长带来竞
争性抑制。因此，应结合具体情况适当提高生长
调节剂的质量浓度。
棱角山矾的胚性愈伤组织中含有大量的线粒
体，中央大液泡开始解体，可见此时胚性细胞处
于代谢活跃的状态。同时在质体中含有体积较大
的淀粉粒，能为胚性细胞的分化、发育提供能量
和营养。棱角山矾胚性愈伤组织中的线粒体、小
液泡、淀粉粒、内质网等为胚性细胞的进一步分
化和发育奠定了物质基础。
本研究以棱角山矾的叶作为外植体，进行愈
伤组织的诱导和增殖研究，可为棱角山矾苗木优
良无性快繁体系的建立提供前期基础。
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[本文编校：文凤鸣 ]