全 文 ：基金项目：福建省科技厅自然基金项目 (No. 2013J01087)和福建省教育厅科技项目 (No. JA12120)
收稿日期：2013-08-26 接受日期：2013-09-11
Online system: http://www.jabiotech.org
农 业 生 物 技 术 学 报
Journal of Agricultural Biotechnology
2013, 21(11): 1270~1278
DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2013.11.002
研究论文
Article
拟南芥柯浩体蛋白(Atcoilin)的功能预测及亚细胞定位
郑璐平 1，2 林辰 1 高芳銮 1，2 张超 1 谢荔岩 1 吴祖建 1 谢联辉 1*
1福建农林大学生物化学与分子生物学教育部重点实验室，福州 350002；2福建农林大学福建省植物病毒重点实验室，福州 350002
*通讯作者，fjxlh1@126.com
摘 要 柯浩体(cajal body, CB)是细胞核重要组分，在动植物生长发育以及病毒侵染过程中发挥着重要
作用，coilin是CB指示蛋白。为揭示拟南芥(Arabidopsis thaliana)柯浩体蛋白 (Atcoilin)的功能和亚细胞
定位，本研究采用RT-PCR方法从拟南芥中扩增获得Atcoilin的 cDNA，经克隆测序列后，利用生物信息
学软件分析预测Atcoilin的亚细胞定位和功能域；将柯浩体蛋白与表达载体pEarley101 (带黄色荧光蛋
白) 重组，通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)接种法将重组蛋白 Atcoilin-YFP在本氏烟(Nicotiana
benthamiana)叶片表皮细胞中进行瞬时表达，DAPI染色后在激光共聚焦显微镜下观察蛋白的亚细胞定
位。生物信息学分析表明，Atcoilin亚细胞定位在细胞核上，该蛋白编码608个氨基酸，可分为3个功能
域 (N端有序折叠区，中间无序折叠区及C端区)，与人类柯浩体蛋白高度同源，两者氨基酸序列总体一
致性为50%；Western blot证实，重组表达载体在本氏烟中得到了正确的表达，并在激光共聚焦显微镜下
观察，显示该蛋白定位在细胞核内。功能预测及细胞定位结果为该蛋白功能的深入研究提供基础资料。
关键词 Coilin，蛋白表达，功能域，细胞定位
Function Prediction and Subcellular Localization Analysis of Atcoilin,
Symbolizing Cajal Body, from Arabidopsis thaliana
ZHENG Lu-Ping1,2 LIN Chen1 GAO Fang-Luan1,2 ZHANG Chao1 XIE Li-Yan1 WU Zu-Jian1
XIE Lian-Hui1*
1 Key Laboratory of Biopesticide and Chemical Biology, Ministry of Education, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002,
China; 2 Key Laboratory of Plant Virology, Fujian Province, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China
* Corresponding author, fjxlh1@126.com
Abstract Cajal body (CB) is a significant component of nucleus, playing roles in growth and deveplopment
of animal and plants, and the progress of virus infection, coilin is the protein marker of CB. In order to
understand the function and subcellular localization of Arabidopsis thaliana coilin (Atcoilin), the cDNA
sequence of Atcoilin was amplified by RT- PCR from Arabidopsis thaliana, then cloned and identified by
sequencing. The subcellular localization and functional domains of Atcoilin were predicted using
bioinformatics softwares. Atcoilin was ligated into expression vector pEarley101 bearing yellow fluorescent
protein (YFP). Recombinant protein Atcolin- YFP were transiently expressed on the leaf epidermis cells of
Nicotiana benthamiana by using Agrobacterium-infiltration, the subcellular localization of protein was observed
under the confocal laser scanning microscope (CLSM). The bioinformatics analysis showed that Atcoilin
Cajal (1903)首次在神经元细胞核中发现柯浩
体 (cajal body, CB)。电镜下观察，CB呈球状体，直
径大小为0.1~2 µm，超微结构研究显示柯浩体通常
围绕着核仁，因此CB最初被描述为核仁附属体
(Hardin et al., 1969)。CB是细胞核的重要组分，是
一个动态结构，并不是在所有的细胞中都能观察
到，它的大小、数量与细胞环境、细胞核内小核核糖
体 核 蛋 白 (small nuclear ribonucleoproteins,
snRNPs)组装水平和RNA合成效率相关(Sleeman
et al., 2001; Lemm et al., 2006)。CB与核糖体密切
相关，它参与核糖核蛋白 (ribnucleoproteins, RNPs)
的合成、snRNP的拼接、端粒酶 (telomerase)活性以
及核糖体核糖核酸 (ribosomal RNA, rRNA)的加工
(Machyna et al., 2013)，并能提高加工的效率
(Staněk and Neugebauer, 2006)，在输送核内小RNA
(small nuclear RNA, snRNA) 进入核质，以及U族
snRNA (UsnRNA)的后期修饰包括2′-氧-核糖-碱基
化和假尿苷化中发挥重要作用 (Jády et al., 2003)。
snRNA在CB中的修饰需要小柯浩体RNA (small
cajal body RNAs, scaRNAs )来指导修饰酶识别正
确的靶序列，scaRNAs是CB的一种变形，它参与
snRNPs的拼接成熟、修饰以及合成过程 (Cioce
and Lamond, 2005)。CB还参与大分子的组装过
程，包括一些转录因子的初加工 (Gall, 2000)，在基
因表达过程中起反调控作用 (Matera, 1998)。
Raška (1991)等在电镜下利用人类自身免疫血清对
哺乳动物细胞核进行免疫荧光标记CB时，发现
coilin特异地定位在 CB上，至此，coilin被公认为
CB的指示蛋白。Coilin能自身互作，并且这种自身
互作是蛋白定位在 CB上所必需的 (Hebert and
Matera, 2000)。
目前，coilin的研究主要集中在基因功能以及
与其它蛋白互作等，对蛋白自身的功能研究偏少。
在对一些敲除和缺失 coilin的动植物体进行研究时
发现，coilin是CB形成和构成必不可少的 (Collier
et al., 2006; Liu et al., 2009; Strzelecka et al., 2010)；
研究还发现，一些人类疾病与CB (coilin) 相关，例
如人类亨廷顿氏病的表型与 CB 密切相关
(Yamada et al., 2001)。在植物体中，一些病毒编码
的蛋白需要借助CB来进入细胞核，从而完成侵染
植物过程的这一重要步骤，如花生丛簇病毒
(Groundnut rosette virus, GRV)编码的ORF3蛋白，先
借助于coilin进入核仁，再与核仁蛋白互作，从而达
到系统侵染的目的 (Kim et al., 2007)。可见，CB在
动植物生长发育以及病毒侵染过程中都发挥着重
要作用，coilin是CB的指示蛋白，对其进行功能预
测和研究，有助于进一步了解CB的功能和作用。
因此，本研究根据NCBI上报道的Atcoilin基因序列
设计引物，利用 RT- PCR方法扩增获得基因的
cDNA，利用生物信息学软件和网站对拟南芥柯浩
体蛋白 (Arabidopsis coilin, Atcoilin) 进行亚细胞定
位分析和功能域预测，通过构建植物表达载体将蛋
白在本氏烟上进行瞬时表达，DAPI染色后在共聚
焦下观察该蛋白的亚细胞定位，旨在为进一步研究
该蛋白的功能提供基础资料。
1结果与分析
1.1 Atcoilin基因克隆
通过RT-PCR方法扩增得到大小约为1 800 bp
的条带 (图1A)，与目的大小一致，回收该片段将其
与入门载体pDNOR221进行同源重组，将重组质粒
进行酶切鉴定后出现大小约为 900 bp条带 (图
1B)，与预期一致，并通过DNA测序证明其正确性，
将其命名为pDNOR221-Atcoilin。
1.2 Atcoilin的生物信息学分析
将测序得到的Atcoilin的基因序列翻译成蛋白
序列后，将该序列输入到CELLO和PSORTⅡ预测
结果 (表1,表 2)显示，Atcoilin定位在细胞核内的
分值极高，分别为0.986和0.941。
通过 PSORTⅡ和 PredictNLS两个服务器，预
测 Atcoilin 与核 定位 信 号 (nuclear localization
localized to the nuclear, encoded 608 amino acids and contained three functional domains (N-terminal ordered
domain, central internal disordered domain and C-terminal domain). Atcoilin had higher homologous in amino
acid with human coilin, and its homology was 50% . The expression of Atcoilin- YFP was also verified by
Western bolting analysis, under the CLSM, Atcoilin- YFP localized in the nuclear. Function prediction and
subcelluar localization analysis can provide the foundation for the further research on coilin.
Keywords Coilin, Protein expression, Functional domain, Cellular localization
拟南芥柯浩体蛋白(Atcoilin)的功能预测及亚细胞定位
Function Prediction and Subcellular Localization Analysis of Atcoilin, Symbolizing Cajal Body, from Arabidopsis 1271
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
表1 CELLO亚细胞定位预测
Table 1 The subcellular localization prediction of Atcoilin
in CELLO
支持向量机SVM
Support vector machine
Amino acid Comp.
N-peptide Comp.
Partitioned seq. Comp.
Physico-chemical Comp.
Neighboring seq. Comp.
定位
Localization
Nuclear
Nuclear
Nuclear
Nuclear
Nuclear
可信度
Reliability
0.934
0.986
0.986
0.775
0.991
定位
Localization
KSEL: ER retention
motif in the C-terminus
ER membrane retention signals
SKL: Peroxisomal targeting
signal in the C-terminus
SKL2: 2nd peroxisomal
targeting signal
RNA-binding motif
Prenylation motif
Dileucine motif in the tail
VAC: Possible vacuolar
targeting motif
NMYR: N-myristoylation pattern
memYQRL: Transport motif
from cell surface to Golgi
NNCN: Reinhardts method for
Nuclear discrimination
结果
Results
none
SQKE
none
none
none
none
none
none
none
none
Prediction: Nuclear
Reliability: 0.941
表2 PSORTⅡ亚细胞定位预测
Table 2 The subcellular localization prediction of Atcoilin
in PSORTⅡ
signal, NLS)相关的氨基酸位点和分布。PSORTⅡ
分析显示，蛋白质有10个潜在的NLS及 3个潜在
的二联体 (bipartite) NLS (图2 A)，而PredictNLS预
测结果显示，蛋白在 163~232位氨基酸残基处 (粗
体标示)有一个典型的NLS (图2 B)。
通过NetPhos2.0服务器对Atcoilin进行磷酸化
位点预测，结果显示，蛋白含有多个磷酸化位点，C
端尤为密集 (图3)。
1.3 Atcoilin的功能域预测与分析
将 Atcoilin 与 人 类 的 coilin (Hascoilin,
GenBank: NP_004636)进行序列比对，结果显示两
者同源性为 50%，其中有 2个高同源性区域，分布
位于N端100个氨基酸位置 (即 aa.5-110)和近C端
100 个氨基酸位置 (Hascoilin 位于 aa 460- 560;
Atcoilin位于aa 410-510) (图4)。
功能域预测结果显示，Atcoilin和Hascoilin类
似，有 3个功能域，第一个区域位于规则折叠的N
端区域 (N- terminal ordered domain, NOD, aa.1-
117)，该区域为蛋白自身互作区 (self-association
domain)；第二个区域为中间无规则折叠区 (central
internal disordered domain, IDD, aa 118-350)，主要
为核定位信号区，包含一个赖氨酸 (Lysine)富集区
(K-Rich domain, aa.202-208)；第三个区域为C端区
域 (C-terminal domain, CTD, aa.351-608)，该区域有
一个类似Tudor功能域 (aa.410-510) (图5)。
1.3 Atcoilin的亚细胞定位分析
1.3.1 Atcoilin植物表达载体的构建
回收图 1B酶切产物 3 600 bp条带，将其与表
达载体pEarley101同源重组，得到重组质粒经PCR
扩增鉴定后，大小约为 1 800 bp的条带，与目的大
小一致 (图6)，将该质粒转化到农杆菌EHA105中，
并进行单菌落 PCR鉴定，得到大小为 1 800 bp条
带 (图6)，说明重组质粒成功转化到EHA105。
1.3.2 Western blot检测Atcoilin的表达
以GFP多克隆抗体为一抗，以碱性磷酸酶标记
4500
3000
1200
800
bp M 1 2
2000
1200
bp1 M 2
A B
图 1 Atcoilin琼脂糖凝胶电泳
Figure 1 Agarose gel electrophoresis analysis of Atcoilin
A：Atcoilin基因扩增；M：DNA标准分子量；1，2：Atcoilin基
因；B：重组质粒 pDNOR221-Atcoilin酶切鉴定；M：DNA分
子量标准；1，2：pDNOR221-Atcoilin MluⅠ单酶切
A: Amplification of Atcoilin gene, M: DNA marker; 1, 2: Atcoi⁃
lin cDNA; B: Identification of recombinant plasmid pD-
NOR221-Atcoilin by enzyme digestion, M: DNA marker; 1, 2:
pDNOR221-Atcoilin digested with MluⅠ
1272
的羊抗兔为二抗来检测本氏烟叶片中GFP和YFP
的表达，图 7显示，仅接种GFP的本氏烟，约在 30
kD处有一明显条带，与 GFP大小一致，而接种
Atcoilin-YFP的本氏烟，在 130 kD处有一明显条
带，与YFP和Atcoilin融合后产生的重组蛋白分子
量大小 (约为 125 kD)一致，对照健康植株在这两
处未出现特异条带，这说明本氏烟叶片中检测到蛋
白条带是外源蛋白特异表达的，并且这些蛋白的表
达是正确的。
1.3.3 Atcoilin在本氏烟叶片表皮细胞中的定位
取接种48 h的本氏烟叶片经DAPI染色后在激
光共聚焦显微镜下观察，图 7显示，pEarley101-
Atcoilin定位细胞核内，并形成大小不等的小点，即
柯浩体CB。
2讨论
Cajal body(CB)是细胞核的一个重要细胞器，
它参与了核糖核蛋白的合成以及一些病毒的运输、
侵染等过程 (Kim et al., 2007)。本研究克隆了拟南
芥的CB的指示蛋白 coilin的基因，对基因编码的
蛋白进行功能域预测，并瞬时表达该蛋白，进而观
察其亚细胞定位情况，所得结果对进一步研究
Atcoilin具有重要意义。
Coilin蛋白具有 2个保守区，一般分别位于N
端和C端，有3个典型的功能域，N端是第一个功能
域，是一个规则的折叠区 (NOD)，Hebert和 Matera
(2000)在对人类 coilin蛋白研究时发现在该功能域
蛋可以自身互作，互作位点位为N端前92个氨基
酸，并且该互作区域是 coilin定位在CB上所必须
的，因此，该区域也可能是Atcoilin自身互作区域。
第二个功能域为中间无规则折叠区 (IDD)，在
aa.202-208位置分布着 7个赖氨酸，赖氨酸富集区
被认为核仁定位信号区。在对GRV编码的ORF3
蛋白功能和亚细胞定位研究中发现，如果缺失或者
突变了赖氨酸富集区后，ORF3蛋白的亚细胞定位
就会发生变化，无法定位在细胞核仁上 (Kim et al.,
2007)，因此本研究认为赖氨酸富集区是Atcoilin蛋
白出现在细胞核的核仁处所必须的。DAPI是一种
可指示细胞核的染料，在激光共聚焦显微镜下经紫
外光源激发后，会使细胞核呈现紫色，因此，本研究
利用DAPI染料确定细胞核的位置，实验结果 (图
8)显示，Atcoilin蛋白定位在细胞核上，这与软件预
测结果完全吻合。C端为Atcoilin的第三个功能
域，该功能域含有“Tudor-like”结构，Tudor功能域
主要在基因表达和多类小RNA调控中发挥重要作
用 (Ying and Chen, 2012)，可以将其分成4大类，其
中第 2大类主要负责 snRNP 的的装配和合成
NUCDISC: Discrimination of nuclear localization signals
Pat 4: KKKK (5) at 90
Pat 4: KKRK (5) at 163
Pat 4: KRKK (5) at 175
Pat 4: KKKK (5) at 202
Pat 4: KKKK (5) at 203
Pat 4: KKKK (5) at 204
Pat 4: KKKK (5) at 205
Pat 4: RRKK (5) at 262
Pat 4: KKPK (4) at 530
Pat7: PMTKSKR (3) at 227
Biparitite: KKPKTSSKNQSTKRKKC at 163
Biparitite: KRKTSSKNQSTKRKKCK at 164
Biparitite: RKTSSKNQSTKRKKCKL at 165
Content of basic residues: 16.0%
NLS Score: 4.35
A
MEEEKVRVRLVFEDRRILSKYQKKQGLTRSWVVLNRKCHRTI
SEFSDHIFHTFSLCEACPHGLSLSMEGFVLPPFESSCVLKDK
DIVCVKKKKESLLEIVGEDSDENVYNAIEVEERPQIRPGEML
LANEEFQKETGGYESESEEDELEEEAEEFVPEKKASKKRKTS
SKNQSTKRKKCKLDTTEESPDERENTAVVSNVVKKKKKKKSL
DVQSANNDEQNNDSTKPMTKSKRSSQQEESKEHNDLCQLSAE
TKKTPSRSARRKKAKRQWLREKTKLEKEELLQTQLVVAPSQK
PVITIDHQATKEKHCETLENQQAEEVSDGFGDEVVPVEVRPG
HIRFKPLAGTDEASLDSEPLVENVLWNGNMTKKKGQKWGTEK
SGFSKRYAQDFNEDATTQPAEAETLANCPIDYEQLVAYTGSV
KKGDVIAYRLIELTSSWTPEVSSFRVGKISYYDPDSKMVTLM
PVQEFPIEKKTEEDDDFCMQPDTSLYKEDGSLEIEFSALLDV
RSVKTSSSDSAEVAKSALPEPDQSAKKPKLSANKELQTPAKE
NGEVSPWEELSEALSAKKAALSQANNGWNKKGSSSGGSWSYK
ALRGSAMGPVMNYLRSQKEI
B
图 2 PSORTⅡ(A)和PredictNLS(B)预测的Atcoilin核定位信号
Figure 2 Nuclear localization signal prediction of Atcoilin in PSORTⅡ(A) and PredictNLS(B)
加粗字母：核定位信号
Bold letters: Nuclear localization signal
拟南芥柯浩体蛋白Atcoilin的功能预测及亚细胞定位
Function Prediction and Subcellular Localization Analysis of Atcoilin, Symbolizing Cajal Body, from Arabidopsis 1273
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
1
0
0 100 200 300 400 500 600
图 3 Atcoilin磷酸化位点分析
Figure 3 Phosphorylation site analysis of Atcoilin
Serine:丝氨酸; Threonie:苏氨酸; Tyrosine:酪氨酸; Threshold:阈值
图 4拟南芥 coilin与人类 coilin的氨基酸序列同源性
Figure 4 Amino acid sequence alignment between Atcoilin and Hascoilin
Block1和Block2：高度保守区；红色：全部匹配；紫色：带错配的特定匹配；蓝色：带空位的特定匹配。A:丙氨酸; C:半胱氨
酸; D:天冬氨酸; E:谷氨酸; F:苯丙氨酸; G:甘氨酸; H:组氨酸; I:异亮氨酸; K:赖氨酸; L:亮氨酸; M:甲硫氨酸; N:天冬酰
胺; P:脯氨酸; Q:谷酰酰胺; R:精氨酸; S:丝氨酸; T:苏氨酸;V:缬氨酸;W:色氨酸; Y:酪氨酸
Block1 and Bolck2: Highly conserved regions; shading mode red:all match; Purple: Special match with mismatch; Blue: Special
match with gaps. A: Ala; C: Cys; D: Asp; E: Glu; F: Phe; G: Gly; H: His; I: Ile; K: Lys; L: Leu; M: Met; N: Asn; P: Pro; Q: Gln;
R: Arg; S: Ser; T: Thr; V: Val; W: Trp; Y: Tyr
序列位点
Sequence position
磷
酸
化
评
估
Ph
os
ph
or
yl
at
io
n
po
te
nt
ia
l
Block1
Block1
Block2
Block2
1274
(Brahms et al., 2001)，有研究结果表明 CB参与
snRNP合成 (Machyna et al., 2013)，因此，该区域可
能参与了 snRNA的装配和合成，可能在病毒侵染
过程中发挥着重要作用。最近研究表明，coilin的
磷酸化位点与CB的形成密切相关 (Carrero et al.,
2011)，因此本研究还分析了该蛋白的磷酸化位点，
预测该蛋白在C端富集磷酸化位点 (图3)，而这一
部分也将是今后研究的重点。
Western bolt检测蛋白时发现Atcoilin的分子
量大概为95 kD，比理论预测的分子量69 kD大，这
种情现象也存在于其他生物体coilin中，如人类、老
鼠 (Tucker et al., 2000; Liu et al., 2009)。蛋白的高
级结构往往会影响蛋白的迁移速度，即影响蛋白的
分子量，Atcoilin的第2个功能域为无规则折叠区，
一定程度上影响了蛋白的高级结构。coilin实际分
子量与理论预测值不符，也可能与目前只是通过生
物学软件来预测蛋白的折叠和高级结构，coilin蛋
白晶体未获得，还不能准确直观地反映蛋白结构相
关 (Shanbhag et al., 2010)。
CB在细胞学上发挥着重要作用，coilin作为
CB的指示蛋白，越来越引起研究者的兴趣。本研
究对模式植物拟南芥coilin蛋白功的功能域及其亚
细胞定位进行了预测和分析，有利于后续深入开展
该蛋白功能的研究。
3材料与方法
3.1供试植株、菌株、载体及试剂
入门载体pDNOR221、表达载体pEarley101由
加拿大农业部王爱民博士赠送，表达载体35S-GFP，
大肠杆菌 (Escherichia coli) DH5α菌株、农杆菌
(Agrobacterium tumefaciens) EHA105菌株以及本氏
烟 (Nicotiana benthamiana)种子由本实验室保存。
RNA提取试剂盒 (EasyPure Plant RNA Kit)、反
转录试剂盒 (TransScript Ⅱ First- Strand cDNA
Synthesis SuperMix)、Taq 酶 (TransStart TopTaq
DNA Polymerase)、质粒提取试剂盒 (EasyPure
HiPure Plasmid MaxiPrep Kit) 和DNA回收试剂盒
(EasyPure Quick Gel Extraction Kit) 购于北京全式
金生物技术有限公司，限制性内切酶MluⅠ购于宝
生物工程 (大连)有限公司，BP ClonaseTMⅡEnzyme
Mix和LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix购于 Invitrogen
图5拟南芥coilin的功能域分析
Figure 5 Functional domain analysis of Atcoilin
NOD：N端规则折叠区；IDD：中间无规则折叠区；CTD：C端区
NOD: N-terminal ordered domain; IDD: Central internal disordered domain; CTD: C-terminal domain
2000
1200
bp 1 M 2 3 4 5
图 6重组质粒鉴定
Figure 6 Identification of recombinant plasmids
1：对照；M：DNA分子量标准；2，3：重组质粒Atcoilin-YFP
(大肠杆菌DH5α中)；4，5：重组质粒Atcoilin-YFP (农杆菌
EHA105中)
1: CK; M: DNA marker; 2, 3: Recombinant plasmid Atcoilin-
YFP (in E.coli H5α); 4, 5: Recombinant plasmid Atcoilin-YFP
(in A.tumefaciens EHA105)
130
35
25
1 2 M 3 kD
图 7 Western blot检测本氏烟叶片中蛋白表达
Figure 7 Western bloting analysis of protein expression in
Nicotiana benthamiana leaves
1：对照；2：35S-GFP；M：蛋白分子标准量；3：Atcoilin-YFP
1: CK; 2: 35S-GFP; M: Protein marker; 3: Atcoilin-YFP
拟南芥柯浩体蛋白Atcoilin的功能预测及亚细胞定位
Function Prediction and Subcellular Localization Analysis of Atcoilin, Symbolizing Cajal Body, from Arabidopsis 1275
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
公司(美国)，引物合成和GFP多克隆抗体制备由南
京金斯瑞生物科技有限公司完成。碱性磷酸酶标
记羊抗兔 IgG购于Sigma公司(美国)，BCIP/NBT显
色试剂盒购于成都贝斯特试剂有限公司。
3.2方法
3.2.1 Atcoilin亚细胞定位及核定位信号预测
Atcoilin亚细胞定位通过在线工具 CELLO
(http://cello.life.nctu.edu.tw/) 和 PSORT Ⅱ (http://
www.http://www.psort.org/) 进行预测；核定位信号
(Nuclear location signals, NLS)使用PSORTⅡ(http:
//www.http://www.psort.org/) 和 PredictNLS (https://
www.predictprotein.org/) 进行预测分析；利用
NetPhos2.0 工 具 (http://www.cbs.dtu.dk/services/
NetPhos/)预测蛋白潜在的磷酸化位点；蛋白功能域
通过在线服务器 I-TASSER (http://zhanglab.ccmb.
med.umich.edu/I-TASSER/)服务器进行分析。
3.2.2 Atcoilin cDNA ORF的克隆
取 0.1 g拟南芥叶片，经液氮迅速研磨后按试
剂盒说明书完成RNA的提取，按反转录试剂盒说
明书合成 cDNA第一链。根据GenBank中报道的
Atcoilin的序列 (GenBank: AY128933) 设计一对特
异性引物(划线部分为同源重组序列)：
Atcoilin-GF：5-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGG
C TTCATGGAGGAAGAGAAGGTGAG-3，
Atcoilin- GR：5- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGG
GTCAATCTCTTTCTGAGATCTG-3。
以RNA反转录产物 cDNA第一链为模板进行PCR
扩增，其中扩增体系为 25 μL体系：cDNA 1 μL；引
物(10 μmoL)各1 μL；10×TransStartTM TopTaq Buffer
2.5 μL；2.5 mmol/L dNTPs 2 μL；TransStartTM
TopTaq DNA Polymerase 0.5 μL，DEPC水补足 25
μL；扩增条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，
55℃退火 30 s，72℃延伸 2 min，共 35个循环；最后
72℃终延伸10 min。扩增产物通过1%琼脂糖凝胶
电泳鉴定，回收与目的条带 (约 1 800 bp)，按 BP
ClonaseTMⅡ Enzyme Mix说明书操作，将回收条带
与入门载体pDNOR221进行同源重组，并将重组产
物转化到DH5α中，卡那霉素抗性平板筛选培养，挑
选单菌落摇菌并提取质粒，经MluⅠ酶切鉴定正确
后，委托南京金斯瑞生物技术有限公司测序。
3.2.3表达载体Atcoilin-YFP的构建
将测序正确的质粒Atcoilin-YFP进行MluⅠ单
酶切，回收条带大小为 3 600 bp左右的条带，根据
LR ClonaseTM Ⅱ Enzyme Mix说明书操作，将回收
条带分别与 pEarley101同源重组后转化到DH5α
中，卡那霉素抗性平板筛选培养，挑取单菌落摇菌
并提取质粒，通过PCR鉴定。将鉴定正确的重组
质粒通过液氮冻融法转化到EHA105中，卡那霉素
和利福平抗性平板筛选培养，挑取单菌落，进行菌
落PCR鉴定。
3.2.4 Atcoilin-YFP在本氏烟叶片表皮细胞中的瞬
时表达与细胞定位
将携带了Atcoilin-YFP的农杆菌在 28℃条件
下，含有0.05 mg/ L的卡那霉素和0.05 mg/ L利福平
的LB液体培养基中培养至对数生长期，取1 mL菌
液 12 000 r/min(离心半径 9.5 cm)离心 1 min，弃菌
液，底部菌体用悬浮液 (10 mmol/L MES pH 5.6, 10
mmol/L MgCl2, 和 150 μmol/L乙酰丁香酮) 悬浮 2
A B C
图 8本氏烟表皮细胞DAPI荧光标记
Figure 8 DAPI fluorescent labeled epidermis cells of Nicotiana benthemiana
A：Atcoilin-YFP；B：DAPI荧光染色；C：A和B叠加
A: Atcoilin-YFP; B: DAPI fluorescence stain; C: Overlap A and B
1276
次后，用悬浮液调整菌液浓度至OD600=0.6~0.8，室
温放置3 h。用1 mL注射器吸取适量菌液，一手按
住叶片，一手用无针头的针管从本氏烟叶片背部将
菌液慢慢注入叶片组织空隙中，浸润接种的植株于
25℃暗培养，48 h 后在激光共聚焦显微镜下
(Microsystems CMS GmbH Leica TCS SP5)观察融
合蛋白的亚细胞定位结果，并通过DAPI染色确定
细胞核的位置。
3.2.5本氏烟总蛋白提取及Western blot检测
取接种3 d的本氏烟叶片0.3 g，用液氮研磨成
细粉 (健株为对照)，加入 1 mL蛋白提取蛋白缓冲
液 (50 mmol/L phosphate pH 8.0, 10 mmol/L Tris
pH 8.0, 500 mmol/L NaCl, 0.1% Tween20, 0.1% β-
巯 基 乙 醇, 1 mmol/L PMSF, Roche Protease
inhibitor cocktail MINI tablet 1片/10 mL)，研磨数分
钟，移入1.5 mL离心管，4℃，12 000 r/min(离心半径
9.5 cm)离心 10 min，吸上清至新离心管中，4℃，12
000 r/min(离心半径 9.5 cm)离心 10 min，吸上清至
新离心管，完成总蛋白的提取。
取适量提取纯的蛋白与 5×SDS-PAGE loading
buffer混匀后，经98℃煮沸5 min处理，在12% SDS-
PAGE上进行电泳，电泳结束前20 min，将PVDF膜
在甲醇中浸润 10 s后，转移至电转缓冲液中浸润
20 min，待电泳结束后，将凝胶转移到膜上，通过湿
转转膜仪转膜 (80 V, 45 min)，转膜结束后，取出
PVDF膜，用 1×PBST清洗 3次 (5 min/次)，加入封
闭液，37℃，50 r/min，1 h，用1×PBST清洗膜3次，加
入GFP抗体孵育 (37℃, 50 r/min, 1 h), 用 1×PBST
清洗膜 3次，加入二抗 (羊抗兔) 孵育 (37℃, 50 r/
min, 1 h)，用 1×PBST清洗膜 3次，参照BCIP/NBT
显色试剂盒，在AP碱性磷酸反应缓冲液中加入等
量底物显色溶液BCIP/NBT避光显色 (10~20 min)。
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高粱全基因组测序的完成揭示了未被发现的宝贵遗传资源
Whole-genome Sequencing Reveals Untapped Genetic Potential in Africas Indigenous
Cereal Crop Sorghum
随着世界人口不断增长，全球粮食需求成为未来世界的一大挑战。农业资源的不断减少和气候环境的不断恶化更加
剧了这种形式的严峻性。而高粱是一种能够适应高温和干旱气候的粮食和饲料作物，同时也是世界最贫穷非洲地区 5亿
人口的主食，也是重要的生物燃料能源作物，因此在这场战争中起着重要的作用。由于高粱具有较小的二倍体基因组及
表型的多样性使得它成为较理想的C4模式作物从而与C3作物水稻的一些特点互补。
要想对高粱进行深入的挖掘，必须了解其基因组水平上的遗传多样性。近期，澳大利亚昆士兰大学与中国华大基因
等研究单位的研究人员对高度具有代表性且覆盖多个地里区域的 44个不同的高粱品系进行了高通量全基因组测序研
究。这也是首次对拟高粱的基因组重测序实验。重测序产生了717 Gb的数据，通过进一步拼接组装得到了全长约700Mb
的基因组序列。通过对基因组序列的分析，他们发现高粱具有一些其他谷类作物所不具有的独特的未被发现的遗传资
源。不同的高粱品种都具有很强的种间结构差异和复杂的驯化过程，包括至少发生两次驯化事件。最重要的是他们发现
现在的高粱栽培品种是部分样品的种间变化而来的。大量的未发现的多样性遗传资源同时存在于高粱和拟高粱作物
中。由于人类的参与，使得多种作物，如玉米，水稻和大豆等等经过长期驯化都具有一系列相似的特点，仅有低水平的遗
传多样性发生。而这次实验数据的比较为研究人类的筛选对于野生型与栽培品种带来的遗传多样性的影响提供了重要
的资源。
该研究于近期发表于《Nature Communications》期刊上，高粱全基因序列及相关的数据对于高粱及其他谷类作物的遗
传育种工作提供了无可比拟的遗传资源。
编者：吴慧玲(北京市农林科学院植环所)，本刊通讯员
本文引用格式：吴慧琳，2013.高粱全基因组测序的完成揭示了未被发现的宝贵遗传资源.农业生物技术学报,21(11)：1278
信息来源：Nature Communications | 4:2320 | DOI: 10.1038/ncomms3320 |www.nature.com/naturecommunications
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