全 文 ：果 树 学 报 2008,25(5):655～660
JournalofFruitScience
23个石榴基因型遗传多样性的SRAP分析
张四普 1,2,汪良驹 1*,曹尚银 3,刘 涛 4
(1南京农业大学园艺学院,南京 210095;2河南省农业科学院园艺研究所,郑州 450002;
3中国农业科学院郑州果树研究所,郑州 450009;4徐州市贾汪区水利局,江苏徐州 221011)
摘 要:以 23个石榴基因型为试材,利用 7对 SRAP引物进行 PCR扩增,共扩增出 1380个条带,其中多态性条带
662个,多态率为48%。应用DPS分析软件构建UPGMA聚类图,23个基因型遗传距离在0.0769～0.4131。在遗传距
离 0.33处,可将石榴基因型分为 A、B、C、D和 E5个类群。4种单瓣白花基因型都聚类在 A组;B组都是单瓣红花、
味甜的鲜食品种;C组中鲜食品种果皮都不着色;4种不同花色或叶型的单瓣、赏食兼用基因型则聚在 D组;观赏型
墨石榴与其它基因型显著不同,单独聚为一类(E组)。引物对组合 ME4/EM4-800bp缺失条带是青皮石榴的特异缺
失标记,ME4/EM4-480bp缺失条带是峄城红和河阴软籽石榴的特异缺失标记,ME2/EM3-120bp缺失条带是峄城
红、白皮酸和大青皮的特异缺失标记。研究结果表明,石榴基因型有着丰富的遗传多样性,SRAP技术可有效运用于
石榴基因型的遗传分析。
关键词:石榴;SRAP;遗传多样性
中图分类号:S665.4 文献标识码:A 文章编号:1009-9980(2008)05-655-06
Analysisofgeneticdiversityof23pomegranategenotypesbySRAP
ZHANGSi-pu1,2,WANGLiang-ju1*,CAOShang-yin3,LIUTao4
(1ColegeofHorticulture,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing,Jiangsu210095China;2HenanHorticulturalResarchInstitute,
Zhengzhou,Henan45002China;3ZhengzhouFruitResearchInstitute,CAAS,Zhengzhou,Henan450009China;4JiawangDistrictHydro-
logicalBureau,Xuzhou,Jiangsu221011China)
Abstract:SRAP (SequenceRelatedAmplifiedPolymorphism)wasappliedtoanalyze23pomegranategenotypes(Punica
spp.)byusing7pairsofprimers.About1380bandswereamplified,ofwhich662werepolymorphic,andthepolymorphic
percentageofbandswas48%.Adendrogram,conductedbyUPGMAmethodusingDPSsoftware,showedthattherangeof
geneticdistanceamong23pomegranategenotypeswas0.0769～0.4131.Thegenotypescouldbedividedintofivesub-clus-
ters(A,B,C,DandE)atthegeneticdistanceof0.33.Fourwhitesingle-petalflowertypesarealclusteredintogroupA,
whilethegenotypesarealsingle-petalflowerandsweetfleshcultivarsingroupB.ThepeelofcultivarsingroupCwasal
non-red,andfourornamentalandfleshtypesofsingle-petalflowerwithdiferentfloralcolorandleafshapeswereclustered
intogroupD.Oneornamentaltype,P.granatumvar.nigra,wassignificantlydiferentfromothertypesandwasclusteredinto
groupE.GenotypeQingpicouldbedistinguishedfromaltherestbasedonlyonthelackofME4/EM4-800bpfragment,and
YichenghongandHeyinruanzionthelackofME4/EM4-480bpfragment.Yichenghong,BaipisuanandDaqingpicouldbei-
dentifiedbythelackofME2/EM3-120bpfragment.Theseresultsindicatedthattherewasplentifulgeneticdiversityamong
pomegranategenotypesandSRAPcouldbeefectivelyappliedtoanalyzegeneticdiversityamongpomegranategenotypes.
Keywords:Pomegranate;SRAP;Geneticdiversity
石榴 (PunicagranatumL.)为石榴科石榴属植
物,最早由西汉时期张骞出使西域时带回我国[1]。目
前,在全国各地有广泛分布。由于它抗性强、耐瘠薄,
可以种植于土层较浅的丘陵山地,也可应用于管理
粗放的城乡绿化[2]。然而,由于栽培时间长,栽植区域
广,石榴基因型之间同名异物,同物异名的现象相当
普遍[3]。只有阐明石榴基因型之间的亲缘关系,才能
为遗传育种及标准化栽培提供可靠依据。常规的形
态学研究是石榴分类的生物学基础,但是许多石榴
品种很难用形态指标来区分。因而可以考虑开发应
用分子标记技术,以便为我们提供可信的信息[4]。
SRAP (SequenceRelatedAmplifiedPolymor-
收稿日期:2008-03-31 接受日期:2008-06-30
作者简介:张四普,男,在读博士生。Tel:025-84395265,E-mail:2006204002@njau.edu.cn
?通讯作者。Authorforcorespondence.Tel:025-84395265,E-mail:wlj@njau.edu.cn
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2008.05.009
果 树 学 报 25卷
编号
No.
名称
Name
产地
Producingregion
主要形态特征
Mainmorphologicalcharacteristics
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
开封四季红
Kaifengsijihong
会理红皮
Huilihongpi
豫3号
YuNo.3
大红甜
Dahongtian
峄城红
Yichenghong
白皮酸
Baipisuan
鲁峪酸
Luyusuan
泰山红
Taishanhong
河阴软籽
Heyinruanzi
白皮红
Baipihong
三白
Sanbai
大青皮酸
Daqingpisuan
墨石榴
P.granatumvar.nigra
大马芽
Damaya
青皮
Qingpi
蒙阳红
Mengyanghong
大青皮
Daqingpi
小青皮
Xiaoqingpi
重瓣红白缘
Chongbanhongbaiyuan
单瓣粉红
Danbanfenhong
单瓣红白缘
Danbanhongbaiyuan
小叶单瓣红
Xiaoyedanbanhong
单瓣红
Danbaihong
河南开封
Kaifeng,Henan
四川会理
Huili,Sichuan
河南开封
Kaifeng,Henan
陕西临潼
Lintong,Shaanxi
山东枣庄
Zaozhuang,Shandong
云南蒙自
Mengzi,Yunnan
山东枣庄
Zaozhuang,Shandong
山东泰安
Tai’an,Shandong
河南荥阳
Xingyang,Henan
云南巧家
Qiaojia,Yunnan
江苏徐州
Xuzhou,Jiangsu
江苏徐州
Xuzhou,Jiangsu
江苏徐州
Xuzhou,Jiangsu
江苏徐州
Xuzhou,Jiangsu
陕西临潼
Lintong,Shaanxi
山东泰安
Tai’an,Shandong
山东枣庄
Zaozhuang,Shandong
江苏徐州
Xuzhou,Jiangsu
江苏南京
Nanjing,Jiangsu
江苏南京
Nanjing,Jiangsu
江苏南京
Nanjing,Jiangsu
江苏南京
Nanjing,Jiangsu
江苏南京
Nanjng,Jiangsu
花朵红色,果皮红色,子粒鲜红色
Redflowerandaril,brightredgrains
花红色,果皮黄白色,阳面红,子粒红色
Redflower,yelow-whitearilandredinsunnyside,redgrains
花朵红色,果皮红色,果味酸甜,子粒紫红色
Redflowerandaril,sweet-sourtaste,purplishandredgrains
花朵红色,果阳面浓红,果味甜,子粒鲜红
Redflower,darklyredarilinsunnyside,sweettasteandredgrains
花朵红色,果皮红
Redflowerandpeel
花朵白色,果味酸
Whiteflowerandsourtaste
花朵红色,果皮红色,果味酸,子粒粉红
Redflowerandaril,sourtasteandpinkgrains
花朵红色,果皮红,果味甜微酸,子红
Redflowerandaril,sweet-sourtasteandredgrains
花朵红色,果皮青黄,阳面红,味甜
Redflower,cyan-yelowpeel,redinsunnysideandsweettaste
花朵白色,果面黄白色,果味甜,子粒红色
Whiteflower,yelow-whitearil,sweettasteandredgrains
花朵白色,果面黄白色,果味甜,子粒白色
Whiteflower,yelow-whitearil,sweettaste,andwhitegrains
花朵红色,果面青绿,果味酸,子粒粉红
Redflower,cyan-greenaril,sourtaste,andpinkgrains
观赏小石榴,花朵红色,果面、子粒紫红
Ornamentaldraft,redflower,purplishredarilandgrains
花朵红色,果面青绿,果味甜,子粒粉红色
Redflower,cyan-greenaril,sweettaste,andpinkgrains
花朵红色,果面青绿,果味甜,子粒粉红色
Redflower,cyan-greenaril,andpinkgrains
花朵红色,果面鲜红,果味甜,子粒粉红色
Redflower,brightredaril,sweettaste,andpinkgrains
花朵红色,果面青绿,阳面红色,果味甜,子粒红
Redflower,cyan-greenaril,redinsunnyside,sweettaste,redgrains
花朵红色,果面青绿,果味甜
Redflower,cyan-greenaril,andsweettaste
重瓣花,红色,边缘白色,果实小
Reddouble-petals-flowerwithwhitemargin,andsmalfruits
单瓣花,粉红色,果实小
Pinksingle-petal-flower,andsmalfruits
单瓣花,红色,边缘白色,果实小
Redsingle-petal-flowerwithwhitemargin,andsmalfruits
单瓣花,红色,叶片较小,果实小
Redsingle-petal-flower,smalleaves,andsmalfruits
单瓣花,红色,果实小
Redsingle-petal-flower,andsmalfruits
表1 不同石榴基因型主要形态特征
Table1Mainmorphologicalcharacteristicsofpomegranategenotypes
phism)是 2001年首先由 Li等[5]报道的新的分子标
记技术,分别由独特设计的17和18个碱基组成的
上、下游引物优先对基因组 DNA开放阅读框、内含
子和启动子区域进行特异扩增,因不同基因型启动
子、内含子和间隔序列长度不同而产生多态性。其扩
增多态性高,所能提供的生物学信息更多,目前已在
野牛草[6]、甜菜[7]、牡丹[8]等植物上得到应用。我们以
23份石榴种质资源为材料,利用 SRAP分子标记技
术研究了石榴资源的遗传多样性,并对其进行了
SRAP分类。
1 材料和方法
1.1 材料
试材取自中国农业科学院郑州果树研究所石榴
资源圃和江苏省徐州市贾汪区大洞山石榴园。2007
年4月采集各个品种幼嫩叶片,冰盒保存后液氮速
冻,保存于-80℃冰箱中备用。23个石榴基因型主要
生物学性状见表1。
1.2 方法
1.2.1 DNA的提取 石榴叶片DNA的提取采取改
656
5期 张四普等:23个石榴基因型遗传多样性的SRAP分析
表2 引物组合、序列和扩增结果
Table2Primercombinations,sequencesandamplifiedresults
引物组合
Primercombination
引物序列
Primersequence
扩增位点数
Totalbands
多态性位点数
Polymorphicbands
多态性位点百分率
Percentageofpolymorphicloci(%)
ME1/EM1
ME1/EM3
ME2/EM3
ME3/EM1
ME4/EM4
ME5/EM5
ME5/EM3
总计Total
5-TGAGTCCAAACCGGATA-3
5-GACTGCGTACGAATTTGC-3
5-TGAGTCCAAACCGGATA-3
5-GACTGCGTACGAATTAGC-3
5-TGAGTCCAAACCGGAGC-3
5-GACTGCGTACGAATTAGC-3
5-TGAGTCCAAACCGGACC-3
5-GACTGCGTACGAATTTGC-3
5-TGAGTCCAAACCGGTAG-3
5-GACTGCGTACGAATTCGA-3
5-TGAGTCCAAACCGGTGT-3
5-GACTGCGTACGAATTCCA-3
5-TGAGTCCAAACCGGTGT-3
5-GACTGCGTACGAATTAGC-3
159
186
270
187
168
214
196
1380
73
97
113
101
92
98
88
662
46
52
42
54
55
46
45
48
良 CTAB法[9]。经核酸蛋白分析仪分析纯度和得率
后,用0.8%琼脂糖电泳检测其质量。
1.2.2 引物的筛选 选取已公布的SRAP上、下游
引物各5条,组成 25条引物组合,由上海赛百胜生
物有限公司合成。筛选出扩增多态性好、条带清晰的
引物对在Bio-radGeneCyclerPCR仪上进行扩增。
1.2.3 SRAP扩增 SRAP扩增总体系为 25μL,
20ngDNA,0.2mmol/LdNTP,2mmol/LMg2+,0.4
μmol/Lprimer,1UTaq酶。扩增程序是 94℃变性
5min;94℃1min,35℃1min,72℃1min,共 5个
循环;94℃1min,50℃1min,72℃1min,共 30
个循环;最后72℃延伸5min。取10μL的扩增产
物,2%琼脂糖电泳,电压为4V/cm,EB染色后在紫
外分析仪上检测并拍照记录。
1.3 统计分析
选取同一引物在相同基因位点扩增重复性强和
清晰的条带,根据条带的有无分别记做“0”和“1”。不
同引物扩增的结果构成原始的“0,1”二元数据矩阵,
用DPS分析软件计算石榴各基因型之间的Nei’s的
遗传距离,用UPGMA程序构建聚类图。
2 结果与分析
2.1 遗传多样性分析
从25对引物组合中筛选出7对扩增带清晰,重
复性好的引物组合进行PCR扩增,扩增产物分子量
在100～2000bp。引物组合ME4/EM4共扩增出168
个基因位点,其中多态性位点 92,多态位点比率为
55%。引物组合 ME2/EM3共扩增出基因位点 270
个,其中多态性位点 113个,多态位点比率为 42%
(表2)。
2.2 石榴基因型特异性SRAP标记
在23个石榴基因型中,15号青皮石榴在 ME4/
EM4引物对扩增时缺失一条800bp左右扩增带,可
以作为青皮石榴品种鉴定的特异标记。而5号峄城
红和 9号河阴软籽石榴约在 120bp处共同缺失一
条扩增带,其余品种均无缺失(图1中箭头处)。5号
峄城红、6号白皮酸、17号大青皮在 ME2/EM3引物
对扩增中均缺失480bp扩增条带,而其余品种均无
此缺失(图2中箭头处)。这些特异标记可以作为石
榴品种鉴定和形态学分类的重要依据。
2.3 基因型间的亲缘关系
应用DPS软件,根据“0、1”数据矩阵,计算的遗
图1 引物对组合ME4/EM4扩增条带
M.DL2000mark;1-23.对应品种见表1。下同。
Fig.1SRAPamplifiedbandpaternsofcombinationofME4/EM4
M.DL2000marks;Lane1-23.NameofcultivarthesameasinTable1.Thesamebelow.
bp
2000
1000
750
500
250
100
657
果 树 学 报 25卷
图3 23个石榴基因型的UPGMA聚类图
Fig.3Dendrogramof23genotypesbyUPGMAmethod
bp
2000
1000
750
500
250
100
图2 引物对组合ME2/EM3扩增条带
Fig.2SRAPamplifiedbandpaternsofcombinationofME2/EM3
传距离在0.0769～0.4131。其中11号三白和12号
大青皮酸之间的遗传距离最小为0.0769,其生物学
特性为成熟果皮颜色三白为黄白色,大青皮酸为青
黄色,都不呈现明显红色。1号和13号之间的遗传
距离最远为0.4131,1号为鲜食石榴开封四季红,13
号墨石榴为观赏石榴,形态差异较大。
图 3为应用 UPGMA程序建立的 23个石榴基
因型的聚类图。根据聚类图,在遗传距离0.33处,可
以把 23个石榴基因型分为 5个类群(A、B、C、D、
E)。其中,单瓣红花味甜的石榴基因型包括开封四
季红(1号)、河阴软籽(9号)、泰山红(8号)、大马牙
(14号)和单瓣红花、味酸的鲁峪酸(7号)、大青皮酸
(12号),单瓣白花的白皮红(10号)、白皮酸(6号)、
三白石榴(11号)聚为一类(A组),23个基因型中单
瓣白花石榴都聚在该组,与形态学分类一致。其次,
单瓣红花、果面红色的会理红皮(2号)、峄城红(5
号)、蒙阳红(16号)和单瓣红花、果面青黄的青皮石
榴(15号)聚为一类(B组)。这是一组味甜的鲜食栽
培品种。单瓣红花、果面青黄的大青皮(18号)、小青
皮 (18号)和赏食兼用石榴重瓣红花白缘石榴(19
号)聚为一类(C组)。该组的2个鲜食品种果实成熟
时果皮都不呈明显的红色。4个赏食兼用石榴基因
型单瓣粉红(20号)、单瓣红花白缘(21号)、单瓣红
花(23号)、小叶单瓣红花(22号)和栽培品种单瓣红
花、果皮红色的豫3号(3号)和大红甜(4号)聚为一
类(D组)。单瓣的赏食兼用石榴都聚在本组。最后,
观赏小石榴墨石榴(13号)单独成一类(E组)。墨石
榴植株矮小,与其它基因型相比,形态差异较大,划
分的结果与形态学分类吻合,表明墨石榴与其它基
因型亲缘关系相对较远。4种赏食兼用的石榴基因
型单瓣红、单瓣粉红、单瓣红白边、小叶单瓣红聚在
一起,与形态学分类吻合。它们又分别和其它鲜食石
榴聚在一起,表明赏食兼用石榴和鲜石榴基因型很
接近。A组中分属加工类石榴和鲜食类石榴聚在一
起,也说明了2者之间的基因型是相互渗透的,有着
较近的亲缘关系。
1
6
7
9
10
8
14
11
12
2
5
15
16
17
18
19
3
4
20
21
22
23
13
0.00 0.08 0.17 0.330.25 0.41
E
D
B
C
A
Coeficient
658
5期
3 讨 论
石榴基因型目前主要是依据生物学特性和经济
性状进行分类。根据不同的用途和功能,主要分为4
类[10],即鲜食石榴、赏食兼用石榴、加工石榴、观赏石
榴。还有以花色、成熟果皮颜色、果实风味等划分方
法。但形态学分类容易受环境因素的影响。随着现代
分子生物学的发展,不同分子标记方法如 RAPD、
ALFP、SSR等在果树品种鉴定、遗传多样性分析、遗
传图谱构建等得到广泛地应用,从DNA水平上反映
各个基因型之间的内在差异。
RAPD[11]具有技术简单,操作快速方便,DNA用
量少,成本较低等优点,但重复性和稳定性不太高。
ALFP[12]技术灵敏度高,快速,多态性高,DNA用量
少,比RAPD稳定性好,重复性强,但实验成本较高,
操作比较烦琐。SSR[13]多态性高,操作简单。但其引物
设计要根据基因组的序列信息来进行,因此成本较
高,主要用于已知基因组的研究。SRAP[5]的原理是利
用独特的引物设计对 ORFs(开放阅读框架)进行扩
增,针对基因外显子中富含GC而启动子中富含AT
的特点来设计引物。正向引物中的CCGG序列瞄准
ORF区的外显子,反向引物中的 AATT序列瞄准启
动子和内含子。在不同个体中外显子、内含子和间隔
区之间的长度变化较大,使用这 2对引物进行 PCR
扩增可产生丰富的多态性。其操作简单、多态性高,
但目前在石榴分子生物学研究的应用还比较少。
一些学者尝试使用RAPD、ALFP对石榴进行遗
传多样性分析,得到较好的扩增效果,虽然聚类结果
和形态学分类结果不完全一致,却为石榴基因型遗
传多样性分析提供了新思路。例如,卢龙斗等[14]利用
15条随机引物从 55份石榴品种中扩增出 125条
带,其多态性比率达73.6%。聚类结果表明,它不能
区分石榴基因型的花色和果味,却能区分出钟状花
的瓣型。类似地,杨荣萍等[15]用12条随机引物从25
份云南石榴资源中扩增出110条谱带,其多态率也
达到71.8%。但是,聚类结果与生产上根据风味、花
色、皮色、子粒颜色、核软硬程度等某一性状及栽培
目的的分类方法不一致。此外,Sarkhosh等[16]利用
RAPD对伊朗24个石榴基因型进行了分析,同样认
为石榴基因型之间存在丰富的遗传多样性。Rania
等[17]用 6对引物组合对突尼斯 34个石榴基因型进
行了ALFP分析,得到了327条谱带,聚类结果也与
以石榴基因型的地理分布和命名划分结果不完全一
致。本研究中,7对SRAP引物扩增出1380条带,其
数量明显高于RAPD法,虽然多态率只有 48%,但
是石榴基因型多态性条带数量显著增加。与 ALFP
相比,2者都几乎具有无限的多态性,说明 SRAP适
合用于石榴遗传多样性分析。
另一方面,本研究结果与形态学分类也不完全
一致。在形态学上,23个石榴基因型可划分为4类,
即重瓣红白缘(19号)、单瓣粉红(20号)、单瓣红白
缘(21号)、小叶单瓣红(22号)、单瓣红(23号)划归
为赏食兼用石榴类;白皮酸(6号)、鲁峪酸(7号)、大
青皮酸(12号)划归为加工类石榴;墨石榴(13号)归
为观赏石榴类;其余划归为鲜食类。本试验的UP-
GMA聚类结果表明,观赏类石榴墨石榴单独聚为一
类,与其它基因型亲缘关系较远;单瓣赏食兼用石榴
都聚在一起。这些与形态学分类一致。其它类型之间
的聚类结果相互交叉,说明它们之间的基因型非常
接近。也许,控制这些农艺性状的基因只存在极少数
碱基的变化,而SRAP只能检测到扩增长度的多态
性,不能对碱基的变异加以检测,因此需要几种分子
标记方法结合使用。此外,随着石榴基因组信息量的
增加,尝试使用检测效率更高的分子标记方法如
SNP法等,或许可以为石榴资源的整理和评价提供
更多科学依据。
与 RAPD相比,SRAP图谱有着更加丰富的多
态性,因而在遗传多样性研究中具有一定优越性。本
研究利用琼脂糖电泳对PCR扩增结果进行检测,获
到了较好的检测效果,还避免了聚丙烯酰胺电泳
(AFLP法)的繁琐操作,降低了试验成本。SRAP可
进一步应用到石榴品种鉴定和遗传图谱构建等方面
的工作。
4 结 论
SRAP分子标记能够用于石榴基因型遗传多样
性分析。观赏小石榴墨石榴与其它22个基因型显著
不同,不同花色和叶型的单瓣赏食兼用石榴聚在一
起,与形态学分类相吻合。鲜食石榴各品种间聚类结
果与按照花色、果色、风味等形态学指标不太一致,
表明了石榴各基因型遗传关系的复杂性。
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果 树 学 报 25卷
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