全 文 ：HEREDITAS (Beijing) 2009年 7月, 31(7): 748―754
ISSN 0253-9772 www.chinagene.cn 研究报告

收稿日期: 2008−11−20; 修回日期: 2009−01−01
基金项目: 国家自然科学基金项目(编号：30011597)资助
作者简介: 杨永霞(1980− ), 女, 博士, 专业方向：进化遗传学。E-mail：yyx624@126.com
通讯作者: 王艇 (1969−), 男, 博士, 研究员, 研究方向：进化遗传学。Tel: 027-87510677; E-mail: tingwang@wbgcas.cn
DOI: 10.3724/SP.J.1005.2009.00748
毛柄短肠蕨红/蓝光嵌合光受体基因的克隆和蛋白质结
构分析
杨永霞 1,2, 高磊 1,2, 王艇 1
1. 中国科学院武汉植物园, 武汉 430074;
2. 中国科学院研究生院, 北京 100049
摘要: Phytochrome 3 (PHY3) 是一种特殊的既能吸收红光/远红光又能吸收蓝光的嵌合光受体, 一些隐花植物
利用 PHY3 提高在弱光环境下的光敏感性。但是, 有关植物嵌合光受体的序列信息极为匮乏。文章采用反向 PCR 法
分离了蕨类植物毛柄短肠蕨红/蓝光嵌合光受体编码基因的全长序列。序列分析表明: 该基因没有内含子, 仅包
含一个长度为 4 278 bp 的开放阅读框, 与铁线蕨 PHY3 的核苷酸序列具有 80％以上的一致性。该基因编码
一个 1 425个氨基酸组成的蛋白质, 预测分子量为 157 kDa, 理论等电点 (pI) 为 6.29。结构分析表明, PHY3
是由光敏色素和向光色素蛋白融合而成, 其 N 端序列与光敏色素 N 端序列类似, 包括 PAS、GAF 和 PHY
结构域, 负责结合吸收红光/远红光的藻蓝胆素生色团; 而 C端与完整的向光色素类似, 由 2 个 LOV和 1 个
Ser/Thr 激酶结构域组成, 可结合吸收蓝光/ UV-A 的生色团黄素单核苷酸 FMN。
关键词: 红/蓝光嵌合光受体; 克隆; 序列分析; 结构预测
Molecular cloning and protein structure analyses of red/blue light
chimeric photoreceptor from Allantodia dilatata (Bl.) Ching
YANG Yong-Xia1, 2, GAO Lei1, 2, WANG Ting1
1. Wuhan Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430074, China;
2. Graduate School of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Abstract: Phytochrome 3 (PHY3) is a novel chimeric photoreceptor that can respond to both red/far red and blue light.
Using this photoreceptor, some cryptogams could enhance light sensitivity under low light environment. But PHY3 se-
quence information is still extremely limited. In the present study, a full-length PHY3 genomic sequence was cloned from
a fern Allantodia dilatata (Bl.) Ching by inverse PCR approaches. Sequence analysis showed that introns were absent in the
gene. It contained a 4 278 bp open reading frame, encoding a deduced protein of 1 425 amino acid residues with a theoreti-
cal isoelectric point (pI) of 6.29 and a calculated molecular mass about 157 kDa. Protein domain search and structure analy-
ses indicated that PHY3 originated from the recombination of two different photoreceptors. Its N-terminal section consisted of
a putative functional phytochrome chromophore-binding domain including PAS, GAF, and PHY, whereas the C-terminal
region possessed a nearly complete phototropin motif with two LOV and one STKc domains.
Keywords: Red/blue light chimeric photoreceptors; Clone; Sequence analyses; Structure prediction

第 7期 杨永霞等: 毛柄短肠蕨红/蓝光嵌合光受体基因的克隆和蛋白质结构分析 749


高等植物在进化过程中发展了一套复杂的感光系
统, 用于感受光信号的强度、方向及光周期[1~3]。该系
统由至少 5 种光受体基因家族组成, 主要包括吸收红
光/远红光的光敏色素 PHY (Phytochrome)、吸收蓝光
/UV-A (UltraViolet) 的隐花色素(Cryptochrome)、吸收
蓝光/ UV-A 甚至绿光的向光色素 PHOT (Phototro-
pin)、吸收蓝绿光的 ZTL (Zeitlupes)家族以及可能存
在但尚未被鉴定的吸收 UV-B 的 UV-B 受体[4~10]。通
过一个复杂的信号转导网络, 它们单独作用或两两
互作 , 在植物整个发育时期调控不同的光反应过
程[5, 11~13]。此外, 在藻类植物转板藻(Mougeotia scalaris
Hass.)[14]、藓类植物角齿藓 (Ceratodon purpureus
(Hedw.) Brid.) [15] 和蕨类植物铁线蕨(Adiantum capil-
lus-veneris L.)、欧洲鳞毛蕨(Dryopteris filix-mas (L.)
Schott)、球子蕨 (Onoclea sensibilis L.)以及姬蕨
(Hypolepis punctata Mett.)[16,17]中还鉴定出一种既能吸
收红光又能吸收蓝光的嵌合光受体 Phytochrome 3
( PHY3, 转板藻中命名为 MsNEO1 和 MsNEO2 )。
序列分析表明, 铁线蕨 PHY3(AcPHY3) 没有内
含子, 仅包含一个连续的开放阅读框 [16]。其编码蛋白
的氨基(N)端与 PHY N 端类似, 能够结合吸收红光
/远红光生色团的前体—— 藻蓝胆素 (PФB: phyto-
chromobilin), AcPHY3 蛋白和发色团藻蓝胆素结合后
具有和普通 PHY 相似的吸收光谱[17]; 而AcPHY3 蛋
白羧基(C)端与完整的 PHOT 类似, 包括 2 个 LOV
(Light, Oxygen and voltage)结构域和 1个 Ser/Thr 激
酶结构域(Serine/threonine kinase)[17~19]。AcPHY3 C 端
的两个 LOV 结构域能够结合吸收蓝光/ UV-A 的
生色团黄素单核苷酸 FMN (Flavin mononucleotide),
并具有和种子植物 PHOT LOV 结构域类似的吸收
和荧光光谱[19]。因此, AcPHY3 兼具吸收红光和蓝
光的能力; 这不仅拓宽了向光反应的光谱范围, 也
使得蕨类植物能够感受自然环境下的低光信号[17, 20],
提高了在林荫密布生境下的适应性。拟南芥突变体表
达以及转录物的检测研究也表明, 两个独立的、分
别吸收红光和蓝光信号的双通道光感受系统通过一
个单独的色素蛋白协同作用, 提高了嵌合光受体的
光敏感性和低光遮蔽环境下的适应性[19]。
目前, 有关植物嵌合光受体的序列信息极为匮
乏。在蕨类植物中, 仅报道有一条铁线蕨全长 PHY3
序列[16]。本研究从蕨类植物毛柄短肠蕨 Allantodia
dilatata (Bl.) Ching 中分离了全长红/蓝光嵌合光受
体基因 AdPHY3, 并对其序列和蛋白结构进行了分
析 , 以期为进一步研究该基因的起源和进化奠定
基础。
1 材料和方法
1.1 实验材料和试剂
毛柄短肠蕨为中国科学院武汉植物园收集、种
植。大肠杆菌感受态细胞 DH5α 为本实验室保存。
pMD19-T 载体、普通 Taq 酶、高保真 LA Taq 酶、
dNTP 等试剂购自宝生物工程 (大连 )有限公司
(TaKaRa); SphⅠ和 T4 DNA 连接酶购于 NEB 公司;
DNA 凝胶纯化回收试剂盒购于 Promega 公司。
1.2 基因组总 DNA 的提取及 PHY3 全长基因的克
隆、测序
取 1~2 g 幼嫩叶片, 用液氮冷冻研磨后采用改
进的 CTAB 法提取 DNA[21]。利用 GenBank 中收
录的转板藻 MsNEO1、MsNEO2 基因序列(登录号:
AB206967, AB206966)和铁线蕨 PHY3 基因序列(登
录号: AB012082), 分别在起始密码子上游和保守结
构域区段利用 Primer 5.0 软件设计 5 对特异性和
简并性引物 (5′-GSP F1/R1、M-GSP F1/R1、M-GDP
F2/R2、M-GSP F3/R3 以及 M-GDP F4/ M-GSP R4,
表 1)。引物由 Invitrogen 公司合成。PCR 反应总体
积为 20 µL, 其中包含 10×PCR 缓冲液 2 µL, MgCl2
2 mmol/L, 4 种 dNTPs 各 0.2 mmol/L, 引物 0.4
mol/L, 基因组 DNA 200 ng 和 1 U Taq DNA 聚合
酶。PCR 扩增条件为: 94℃预变性 5 min; 94℃变性
30 s, 62℃复性(复性温度随不同引物变化)30 s, 72℃
延伸 1.5 min, 共 35个循环; 72℃延伸 15 min。对
于 3′端非保守区采用反向 PCR 法(Inverse PCR)[22]
扩增。毛柄短肠蕨基因组 DNA 首先用 SphⅠ酶于
37℃酶切 16 h, 灭活后用 T4 DNA 连接酶于 16℃
连接 16 h。稀释后的连接产物作为 PCR 扩增的模
版。IPCR 第一轮使用引物 3′-GSP F1/R1, 第二轮
使用引物 3′-GSP F2/R2 扩增, 引物序列见表 1, 两
轮 PCR 均采用 LA Taq 酶完成, PCR 扩增条件同
上。PCR 扩增产物采用 1% 琼脂糖凝胶分离。回
收纯化后连接到 pMD19-T 载体 , 转化大肠杆菌
DH5α 感受态细胞 , 然后涂布于加有 X-gal 和

750 HEREDITAS (Beijing) 2009 第 31卷


IPTG 的 LB 培养基平板, 培养过夜。挑取白斑, 用
M13 引物扩增检测。筛选出的预期大小的阳性克隆
送 Invitrogen 公司, 采用 ABI PRISM 3730 DNA 测
序仪进行双向克隆测序 , 每个片段至少测 3 个克
隆。不同引物对扩增出的重叠区段用 DNAman 软
件进行序列拼接。

表 1 克隆试验所用引物序列
引物名称 引物序列 (5′→3′)
5′-GSP F1 TCAGCAATGTCCGCCAAGACGAAG
5′-GSP R1 TAGGCCATCACCCGATCGTAGC
M-GSP F1 GATGGCCTACAAGTTCCACGAG
M-GSP R1 TGGCAGGGGTAGTGATAGA
M-GDP F2 ATCACGCCCAATTCCGAYTTC
M-GDP R2 TGHACTCCGATGAAGTACTGGA
M-GSP F3 GAGGTGCTCGGTGAGAACTG
M-GSP R3 CTCGGGCTTGAGGTCTCGGTAG
M-GDP F4 GSHATGATGGATCACCCATTC
M-GSP R4 CGGATGAGAGGCCAGTCGATG
3′-GSP F1 GAGGACTGGTGGGCGTTGGGAATC
3′-GSP R1 ATCCCTCCGTGTACTTGCTAACC
3′-GSP F2 GGGCAAGCGATGTCAAGAAGCAC
3′-GSP R2 CGGTAAGATTGAAGAACCCTGTG
注: GSP为基因特异性引物, GDP为简并引物。

1.3 序列分析
利用 NCBI 的 Blast、ORF finder 和 BankIt
分别进行核酸序列比较、阅读框架确定及序列在线
提交。运用 DNAstar 软件推测蛋白质序列, Expasy
Protparam[23]软件分析蛋白质的分子量、等电点和氨
基酸组成。蛋白质结构功能域用 PROSITE[24]和
SMART[25]软件进行预测。蛋白质疏水性分析、跨膜
区预测、信号肽和螺旋卷曲分析分别采用 ProtScale
(http://www.expasy.ch/tools)、TMpred[26]、SignalP[27]
和 Coils[28]软件进行。使用在线工具 SOPMA[29]
(http://www.expasy.org) 预测二级结构并计算各种
二级结构所占的百分比。同时将推测的氨基酸序列
提交瑞士生物信息研究所 (European Bioinformatics
Institute: http://www.isb-sib.ch/) Swiss-model, 基于
同源建模的原理进行毛柄短肠蕨 PHY3 蛋白质的
三维结构预测。
2 结果与分析
2.1 毛柄短肠蕨 PHY3全长基因的克隆和测序
利用 5对引物(5′-GSP F1/R1、M-GSP F1/R1、
M-GDP F2/R2、M-GSP F3/R3 以及 M-GDP F4/
M-GSP R4)克隆得到 AdPHY3基因的 5个片段(图 1,
泳道 A~E)。测序后, 去除载体序列, 分别得到 654、
849、1623、846 以及 731 bp 的 5 个相互重叠的片
段。进一步反向 PCR 克隆得到基因 3′端及终止密
码子下游部分序列(图 1, 泳道 F), 测序获得 536 bp
的序列。将这些重叠区段拼接后得到长度为 4 428 bp
的毛柄短肠蕨嵌合光受体基因序列。



图 1 PCR 扩增产物的电泳检测
M: DL2000 分子量标记 ; A~E: 采用普通 PCR, 利用引物 5′-GSP
F1/R1, M-GSP F1/R1, M-GDP F2/R2, M-GSP F3/R3 和 M-GDP F4/
M-GSP R4 扩增得到的产物; F: 采用反向 PCR, 利用引物 3′-GSP
F2/R2 扩增得到的产物。

2.2 毛柄短肠蕨 PHY3基因序列分析
将克隆到的 AdPHY3 序列提交 GenBank, 登录
号为 FJ455447。通过与铁线蕨 PHY3 cDNA序列比
较以及 ORF finder 分析发现, 它包含起始和终止密
码子, 7~4 284 bp 为一个开放阅读框, 不具内含子,
序列 GC含量为 60.78%。该基因编码 1 425个氨基
酸; 其中碱性氨基酸(Arg、Lys) 161个, 强酸性氨基
酸 (Asp, Glu) 175个, 疏水氨基酸 (Ala、Ile、Leu、
Phe、Trp、Val) 495个, 不带电荷的极性氨基酸 (Asn、
Cys、Gln、Ser、Thr、Tyr) 324个。20 种氨基酸中
含量最高的为亮氨酸 (10.20%), 其次是丙氨酸
(9.1%)、甘氨酸(8.0%)和精氨酸(7.4%)。预测蛋白质
分子量为 157 kDa, 理论等电点(pI) 6.29, 在 pH 7.0
的环境中带有 8.3个电荷。
图 2 给出的是毛柄短肠蕨 PHY3 蛋白质疏水
性分析结果。其疏水性最大值为 2.5, 有 3处疏水峰
>2; 最大亲水峰有两处, 都达−3 以下。在 70~90、
670~693和 1312~1333位氨基酸间找到分值很高的 3
个跨膜螺旋区; 其中 70~90 和 1312~1333 位氨基酸
间的跨膜螺旋最可能的方向为从膜内到膜外, N 端

第 7期 杨永霞等: 毛柄短肠蕨红/蓝光嵌合光受体基因的克隆和蛋白质结构分析 751


在胞内。推测毛柄短肠蕨 PHY3 蛋白为跨膜蛋白。
用 SignalP 对毛柄短肠蕨 PHY3 蛋白序列在线搜索,
寻找信号肽序列, 发现该蛋白存在信号肽的概率极
低, 不存在信号肽酶切位点, 很可能是一种非分泌
蛋白。螺旋卷曲分析显示, 这个蛋白质中有 3 个明
显的卷曲螺旋。


图 2 毛柄短肠蕨 PHY3 蛋白疏水性分析

与其他已经报道的嵌合光受体基因比较发现 ,
AdPHY3 与铁线蕨 PHY3 基因核苷酸序列同源性达
80%, 与M. scalaris嵌合光受体MsNEO1和MsNEO2
的同源性则较低(<27%)。此外, 毛柄短肠蕨 PHY3 5′
端核苷酸序列与植物光敏色素基因 PHY具有一定的
同源性: 与铁线蕨PHY1和PHY2(AB016168和AB016
232)的序列一致性为 30.5%和 30.3; 与藻类植物转板
藻 PHY(AB206965)为 29.2%; 与藓类植物角齿藓
PHY1、PHY2、PHY3 和 PHY4(U87632、U72993、
AY123149和 EU122393)分别为 26.8%、31.2%、32.5%
和 31.6%; 与裸子植物长白松 PHYP(EU203168)序列
一致性达 35.3%; 而与被子植物拟南芥 PHYA~E
(X17341、X17342、X17343、X76609和 X76610)的
序列一致性介于 26.6%~27.9%。毛柄短肠蕨 PHY3 3′
端序列则与植物向光色素基因 PHOT 一致性较高: 与
铁线蕨 PHOT1和 PHOT2 (AB037188, AB115545)、转
板藻 PHOTA和 PHOTB (AB206963, AB206964)、长白
松 PHOT1 (AY093427)、拟南芥 PHOT1 和 PHOT2
(NM_114447, NM_180879)以及水稻 NPH1 (AB018443)
的序列同源性分别为 39.5%、41.6%、47.4%、46.1%、
43.4%、43.9%、45%和 50.8%。
2.3 毛柄短肠蕨 PHY3功能域预测
PROSITE 和 SMART 预测的毛柄短肠蕨 PHY3
蛋白功能结构域如图 3所示。其 N端含有 PAS (Per/
Arnt/Sim)、GAF (cGMP-specific phosphodiesterase /
adenylate cyclases/formate hydrogen lyase transcrip-
tion ) 和 PHY 结构域 (Phytochrome domain); C 端
含有两个 LOV 结构域和一个 STKc 结构域。预测
出的毛柄短肠蕨 PHY3 蛋白结构具有典型的红/蓝
光嵌合光受体的结构特征。因此, 它的 GAF 结构
域可能同样可以通过共价键与四吡咯环生色团
PФB 链接 , 而 LOV1 和 LOV2 与生色团 FMN
结合, 表现出与其他红/蓝光嵌合光受体类似的结构
和功能。



图 3 毛柄短肠蕨 PHY3 蛋白结构示意图

2.4 毛柄短肠蕨 PHY3蛋白高级结构预测
毛柄短肠蕨 PHY3蛋白二级结构中含有 37.26%
的α螺旋、16.00%的β折叠、8.84%的转角和 37.89%
的无规则卷曲, 亦即有 53.26%的残基(α螺旋和β 折
叠)可能暴露于蛋白质表面 , 46.74%的残基(转角和
无规则卷曲)位于蛋白质内部。α螺旋和无规则卷曲
构成了二级结构的主要成分。
图 4 (A~D)给出了不同结构域的三维结构模拟
结果。嵌合光受体 PAS 和 GAF 结构域同光敏色素
PAS和 GAF具有类似的空间结构[30], 它们通过一个
8 字形套索结连接在一起(图 4A, 绿色部分)。GAF 结
构域的 6个反向平行的β折叠被两侧的 3个和 2个α
螺旋包围在中间, 形成“三明治”结构, 它含有与四吡
咯环生色团 PΦB 链接的保守半胱氨酸残基(Cys298)
(图 4A, 紫色球体)。而 LOV1(图 4B)和 LOV2(图 4C)
呈现出 PAS家族典型的α/β型结构, 由 5个反向平行
的β折叠(β1~β5)、3个α螺旋(α1~α3)以及一个 310螺
旋(α’A)组成, 其中 310螺旋由保守的 NCRFLQ残基
构成, 它对光激活反应以及随后的下游信号传导具
有重要作用[31]; 其中, α’A、α3 以及 β3~β5 包含了
11个与生色团 FMN结合的氨基酸残基 (图 4B、4C,
紫色部分)。嵌合光受体 STKc 结构域呈现出与 PKA

752 HEREDITAS (Beijing) 2009 第 31卷




图 4 毛柄短肠蕨 PHY3 蛋白不同结构域三维结构示意图
A: 紫色球体显示 GAF 结构域保守的半胱氨酸残基, 箭头所指绿色无规则卷曲结构显示 GAF 和 PAS 结构域形成的 8 字形缠绕套索结构;
B、C : 紫色部分表示与生色团 FMN 结合的部位; D: 绿色、红色和紫色分别显示 STKc 结构域 ATP 结合位点、催化位点和激活位点所形
成的环, 其中保守的天冬氨酸残基和丝氨酸残基分别用红色和紫色球体显示。

(c-AMP-dependent protein kinase A: 环磷酸腺苷自磷
酸化蛋白激酶 A)结构域类似的结构[32], 其N端主要由
β折叠构成 , 含有保守的 GS G D T G 残基构成的
P-loop(Phosphate-binding loop: ATP 结合位点)(图 4D,
绿色部分); C 端主要由α螺旋构成, 含有 PKA 类似的
催化 C-(catalytic)loop 和激活环 A-(activation) loop
(图 4D, 红色和紫色部分)。其中 C-loop包含催化磷酸
化反应的关键性位点—— 天冬氨酸残基(Asp1234)(图
4D, 红色球体); 而 A-loop区域保守的磷酸化作用位点
(Ser1295)(图 4D, 紫色球体)对于激酶活性的完全表达
是必须的[33]。
3 讨 论
本研究中, 我们克隆并测得毛柄短肠蕨 PHY3
基因的全长序列。毛柄短肠蕨 PHY3 含 3 个跨膜螺
旋区, 具有明显的亲水和疏水区, 没有发现信号肽
序列, 这些特点暗示毛柄短肠蕨 PHY3 可能与铁线
蕨 PHY3 一样 , 为质膜定位蛋白 [16]。毛柄短肠蕨
PHY3 编码的蛋白质分子中还有 3 个明显的卷曲螺
旋区 ; 卷曲螺旋是蛋白质的一种重要的空间结构 ,
可以通过构象改变参与信号传导过程[34]。这些均提
示毛柄短肠蕨 PHY3是一个有生物学功能的膜蛋白。
毛柄短肠蕨 PHY3 基因的 5′端和 3′端分别与
PHY和 PHOT具有约 26%~50%的同源性, 显示该基
因可能是由来源不同的两个基因重组而成。此外 ,
毛柄短肠蕨和铁线蕨 PHY3 基因都完全缺失内含子,
也反映出它可能是由原本具外显子—内含子结构的
PHOT基因经反转录转座作用后再与 PHY 片段融合

第 7期 杨永霞等: 毛柄短肠蕨红/蓝光嵌合光受体基因的克隆和蛋白质结构分析 753


产生的[35]。蛋白质结构域预测和三维结构模拟都发
现, 毛柄短肠蕨 PHY3表现出与铁线蕨 PHY3类似的
结构特征: 其N端与植物光敏色素类似, 具有与 PΦB
链接的重要氨基酸残基(Cys298), 可以吸收红光/远红
光; 而 C 端却与向光色素类似, 包含两个结构相似的
LOV结构域以及与 PKA类似的 STKc结构域, 同时还
保留有很多关键性位点(例如 Asp1234和 Ser1295), 表
现出与蓝光受体类似的结构特性。这说明毛柄短肠蕨
PHY3和铁线蕨 PHY3功能一致, 通过整合红光感受
系统与蓝光信号转导系统, 可以提高在弱光环境下
的光敏感性和光利用效率[17]。毛柄短肠蕨和铁线蕨
所处生境类似, 大都生长在阴暗潮湿的林下或溪边,
它们极可能选择相似的信号转导机制对光强、光质
及光周期作出局部适应性反应。
另一方面, 虽同为嵌合光受体基因, 但毛柄短肠
蕨和铁线蕨PHY3基因与转板藻嵌合光受体MsNEO基
因相比, 序列相似性很低(<27%); 更为重要的是, 蕨
类植物 PHY3基因没有内含子结构, 而藻类MsNEO则
含有 26个内含子, 被认为是 PHY与 PHOT 基因外显
子改组的产物[14]。虽然结构上有着明显的差异, 但
铁线蕨和转板藻嵌合光受体却都能利用红光和蓝光
调节植物的向光性和叶绿体运动[14, 17], 说明蕨类植
物和藻类的嵌合光受体基因有可能是独立起源, 属
趋同进化的产物[14]。
近来发现 , 在白垩纪 , 伴随被子植物的兴起 ,
陆地生态系统发生明显改变[20], 但是蕨类植物非但
没有衰退, 反而利用被子植物演化所提供的新的生
态机会发生了新一轮物种形成过程[20]。蕨类植物的
嵌合光受体基因 PHY3 也许正是它们适应当时生态
环境的体现, 对其在林荫密布的生境下成功繁衍、
进化并延续至今起着关键作用[17, 20]。我们将在本研
究结果的基础上, 进一步对蕨类植物 PHY3 的适应
性分子进化展开分析。
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