全 文 ：生命科学与实验研究
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肌动蛋白(Actin)是真核生物细胞内普遍存在的结构性蛋白,是
构成细胞骨架中微丝的主要成分,参与细胞分裂、细胞伸长、物质运
输以及胞内信号传导等[1]。在高等植物中,Actin由多基因编码,由于
该类基因在不同物种中核苷酸与氨基酸水平上都具有高度的保守
性和同源性,并在不同组织中表达相对恒定,常被用作为研究其他
基因的表达模式及调控机制的内参基因[2]。目前,大规模发掘野生植
物资源的优异基因并深入研究其功能,发掘其潜在的应用价值已成
为目前植物分子生物学研究的热点之一。而研究基因的表达模式是
研究基因功能的重要技术手段之一,这就需要一个高度保守、表达
稳定的基因作为内参基因。本文通过克隆草海桐的Actin基因片段,
为草海桐功能基因的研究提供可供参考的内参基因。
草海桐(Scaevola sericea L.)是一种典型的滨海适生植物,也
称为羊角树、水草仔、细叶水草,是草海桐科多年生常绿亚灌木植
物,广泛分布于我国华南沿海沙滩、石砾地。草海桐生长迅速,抗逆
性强,可作为园林植物进行开发,也可以用作海岸固砂防潮备选树
种[3]。此外,野生草海桐体内还含有多种次级代谢物,具有一定的药
用价值,也是一种民间药物[4]。由于草海桐具有极强的耐盐性和耐旱
性,研究其相关的分子机制,克隆功能基因,并评价其应用价值,具
有重要的科学意义和潜在的应用价值。然而,有关草海桐功能基因
的研究尚未见报道。鉴于此,研究拟以草海桐叶片为材料,用RT-
PCR方法克隆草海桐Actin基因片段,以此基因为内标参照,为研究
其他基因在草海桐中的表达和调控奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
选取华南植物园温室中生长的草海桐幼苗,采摘幼嫩叶片作供
试材料。取新鲜样品,用RNase-free的水清洗后,立即冻存于液氮
中,置于-70℃超低温冰箱中保存备用。
1.2 试剂
大肠杆菌菌株JM109由本实验室保存。RNA提取的HiPure
Plant RNA Kits(R4151)购于Magen公司。DNA琼脂糖凝胶电泳
回收采用Magen公司HiPure Gel Pure DNA Kits。cDNA合成的
TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis
SuperMix购于北京全式金公司。PrimeSTAR HS DNA Polymerase
和普通Taq酶购自TaKaRa公司。克隆载体pGEM-T购于Promega公
司。其他生化试剂均为进口或国产分析纯。
1.3 方法
1.3.1 引物合成
参考文献合成Actin简并性引物Actin DegF和Actin DegR。
预计获得598 bp的片段。引物由上海生工公司合成。引物序列如下:
滨海适生植物草海桐
Actin 基因片段的克隆及序列分析
郭艳 1,2 夏快飞 1* 张美 1 陈建通 1
(1.中国科学院华南植物园 广东广州 510650;2.中国科学院大学 北京 100049)
摘要:[目的]本文为研究草海桐功能基因的表达模式提供可供参考的内参基因。[方法]根据Actin基因的保守区设计简并性引物,采用RT-PCR扩
增草海桐Actin基因的片段。将获得的片段连接于T载体并进行测序,运用分子生物学软件对该序列进行分析。[结果]获得一段大小为554 bp的基因片段,
编码184个氨基酸;该序列与其它Actin基因核苷酸序列的同源性均在82%以上,与氨基酸序列的同源性达96%以上。[结论]克隆的基因为Actin基因片段,将
其命名为SsActin1,并登录在GenBank,登录号为KU564628。
关键词:草海桐 Actin基因 克隆 序列分析
中图分类号:Q94 文献标识码:A 文章编号:1674-2060(2016)05-0039-02
基金项目:中国科学院 A 类战略性先导科技专项(XDA13020500)。
作者简介:郭艳(1992 —),女,在读硕士,研究方向:植物分子生物学。
通讯作者:夏快飞(1975 —),女,湖南,研究生,研究员,研究方向:从事植物抗盐分子。
图 1 草海桐幼叶总 RNA 琼脂糖凝
胶电泳检测
图 2 草海桐 Actin 基因的扩增。
M 示 DNA Maker
图 3 重组克隆的菌落 PCR 检测
M 示DNAMaker,C 示未加菌落的阴性对照,1 和2
示两个阳性单菌落
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Actin DegF:5’-GTGGTCGTACAAC(A/T)GGTATTGTG-3’
Actin DegR:5’-GA(A/C/T)CCTCCAATCCAGACACTG-3’
1.3.2 总 RNA 提取
取草海桐幼苗的幼叶提取总RNA。RNA的提取方法依照
Magen公司HiPure Plant RNA Kits(R4151)的说明书进行。对提
取的总RNA进行琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测。
1.3.3 逆转录反应获取 cDNA
采用两步法以总RNA为模板逆转录cDNA。cDNA链的合成依
照全式金公司TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA
Synthesis SuperMix的说明书进行。
1.3.4 Actin 基因 cDNA 片段的扩增与克隆
以cDNA单链为模板,采用高保真DNA聚合酶PrimeSTARRHS
DNA Polymerase扩增草海桐Actin基因。所采用的引物为Actin
DegF和Actin DegR,PCR反应体系为50μL。PCR扩增反应体系为:
5 x PCR Buffer 10μL,10 mM dNTP Mixture 4μL,10μM
Actin DegF 1μL,10μM Actin DegR 1μl,PrimeSTAR RHS
DNA Polymerase 0.5μL,cDNA模板2μL,ddH2O2 31.5μL。各
种成分混匀后置于PCR仪上进行反应。反应程序为:94℃预变性3
min;94℃变性30 s、56℃退火30 s、72℃延伸45 s,30个循环;最后72
℃延伸5 min。
取2μL的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,观察是否获得特
异性DNA片段,并与DNA Marker比较,分析该DNA片段的分子量。
之后采用HiPure Gel Pure DNA Kits回收目的DNA片段。将回收
的PCR产物进行3’末端加A处理后,按照克隆载体pGEM-T说明书
要求进行连接,将连接产物转化感受态大肠杆菌JM109。
1.3.5 阳性克隆的筛选与鉴定
将转化后的大肠杆菌涂布于LB固体(Amp/IPTG/X-Gal)培养
基平板上,37℃培养过夜,进行蓝白斑筛选及菌落PCR鉴定,阳性克
隆可提取质粒,送至广州艾基生物公司进行测序。
1.3.6 序列的生物信息学分析
测序后获得的序列与NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.
gov/Blast.cgi)网站上公布的其他物种的Actin基因进行同源性比
较。序列的比对及进化树分析采用MEGA6软件进行。
2 结果与分析
2.1 总 RNA 的提取与质量检测
以草海桐的幼叶为材料提取总RNA,琼脂糖凝胶电泳检测结果
显示28S rRNA、18S rRNA条带清晰(图1),前者亮度约是后者的2
倍,说明所提取的RNA未降解,可进行下一步的逆转录反应;经紫外
分光光度计检测总RNA浓度为94 ng/μL。获得的总RNA可以进
行下一步实验,获得cDNA第一链。
2.2 RT-PCR 扩增
以草海桐幼叶总RNA反转录所得到的单链cDNA为模板,进行
Actin基因RT-PCR扩增。扩增产物经凝胶电泳检测发现,在约400
bp到700 bp之间有１条特异性DNA条带,大小可能为600 bp,该序
列与预测的Actin片段大小相符(图2),推测是草海桐Actin基因片断。
2.3 阳性克隆的鉴定与测序
将目的片段进行琼脂糖凝胶电泳回收,回收获得的DNA经紫外
分光光度计检测浓度后,连接于T载体上并转化大肠杆菌感受态。经
蓝白斑筛选后,随机挑取2个白色的准阳性克隆,采用引物对Actin
DegF和Actin DegR进行菌落PCR鉴定(PCR反应体系中未加菌落
为阴性对照),电泳检测扩增片段大小约为600 bp(图3),表明这些克
隆确实为阳性克隆,可以提取质粒,进行测序。
2.4 序列分析
将菌落PCR鉴定为阳性的单克隆菌落进行扩增培养,提取质
粒,并将重组质粒测序。结果表明,所挑取的两个克隆均含有编码
Actin蛋白的cDNA序列片段,且两条序列完全一致,表明我们所克
隆的DNA片段确实为草海桐Actin蛋白的cDNA序列,且该基因在草
海桐叶片中表达含量较高,有可能为组成性表达的持家基因。
由图４测序结果分析,得到长度为598 bp草海桐Actin片段(包
含两端的简并性引物),去掉两端的引物后,获得包含有554 bp的
Actin片段,编码184个氨基酸残基,将该片段命名为SsActin1。将这
一cDNA片段进行Blast比对,结果显示,该Actin基因片段与其他植
物的Actin基因核苷酸序列的同源性均在82%以上,其中与桔梗的
Actin基因(JF781303.1)核苷酸序列一致性最高,可达到91%;氨基酸
同源性分析表明,这184个氨基酸的片段与桦树Actin(AIY27746.1)
对应区域的氨基酸序列一致性达到了99%(仅有一个氨基酸的差别),
与其他植物中的Actin片段的氨基酸序列一致性也均在96%以上。该
序列已向GenBank递交,序列编号为:KU564628。
3 讨论
植物肌动蛋白(Actin)是由300多个氨基酸残基组成的单链球状
蛋白,分子量为40kD左右,通常由多基因家族编码。肌动蛋白是细胞
结构蛋白的一种,在不同组织和细胞中普遍存在,并且在不同的物
种中具有高度的保守性[1]。正是由于肌动蛋白的这一特征,Actin基
因在不同组织和细胞中表达模式稳定,被归为持家基因(House-
keeping gene)的一种,在分子生物学研究中通常被作为内参基因
用于检测目标基因表达水平变化的规律。目前,已在多个植物物种
中克隆出了Actin基因。而在植物基因表达研究中,Actin基因是被选
用次数最多的内参基因[6]。通过对数据库的查询发现,目前还没有克
隆出草海桐的Actin基因,本论文的研究填补了这一方面的空白。
本研究首次克隆了草海桐Actin基因的cDNA片段,SsActin1,
丰富了植物肌动蛋白基因数据库。本研究中所克隆的草海桐Actin基
因也是高度保守的植物Actin基因之一,其编码的氨基酸序列与其他
植物中的肌动蛋白氨基酸的同源性均达到96%以上,其中与桔梗
Actin(JF781303.1)的同源性最高,可达99%(仅有一个氨基酸的差
别)。本项目后续工作将致力于发掘草海桐的抗逆遗传种质资源,并
采用分子生物学的方法研究抗逆基因的生物学功能,而本研究所克
隆的草海桐Actin基因的cDNA片段,为后期研究功能基因的表达模
式提供了可供使用的标准内参基因。
参考文献
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图 4 草海桐 Actin(SsActin1)cDNA 片段的核苷酸序
列及推测的氨基酸序列