全 文 ：果树学报 2015，32（5）: 741-750
Journal of Fruit Science
DOI: 10.13925/j.cnki.gsxb.20150008
82个石榴品种遗传多样性的 ISSR分析
马 丽 1，侯乐峰 2*，郝兆祥 2，马耀华 1，周玉亮 1，明东风 1
（1枣庄学院生命科学学院，山东枣庄 277160；2枣庄市石榴研究中心，山东枣庄 277300）
摘 要：【目的】研究不同性状石榴品种的遗传关系和遗传多样性，为石榴种质资源分类、品种鉴定和有效利用提供参
考依据。【方法】以具有不同性状的82个石榴品种为材料，用 ISSR标记分析石榴种质资源的遗传多样性和品种亲缘关
系。【结果】用筛选出的 10条扩增清晰、多态性较好的引物对 82个品种进行PCR扩增，共扩增出 186个位点，其中多
态性位点 178个，多态性位点百分率（PPB）为 95.69%，平均等位基因数（Na）为 1.957 0，平均有效等位基因数（Ne）为
1.302 4，平均Neis的基因多样性指数（He）为0.214 0，平均 Shannon信息指数（I）为0.356 7，品种间遗传相似系数（Gs）
为0.478 4～0.994 6，UPGMA聚类结果在Gs为0.735时，将82个品种分为4大类。遗传相似系数矩阵和Cophenetic值之
间的相关系数为0.985，说明聚类结果较准确。【结论】利用 ISSR标记技术可有效揭示石榴种质资源的遗传多样性和品
种间亲缘关系，82个石榴品种遗传多样性丰富。ISSR聚类结果与根据花瓣类型、结实性、籽粒硬度性状的分类结果吻合
度较高，与地理生态环境也有一定的相关性。研究结果对石榴种质资源的保存、分类鉴定及杂交育种有重要参考意义。
关键词：石榴；ISSR；遗传多样性；亲缘关系
中图分类号：S665.4 文献标志码：A 文章编号：1009-9980(2015)05-0741-10
Genetic diversity analysis of 82 pomegranate(Punica granatum L.) culti⁃
vars by ISSR markers
MA Li1，HOU Lefeng2*，HAO Zhaoxiang2，MA Yaohua1，ZHOU Yuliang1，MING Dongfeng1
（1Department of Life Science，Zaozhuang College，Zaozhuang 277160，Shandong，China；2Pomegranate Research Center，Zaozhuang
277300，Shandong，China）
Abstract:【Objective】The aims of this study are to provide the scientific basis for the classification，iden⁃
tification and effective utilization of the pomegranate germplasm.【Methods】The genetic diversity and ge⁃
netic relationships of 82 pomegranate cultivars with different characters were evaluated by ISSR markers.
【Results】10 ISSR primers with clear bands and good polymorphism were screened out. A total of 186
bands were amplified from 10 ISSR primers，of which 176 were polymorphic loci. The main indexes were:
Percentage of polymorphic band (PPB)＝95.69%，the number of alleles (Na)=1.957 0，Effective number
of alleles (Ne)=1.302 4，Nei’s gene diversity (He)=0.214 0 and Shannon’s information index (I)=0.356 7.
The genetic similarities coefficient between cultivars ranged from 0.478 4 to 0.994 6. 82 pomegranate culti⁃
vars were divided into 4 groups at Gs 0.735 based on UPGMA method. Cophenetic correlation coefficient
between similarity matrix and cophenetic matrix of dendrogram was relatively high (r=0.985) showing the
goodfit of the dendrogram.【Conclusion】82 pomegranate cultivars with different characters had abundant
genetic diversity. The result of ISSR cluster accorded with the classification results based on petal，fruit
character and seed hareness and also partial relevant to geographical origin. The genetic diversity and re⁃
lationships of pomegranate germplasm could be evaluated well and truly by ISSR markers. These results
provide valuable references for protection，utilization and variety selection of the pomegranate resources.
Key words：Pomegranates；ISSR；Genetic diversity；Genetic relationship
收稿日期：2015-01-13 接受日期: 2015-04-03
基金项目：国家林业公益性行业科研专项（编号：201204402）；国家林业局林木种苗工程项目：山东省枣庄市峄城区中国石榴种质资源
圃建设项目（编号：[2012]1888号）；山东省高等学校科技计划项目（编号：J14LF02）
作者简介：马丽，女，副教授，博士。研究方向：石榴分子生物学遗传育种。Tel: 13793713179，E-mail: mary1976816@163.com
􀆽通信作者 Author for correspondence. Tel: 13863222588，E-mail: houlefeng@126.com
果 树 学 报 32卷
石榴（Punica granatum L.）为二倍体（2n＝16）
果树，属石榴科（Punicaceae）石榴属（Punica L.）。石
榴属有 2个种，分别是 P. granatum 和 P. Protopuni⁃
ca。其中仅P. granatum在生产中栽培种植[1]。石榴
在中国已有 2 000多年的栽培历史，形成了以山东、
安徽等为代表的主要石榴产区。但由于异花授粉以
及不同地域间的引种和品种交换，导致品种混杂、系
谱不清，同物异名或同名异物现象严重。加之长期
的无性繁殖和人类的偏好，使石榴基因型趋于单一，
造成基因多样性降低，品种退化现象。目前，石榴种
质资源的远缘杂交已成为种质资源创新的一个重要
途径。因此，明确不同性状品种的亲缘关系及评价
石榴种质的遗传多样性，对石榴种质资源保护、高效
育种与有效利用具有重要的科学意义。
石榴品种分类方法有很多，传统上主要依据果
皮颜色、风味、籽粒硬度、花色、花瓣数量等性状特点
进行分类[2-4]。目前，很多研究表明用DNA分子标记
技术鉴定石榴品种比形态学、细胞学更准确，能从基
因水平反映品种之间的遗传差异[2，5-7]。但这些研究
使用较多的是稳定性较差的RAPD标记[2，5-6，8]，而且
多数集中在对某一地区的石榴品种进行研究，来源
范围较窄，涉及的品种数量少，不够系统。因此，利
用更稳定的分子标记技术鉴定石榴品种亲缘关系及
评价遗传多样性势在必行。ISSR标记结合了SSR标
记和RAPD标记的优点，克服了RAPD标记的缺点，
己广泛用于柑橘、火龙果、李和砂梨等果树亲缘关系
及DNA指纹图谱的研究 [9-13]，是一种有效检测物种
内遗传变异的方法[14]。
但 ISSR在石榴研究中应用较少 [15- 16]。我们用
ISSR研究形态各异的82个石榴品种的遗传多样性，
以期为石榴种质资源的保存、有效利用和新品种的
选育提供分子依据。
1 材料和方法
1.1 材料
试验材料来源于山东省枣庄市峄城区中国石榴
种质资源圃。经过2010—2014年连续5 a的性状调
查和形态鉴定，选择形态各异的82个品种为试验材
料。2013年 7月选取每份材料健康枝条的嫰叶，清
洗后于-70 ℃冰箱保存备用。
序号
Code
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
名称
Name
峄城小青皮酸
Yichengxiaoqingpisuan
峄城多刺
Yichengduoci
峄城大粒青皮岗榴
Yichengdaliqingpigangliu
超红
Chaohong
峄红1号
Yihong1hao
峄城三白甜
Yichengsanbaitian
峄城红花败育
Yichenghonghuabaiyu
峄城白皮马牙甜
Yichengbaipimayatian
半口青皮谢花甜
Bankouqingpixiehuatian
峄城紫粒青皮甜
Yichengziliqingpitian
峄城大红皮甜
Yichengdahongpitian
峄城红皮马牙甜
Yichenghongpimayatian
峄城超大青皮甜
Yichengchaodaqingpitian
原产地
Origin
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
花色
Flower color
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
白花
White
红花
Red
白花
White
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
瓣型
Petal shape
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
用途
Use
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
籽粒性状
Seed character
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
表 1 82个石榴品种的编号、原产地及主要性状
Table 1 The codes，origins and major characters of 82 cultivars
742
5期 马 丽，等: 82个石榴品种遗传多样性的 ISSR分析
序号
Code
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
名称
Name
峄城大红皮酸
Yichengdahongpisuan
超青
Chaoqing
峄城半口红皮酸
Yichengbankouhongpisuan
峄城胭脂红
Yichengyanzhihong
峄城小红皮酸
Yichengxiaohongpisuan
薛城无刺
Xuechengwuci
竹叶青
Zhuyeqing
峄城青皮马牙甜
Yichengqingpimayatian
峄城红厚皮
Yichenghonghoupi
峄城红皮大籽
Yichenghongpidazi
重瓣红花紫皮酸
Chongbanhonghuazipisuan
峄城青皮谢花甜
Yichengqingpixiehuatian
峄城大青皮酸
Yichengdaqingpisuan
峄城冰糖冻
Yichengbingtangdong
秋艳
Qiuyan
峄城半口红皮酸
Yichengbankouhongpisuan
泰山红
Taishanhong
泰安无刺
Taianwuci
蒙阳红（1）
Mengyanghong（1）
潍坊小红皮
Weifangxiaohongpi
蒙阳红（2）
Mengyanghong（2）
苍山小红皮
Cangshanxiaohongpi
软粒1
Soft-seed1
软粒2
Soft-seed 2
软粒3
Soft seed3
软粒4
Soft-seed 4
淮北红皮软粒
Huaibeihongpi soft-seed
淮北塔山红
Huaibeitashanhong
原产地
Origin
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东薛城
Xuecheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东泰安
Tai’an，Shandong
山东泰安
Tai’an，Shandong
山东平邑
Pingyi，Shandong
山东潍坊
Weifang，Shandong
山东平邑
Pingyi，Shandong
山东苍山
Cangshan，Shandong
突尼斯
Tunisia
日本
Japan
以色列
Israel
伊朗
Iran
安徽烈山
Lieshan，Anhui
安徽烈山
Lieshan，Anhui
花色
Flower color
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
瓣型
Petal shape
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
用途
Use
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
籽粒性状
Seed character
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
软籽
Soft-seeded
软籽
Soft-seeded
软籽
Soft-seeded
软籽
Soft-seeded
半软籽
Semi-soft seeded
半软籽
Semi-soft seeded
表1（续） Table 1（continued）
743
果 树 学 报 32卷
表1（续） Table 1（continued）
序号
Code
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
名称
Name
中农红
Zhongnonghong
淮北软籽5号
Soft-seed5 from Huaibei
淮北软籽3号
Soft-seed3 from Huaibei
淮北软籽2号
Soft-seed2 from Huaibei
白玉石籽
Baiyushizi
重瓣白皮
Chongbanbaipi
泰安重瓣红
Taianchongbanhong
重瓣粉红花白皮酸
Chongbanfenhonghuabaipisuan
重瓣小红花
Chongbaixiaohonghua
重瓣红花
Chongbanhonghua
重瓣月季石榴
Chongbanyueji
重瓣红花青皮甜
Chongbanhonghuaqingpitian
峄城重瓣白皮酸
Yichengchongbanbaipisuan
重瓣粉红花白皮甜
Chongbanfenhonghuabaipitian
峄城玛瑙
Yichengmanao
墨石榴
Moshiliu
邳州复瓣白
Pizhoufubanbai
淮北紫皮甜
Huaibeizipitian
重瓣红花红皮酸
Chongbanhonghuahongpisuan
单瓣粉红青皮甜
Danbanfenhongqingpitian
重瓣红花红皮酸
Chongbanhonghuahongpisuan
淮北玛瑙籽
Huaibeimanaozi
淮北二白
Huaibeierbai
淮北三白甜
Huaibeisanbaitian
怀远玛瑙籽
Huaiyuanmanaozi
淮北青皮甜1号
Huaibeiqingpitiani1
淮北青皮甜2号
Huaibeiqingpitian2
淮北青皮甜3号
Huaibeiqingpitian3
原产地
Origin
河南郑州
Zhengzhou，Henan
安徽烈山
Lieshan，Anhui
安徽烈山
Lieshan，Anhui
安徽烈山
Lieshan，Anhui
安徽怀远
Huaiyuan，Anhui
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东泰安
Tai’an，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
江苏邳州
Pizhou，Jiangsu
安徽烈山
Lieshan，Anhui
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
山东峄城
Yicheng，Shandong
安徽烈山
Lieshan，Anhui
安徽烈山
Lieshan，Anhui
安徽烈山
Lieshan，Anhui
安徽怀远
Huaiyuan，Anhui
安徽烈山
Lieshan，Anhui
安徽烈山
Lieshan，Anhui
安徽烈山
Lieshan，Anhui
花色
Flower color
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
白花
White
白花
White
红花
Red
粉红花
Pink
红花
Pink
红花
Pink
红花
Pink
红花
Pink
白花
White
粉红花
Pink
红白相间
Red and white
红花
Red
白花
White
红花
Red
红花
Red
粉红花
Pink
红花
Red
红花
Red
白花
White
白花
White
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
瓣型
Petal shape
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
重瓣
Double
重瓣
Doube
重瓣
Double
重瓣
Double
重瓣
Double
重瓣
Double
重瓣
Double
重瓣
Double
重瓣
Double
单瓣
Single
单瓣
Single
复瓣
Compoud
单瓣
Single
重瓣
Double
单瓣
Single
重瓣
Double
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
用途
Use
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
食赏兼用
Ornamental and fruit
食赏兼用
Ornamental and fruit
食赏兼用
Ornamental and fruit
观赏
Ornamental
观赏
Ornamental
观赏
Ornamental
食赏兼用
Ornamental and fruit
食赏兼用
Ornamental and fruit
食赏兼用
Ornamental and fruit
观赏
Ornamental
观赏
Ornamental
食赏兼用
Ornamental and fruit
食赏兼用
Ornamental and fruit
食赏兼用
Ornamental and fruit
食赏兼用
Ornamental and fruit
食赏兼用
Ornamental and fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
籽粒性状
Seed character
软籽
Soft-seeded
半软籽
Semi-soft seed
半软籽
Semi-soft seeded
半软籽
Semi-soft seeded
半软籽
Semi-soft seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
不结果
No fruit
不结果
No fruit
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
744
5期 马 丽，等: 82个石榴品种遗传多样性的 ISSR分析
表1（续） Table 1（continued）
序号
Code
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
名称
Name
淮北青皮甜4号
Huaibeiqingpitian4
淮北红皮甜
Huaibeihongpitian
淮北小红皮
Huaibeixiaohongpi
怀远玉石籽
Huaiyuanyushizi
肖县半口青皮酸
Xiaoxianbankouqingpisuan
怀远大青皮甜
Huaiyuandaqingpitian
淮北一串铃
Huaibeiyichuanling
淮北大青皮酸
Huaibeidaqingpisuan
淮北红皮酸
Huaibeihongpisuan
淮北玛瑙
Huaibeimanao
淮北小青皮酸
Huaibeixiaoqingpisuan
淮北小红皮
Huaibeixiaohongpi
淮北半口红皮酸
Huaibeibankouhongpisuan
原产地
Origin
安徽烈山
Lieshan，Anhui
安徽烈山
Lieshan，Anhui
安徽烈山
Lieshan，Anhui
安徽怀远
Huaiyuan，Anhui
安徽肖县
Xiaoxian，Anhui
安徽怀远
Huaiyuan，Anhui
安徽烈山
Lieshan，Anhui
安徽烈山
Lieshan，Anhui
安徽烈山
Lieshan，Anhui
安徽烈山
Lieshan，Anhui
安徽烈山
Lieshan，Anhui
安徽烈山
Lieshan，Anhui
安徽烈山
Lieshan，Anhui
花色
Flower color
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
红花
Red
白花红边
White and red edge
红花
Red
红花
Red
红花
Red
瓣型
Petal shape
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
单瓣
Single
用途
Use
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
果用
Fruit
籽粒性状
Seed character
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
硬籽
Hard-seeded
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取与检测 用改良的CTAB
法提取石榴嫩叶基因组DNA[17]。用 0.8%（m/v）的琼
脂糖凝胶电泳和核酸蛋白超微量紫外分光光度计
（IMPLEN P300）检测DNA的质量和浓度。稀释至
终质量浓度为50 mg·L-1，-20 ℃保存备用。
1.2.2 ISSR-PCR扩增 PCR扩增所用的 50条引
物、2×Taq PCR Master Mix、DL2000 marker均购自北
京康为世纪生物科技有限公司。PCR反应采用德国
Eppendorf的Mustercycler nexus 梯度 PCR仪。PCR
反应体系 25 μL，包含 2×Taq PCR Master Mix 12.5
μL、10 μmol·L- 1引物 1 μL、50 mg·L- 1 DNA1 μL。
PCR 反应程序为：94 ℃ 预变性 5 min；94 ℃ 45 s，
（Tm-5）℃（根据引物而定）1 min，72 ℃延伸1 min，35
个循环，4 ℃保存。PCR扩增产物用 5%非变性聚丙
烯酰胺凝胶电泳检测，用Protein Simple（Alphamag⁃
er HP）凝胶成像系统观察结果，拍照保存。
1.2.3 数据处理 PCR扩增试验 2次重复，不能重
复出现的谱带不作统计。以DL2000 Marker为分子
质量标准，在相同迁移率位置谱带清晰可辨的记为
“1”，缺失的记为“0”。统计所有 ISSR引物扩增的结
果，建立“0，1”原始矩阵。采用 POPGENE1. 32 软
件，在假定种群处于Hardy-Weinberg平衡状态下进
行遗传参数分析，分别计算多态位点百分率（PPB）、
Shannon信息多样性指数（I）、Nei’s遗传多样性指数
（He）、等位基因数（Na）和有效等位基因数（Ne）。用
NTSYS2.10 软件计算 82个品种间的遗传相似系数
（Gs），用 UPGMA法构建 82个品种的亲缘关系聚类
图。为了检验UPGMA聚类结果的准确性，用COPH
方法进行Cophenetic相关性检验[5，8]。
2 结果与分析
2.1 ISSR-PCR引物的筛选
从 50条 ISSR引物中筛选出 10条扩增谱带清
晰、重复性好、多态性好的引物用于所有品种的多态
性分析，结果见表 2。10条引物共检测到 186个
DNA位点，多态性位点 178个。平均每条引物扩增
出18.6个位点，其中多态性位点178个，多态性比率
745
果 树 学 报 32卷
（PPB）为 95.69%，扩增产物片段长度在 184～2 000
bp。10条引物中多态性最低为 86%，其中有 5条多
态性达到100%，说明10条引物多态性较好，82个品
种的遗传多样性比较丰富。图 1为引物UBC835对
部分品种的扩增结果。
2.2 石榴品种的遗传多样性分析
用Popgene1.32软件对 82个品种的遗传参数进
行统计分析，结果表明，Na为1.957 0，Ne为1.302 4，
He为 0.214 0，I为 0.356 7。各位点而言，He最大值
为0.497 0，最小值为0.024 3。I最大值为0.690 2，最
小值为 0.066 4。表明 82个品种间存在丰富的遗传
多样性。
本研究对硬籽、半软籽和软籽、观赏和赏食兼用
3种类型品种的多态性进一步比较，表明硬籽品种
遗传多样性最高，PPB为63.44%；其次是观赏、赏食
兼用品种，PPB为50.54%；半软籽、软籽品种遗传多
引物名称
Primer name
UBC834
UBC811
UBC825
UBC 816
UBC835
UBC827
UBC 861
UBC 880
UBC 840
UBC 835
总计 Total
平均 Average
序列 (5′ to 3′)
Sequence (5′ to 3′)
(AG)8YT
(GA)8C
(AC)8T
(CA)8T
(AG)8YC
(AC)8G
(ACC)6
(GGAGA)3
(GA)8YT
(AG)8YA
退火温度
Ta/℃
55
50
52
50
52
50
50
50
50
52
扩增谱带数
Number of bands
18
20
22
17
20
20
18
16
20
15
186
18.60
多态性谱带数
Number of polymorphic bands
18
18
19
17
20
19
18
16
19
14
178
17.80
多态位点百分率
PPB/%
100
90
86
100
100
95
100
100
95
93
−
95.69
表 2 ISSR-PCR扩增的引物及扩增结果
Table 2 ISSR primers used for ISSR-PCR amplification and their amplification results
Note: Y=C，T
样性最低，PPB为29.03%。3种类型品种的Nei′s基
因多样性指数为 0.050 5～0.192 2，平均为 0.115，
Shannon信息指数在 0.097 9～0.295 6，平均为 0.182
（表3）。
2.3 82个品种的聚类分析
根据 10条引物对 82个品种扩增获得的 186个
位点数据计算Gs，用UPGMA方法构建 82个品种的
遗传关系聚类图（图 2）。结果表明，Gs在 0.478 4～
0.994 6。其中 42号（中农红）与 75号（怀远大青皮
甜），8号（峄城白皮马牙甜）与 57号（墨石榴）Gs最
小，说明这些品种亲缘关系较远。48号（泰安重瓣
红）与 49号（重瓣粉红花白皮酸），47号（重瓣白皮）
M. DL 2 000 marker; 数字编号对应品种名称与表 1相同
M. DL2 000 marker；The number is same as the Table 1
图 1 引物UBC835对部分品种的扩增结果
Fig. 1 Amplification result of some pomegranate cultivars using UBC835 primer
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33
746
5期 马 丽，等: 82个石榴品种遗传多样性的 ISSR分析
品种类型
Type
硬籽
Hard-seeded
软籽
Soft seeded
观赏
Ornamental
观测等位基因数
Ao
1.634 4
1.290 3
1.505 4
有效等位基因数
Ae
1.310 8
1.175 0
1.066 1
多态位点百分率
PPB/%
63.44
29.03
50.54
Nei′s基因多样性指数
He
0.192 2
0.101 3
0.050 5
Shannon信息指数
I
0.295 6
0.151 4
0.097 9
表3 3种类型品种 ISSR的遗传多样性
Table 3 Genetic diversity for three types of pomegranate
注：软籽类型包括软籽/半软籽品种；观赏类型包括观赏、赏食兼用品种。
Note：Soft type included the soft cultivars/semi-soft cultivars; Ornamental type included ornamental cultivars，ornamental and fruit cultivars.
1~82：品种名称与表1相同
The cultivar name of 1-82 is same as the Table 1
图2 82个品种的UPGMA亲缘关系聚类分析
Fig. 2 The UPGMA clustering map of 82 pomegranate cultivars constructed by UPGMA
Ⅳ
Ⅲ
Ⅱ
Ⅰ
0.57 0.67 0.78 0.89 0.99
Coefficient
14371011568921222433253226273128293012131516141718192023234355758594754625355615051484960525636404142394637384344456465716366696770687276777879818280737475
747
果 树 学 报 32卷
与 62号（重瓣红花红皮酸），47号（重瓣白皮）与 54
号（峄城重瓣白皮酸）Gs最大，说明这些品种亲缘关
系较近。
由图 2可知，在Gs约 0.735处，82个品种被分成
4大类。
第Ⅰ类包含35个硬籽品种，这些品种均来源于
山东石榴产区。此类中多数品种基本上为红花、单
瓣，籽粒硬度较高。
第Ⅱ类为 16个观赏、赏食兼用品种，其中 14个
品种来源于山东峄城。邳州复瓣白来源于江苏邳
州，淮北紫皮甜为从安徽引种的赏食兼用品种，从聚
类图可看出，这 2个品种与来源于山东峄城的观赏
品种遗传关系较远。在Gs约 0.616处，第Ⅱ类和第
Ⅰ类聚在一起，可能与这些品种大部分都来源于山
东峄城有关。
第Ⅲ类包含有 11个品种，形态分类属于半软
籽、软籽品种。该类中的软粒1、软粒2、软粒3、软粒
4品种引种于国外，在聚类图中这些品种分散排列，
遗传差异相对较大。淮北软籽5号、淮北软籽3号和
淮北软籽 2号单独聚为一亚类。这 3个均为淮北半
软籽系列品种，性状相似，是从相近亲本中选育，因
而亲缘关系较近。
第Ⅳ类包含 20个品种，这些品种均来源于安
徽，都属于硬籽品种。其中67、68、69、70号4个品种
都属于淮北青皮甜系列品种，亲缘关系较近，聚为一
亚类。第Ⅳ类品种在Gs 0.59处，又与第Ⅲ类品种聚
在一起，可能是与这2类品种大部分来自安徽有关。
Cophentic相关性是通过计算聚类图获得的Co⁃
phentic值形成的矩阵与构建聚类图的原始数据矩
阵之间的相关系数，评价聚类图与原始数据的符合
程度[5，8]。用Cophentic相关性分析检测UPGMA聚类
结果的准确性。结果表明，Cophentic相关系数为
0.985，表明UPGMA的聚类结果与原始Gs之间有较
高的相关性，聚类结果较准确。
3 讨 论
遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，一
个物种的遗传多样性越丰富，适应环境变化的能力
就越强。前人的研究中，多数用RAPD标记探讨石
榴物种的遗传多样性[2，5-6，8]。本研究中10条 ISSR引
物在82个石榴品种中的PPB为95.69%，显著高于杨
荣萍等[2]（71.8%）、Sarkhosh等[5]（57.03%）、Durgac等[18]
（22%）用RAPD标记的研究结果。本研究的结果与
赵丽华等 [16]的研究结果（90.8%）接近，高于Narzary
等[15]的研究结果（87.01%）。说明 ISSR标记比RAPD
更能有效用于石榴种质资源的遗传多样性研究。
Ne、He与 I是评价物种遗传多样性水平的常用
指标 [19]。本研究结果显示 82个石榴品种的 Ne为
1.302 4，He为 0.214 0，I为 0.356 7，Gs介于 0.478 4～
0.994 6之间，此结果与赵丽华等[16]对47个石榴遗传
多样性的研究结果接近，说明82个石榴品种间存在
丰富的遗传多样性，石榴种质资源经天然异花授粉、
自然变异及人工选育积累了较多的基因变异，形成了
丰富的品种资源基因库。本研究中软籽、半软籽品种
遗传多样性最低（PPB为 29.03%）。Sarkhosh等 [8]
RAPD研究结果也表明 21个软籽、半软籽品种的多
态性较低（29.45%），可能因为在繁育过程中，软籽
石榴不是用种苗进行繁殖，而是采用扦插方式繁殖，
长期的无性繁殖导致基因型单一，品种间的遗传分
化程度较低，遗传基础相对狭窄。有研究表明石榴
种子硬度可能是由主效基因控制的数量性状[20]。数
量性状的表现对环境影响相当敏感，环境条件的变
化容易诱导软籽性状变异。为了有效保护稀少而珍
贵的软籽资源，不同地域间不应该盲目引种，应该用
优异软籽品种与其他类型品种进行杂交，选择出更
多的软籽基因型品种，丰富软籽类群的遗传多样性。
汪小飞等[4]研究认为在石榴形态特征中，花瓣、
花色、结实性、果色可以作为品种分类的主要依据，
而籽粒软硬、萼筒形状、新叶颜色、茎刺有无等特征
可作为次级依据。本研中根据 ISSR标记，82个品种
被分为 4大类。第Ⅰ和Ⅳ类为 55个硬籽品种，花瓣
基本为单瓣，果实性状较好；第Ⅱ类为观赏、赏食兼
用品种，基本都是复瓣、重瓣品种，果实性状较差；第
Ⅲ类多数具有单瓣、种子硬度较软的性状。尤其是
引种于伊朗、突尼斯、日本、以色列的4个软籽品种，
与国内的淮北塔山红、淮北红皮软籽、中农红、白玉
石籽等品种聚为一类，说明籽粒的软硬是评价遗传
关系的一个重要指标，也说明国内的软籽品种可能
含有国外某些软籽品种的基因。经系谱调查，中农
红软籽是从突尼斯软籽芽变群体中选出的优良软籽
新品种，证明了本研究的结果。本研究中 ISSR聚类
结果与根据花瓣类型、结实性和籽粒软硬的性状分
类相关。而蒙阳红1（枝条直立型）和蒙阳红2（枝条
开张型）枝条性状不同，其他性状相近，但 ISSR聚类
748
5期
中 2者亲缘关系较远，说明表型分类仅依据可见性
状的差异进行，不能有效检测表型中不可见的差
异。因此，ISSR标记分类结果更准确，是对形态标
记的有效补充，2者可以相互结合来正确评价品种
间的遗传关系。
遗传学理论认为表型是生物性状的外在表现，
基因型和环境是决定表型的 2个重要因素，基因型
对表型的形成起决定性的作用，而环境因素也会对
生物的性状有一定影响[21]。本研究中来源于山东、
安徽的品种多数聚在一起，说明生长在相近生态环
境的品种亲缘关系较近。其原因可能是在一定的生
态环境栽培过程中，石榴种质形成了与环境相适应
的特定遗传结构，或者与其他生态环境下的品种基
因交流较少，导致相近生境条件下的品种遗传关系
较近。
远源杂交育种是进行种质资源遗传改良的基
础。对于遗传基础比较复杂的物种，只有了解了其
遗传关系，才能有针对性的选配亲本，提高杂交育种
效率。本研究发现多数软籽、半软籽品种及来源于
安徽的品种与其他类型品种的遗传距离较大，这些
品种可作为优良育种资源加以利用。因此，根据本
研究的结果，在育种实践中可以选用生态环境差异
较大、亲缘关系较远的品种进行杂交，以实现对石榴
品质的遗传改良。
4 结 论
本研究表明，82个石榴品种间具有较丰富的遗
传多样性；ISSR聚类将 82个品种分为 4大类，聚类
结果与按照某些性状分类的结果基本吻合；品种间
亲缘关系与地理环境有一定相关性；软籽、半软籽品
种及安徽硬籽品种与其他品种亲缘关系较远，这些
品种可作为石榴遗传改良的亲本材料。
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