全 文 ：片等不同商品规格　不同规格的商品茸片来源于鹿
茸药材的不同部位 ,蜡片切自角尖部 ,粉片源自鹿茸
上段 ,而白纱片和红纱片分别切自中段上部和下部 。
为了考查目前商品茸片的质量状况 ,我们对不同产
地不同商品规格的鹿茸片中的次黄嘌呤进行了含量
测定。在 10批鹿茸药材中 , 次黄嘌呤的含量为
0.0968 ～ 0.4175 mg /g,其中 ,以粉片所含次黄嘌呤
的量最高 ,含量为 0.3918 ～ 0.4175 mg /g,由此可推
断 ,次黄嘌呤富集在制成粉片的鹿茸药材部位 。纱
片分白纱片和红纱片 ,次黄嘌呤的含量白纱片为
0.1038 ～ 0.1526mg /g, 红纱片为 0.0968 ～ 0.1311
mg /g,这与传统评价蜡片 、粉片质优 ,纱片 、骨片依
次渐次的质量经验结论相符。
新疆产鹿茸片按等级区分 ,一级高于二级 ,其含
量与吉林 、辽宁产的纱片相近 。以次黄嘌呤的含量
为指标 ,吉林产的梅花鹿茸药材与辽宁产的梅花鹿
茸药材品质相近 ,新疆产的马鹿茸药材次之。
参 考 文 献
1　江苏新医学院 .中药大辞典 .上海:上海科学技术出版
社 , 1977∶644
2　刘松青 ,等 .高效液相色谱法测定地龙中次黄嘌呤和黄
嘌呤的含量 .中草药 , 1990, 21(7)∶15
3　刘丽芳 ,等 .H PLC法测定 10种动物药中次黄嘌呤 、黄嘌
呤 、尿嘧啶 、脲苷的含量 .中国中药杂志 , 1999, 24(2)∶
73
4　李伟 ,等 .HPLC测定地龙中次黄嘌呤 、黄嘌呤 、尿嘧啶 、
尿苷的含量 .中药材 , 1996, 19(12)∶625
5　罗兰 ,等 .五灵脂中四种核苷 、碱基类成分的 HPLC法分
析研究 .基层中药杂志 , 1998, 12(2)∶45
6　赵晓莉 ,等 .HPLC法测定海马中次黄嘌呤和黄嘌呤的含
量 .中药材 , 2002, 25(10)∶716
7　阮婧华 ,等 .毛细管区带电泳法同时测定冬虫夏草中多
种核苷及其碱基的含量 .沈阳药科大学学报 , 2002, 19
(2)∶112
(2005 - 03 -14收稿)
药理
半边旗提取物 5F影响高转移卵巢癌细胞
HO-8910PM细胞周期的实验研究
何太平 1　何振辉1　莫丽儿2　梁念慈 1
(1.广东医学院生物化学与分子生物学研究所 ,广东湛江 524023;2.广东天然药物研究与开发重点实验
室 ,广东湛江 524023)
　　摘要　目的:探讨半边旗提取物 5F对人高转移卵巢癌细胞 HO-8910PM细胞周期的影响及其作用机制。方
法:以 MTT法检测 5F对高转移卵巢癌细胞 HO-8910PM细胞增殖的影响;流式细胞术分析 5F对 HO-8910PM细胞
周期的影响;W este rn blot法分析 NF-κB(P65)、FAK的表达及 FAK酪氨酸磷酸化水平。结果:不同浓度的 5F分别
处理细胞 24 h后 ,对 HO-8910PM细胞增殖有明显的抑制作用;流式细胞术分析表明 5F使 G
0
/G
1
期的细胞减少 ,阻
断细胞于 G 2 M/ 期;同时 , 5F可使 NF-κB(P65)的表达下调 ,上调 FAK的表达 , 并降低 FAK酪氨酸磷酸化水平。结
论:5F对 HO-8910PM 细胞周期的影响与 NF-κB(P65)表达下调及 FAK的表达上调有关。
关键词　半边旗提取物;蛋白表达;细胞周期;卵巢癌
　　半边旗又名半边莲 、半边菊 ,属凤尾蕨科植物 ,
广泛分布于南方各省 ,功效清热解毒 、利水消肿 ,民
间常用于治疗疳积 、风湿痛等 。 5F是从中药半边旗
中提取的一种二萜类化合物 ,其化学名为 11α-羟基-
15-氧-16-烯-ent-贝克杉烷-19酸 ,分子式为 C20H28
O 4 ,分子量为 332.434。本课题组在前期研究中发
现 5F具有明显的抗肿瘤活性 ,能抑制 RB磷酸化 ,
增强 K562细胞 MAPK 的活性及表达 〔1〕 , 并影响
K562细胞中 bcl-2、 bax、 c-jun、 c-fos癌基因的表
达〔2〕。本文采用流式细胞术研究 5F对 HO-8910PM
细胞周期影响的同时选用蛋白印迹的方法研究 5F
对核因子 κB P65亚基 (nuclear factor-kappaB P65
subun it)和焦点粘附激酶 ( foca l adhesion kinase,
FAK)蛋白表达及 FAK酪氨酸磷酸化水平的影响 ,
探讨 5F影响细胞周期的作用机制。
1　材料与方法
1.1 　实验材料 　人高转移卵巢癌细胞 (HO-
8910PM)购自上海细胞生物所 ,由浙江省肿瘤研究
672 中药材第 28卷第 8期 2005年 8月
DOI牶牨牥牣牨牫牳牰牫牤j牣issn牨牥牥牨牠牬牬牭牬牣牪牥牥牭牣牥牳牣牥牨牳
所许沈华等 〔3〕建立 。细胞于 10%小牛血清 , 100 u /
m l青霉素和 100 μg /m l链霉素的 RPM I-1640完全
培养基中 , 37℃、5%CO2 、饱和湿度孵箱培养 。细胞
经过消化传代 ,取对数生长期的细胞进行培养 。
1.2 　药品与试剂　超级小牛血清购自杭州四季青
公司;RPM I-1640培养基购自 G ibco公司;NF-κB
(P65)小鼠 IgG单抗 、FAK小鼠 IgG 单抗 、 p-FAK
(PY99)小鼠 IgG单抗 、β-actin山羊 IgG多抗购自
San ta C ruz公司 ,使用时用 TBS溶液按 1∶200 ～ 1∶
2000稀释;辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠 IgG、辣
根过氧化物酶标记马抗山羊 ΙgG ,购自北京中山公
司 ,使用时用 TBS溶液按 1∶4000 ～ 1∶10000稀释;半
边旗提取物 5F由广东医学院天然药物开发中心提
供 ,实验前 5F用 DMSO溶解 ,培养液稀释 , DMSO终
浓度为 0.1%(实验证明该浓度对细胞无影响 )。
1.3 　方法
1.3.1　MTT法测定 5F作用 24 h后对 HO-8910PM
细胞增殖的影响:选取对数生长期的 HO-8910PM细
胞 ,经胰酶消化 、台盼蓝染色后在血球计数板上计
数 ,确保活细胞在 97%以上 。调整细胞浓度按 8
000个 /孔 (100 μl每孔)加到 96孔培养板中。将培
养板放入 37℃、5%CO 2孵箱中培养 。待细胞贴壁
后取出培养板加入不同浓度 5F 1 μl,使其终浓度分
别为 6.25、12.5、25、50、100、200 μmo l /L,每个浓度
设 3个平行孔;同时设置空白对照组 、溶剂对照组和
调零孔 。培养板放回孵箱继续培养 24 h,取出培养
板以每孔 50 μg(10μl)加入 MTT,培养板再放回孵
箱孵育 4 h。吸出上清液 ,加入 200 μl二甲基亚砜 。
在平板摇床摇 10 m in ,用甲臜完全溶解。酶标仪测
570 nm波长处每孔的吸光度 (A)值 。
　　细胞增殖抑制率(IR)=[ (对照组 A值 -处理
组 A值 ) /对照组 A值 ] ×100%。
1.3.2　流式细胞术分析细胞周期:5F作用 HO-
8910PM细胞 24 h后 ,收集细胞 , 1000 rpm /m in离心
5 m in,弃上清液 , PBS清洗 1次 ,离心去 PBS,加入预
冷的 70%乙醇 , 4℃固定 24 h以上 。离心去乙醇 ,
PBS清洗 1次 ,离心弃去 PBS ,加 0.5m l50μg /m lPI
(含 100 μg /m l RNase A)于避光处染色 30 m in,用
Cou lte r EPTCSXL-31240流式细胞仪进行检测 。
1.3.3　W este rn blot检测蛋白表达:取对数生长期
的 HO-8910PM细胞 ,稀释成 1 ×106 /m l,接种于 50
mm的培养皿中培养 ,每皿 5 m l。待细胞贴壁后 ,分
别以 PBS、0.1%DMSO和终浓度分别为 25、50、100
μmo l /L的 5F处理 HO-8910PM 细胞 24 h, 收集细
胞 , PBS洗涤 2次 ,加入预冷的细胞裂解液 100 μl,
用细胞刮将细胞刮下 ,并转移至预冷的 1.5 m l离心
管中 , 置于碎冰上冰育 20 m in后 , 于 4℃, 12000
rpm /m in离心 15m in。上清液转移至另一 1.5m l离
心管中 ,用考马斯亮蓝微盘比色法 〔4〕测定蛋白质含
量。相同含量的蛋白样品和 4×上样缓冲液以体积
比 3∶1的比例混合 , 100℃水中煮沸 5 m in使蛋白质
变性 。 SDS-PAGE电泳后电转移至 PVPF膜上 , 5%
脱脂牛奶封闭后加入第 1抗体于室温孵育 2 h,用
TBS缓冲液洗涤 3次 ,每次 10 m in,加入第 2抗体于
室温孵育 2 h ,再用 PBS缓冲液洗涤 3次 ,每次 10
m in,加入发光试剂 (ECL)显色 ,以 β-ac tin作内参 ,
用图像分析软件 Scion Image进行光密度积分值分
析。
1.3.4 　统计学处理:实验数据以 –x ±s表示 ,采用
SPSS11.0统计软件包 One-Way Anova与 Bon-ferron i
(方差齐 )或 Tamhane′s T2(方差不齐 )检验进行统
计学处理 。
2　结果
2.1　MTT法测定 5F作用 24 h后对 HO-8910PM
细胞增殖的影响　分别用 0 ～ 200 μmol /L的 5F作
用 HO-8910PM细胞 24 h后 , MTT法测定细胞增殖
抑制率 ,结果表明 , 5F能明显抑制 HO-8910PM细胞
的增殖 ,并有剂量效应关系 ,结果见表 1。
　表 1　　　　　5F作用 24 h后对 HO-8910
PM细胞增殖的影响
Group Concen tra tion(μm o l /L) Inhibito ry ra te(%)
contro l 　0.00±0. 36
0.1%DMSO - 4.76±1. 32
5F 6.25 21.03±1. 78**
12.5 26.40±0. 64**
25 29.94±0. 81**
50 36.82±5. 44**
100 43.84±3. 07**
200 52.05±5. 14**
　　** P<0. 01 com pared w ith con trol
2.2　流式细胞术分析 5F对细胞周期的影响　分
别用 PBS (Contro l)、 0.1% DMSO 和 25、 50、 100
μmo l /l 5F作用于 HO-8910PM细胞 24 h后 ,收集各
组细胞 ,用流式细胞仪检测 DNA含量发现:5F使
G0 /G 1期细胞减少 , G 2 M/ 期细胞增多 ,结果见表 2,
图 1。
2.3 　5F作用 HO-8910PM 细胞 24 h后对 NF-κB
(p65)、FAK蛋白表达及 FAK酪氨酸磷酸化水平的
影响　分别用 PBS , 0.1%DMSO和终浓度为 25、50、
100 μmo l /L的 5F处理 HO-8910PM 细胞 24 h后 ,
673 中药材第 28卷第 8期 2005年 8月
W estern blot分析目的蛋白的表达。结果发现 , 5F
能够明显抑制细胞 NF-κB(P65)蛋白的表达 ,并上
调 FAK蛋白的表达 ,轻微降低 FAK酪氨酸磷酸化
水平 , 大幅降低 FAK酪氨酸磷酸化程度 (p-FAK /
FAK),见图 2、3。
3 　讨论
细胞周期包括 G1期 、S期 、G2期和 M期 。细胞
　表 2　5F作用 24 h后对 HO-8910PM细胞周期的影响
G roup
Concentrion(μmo l /L) %(G 0 /G1)
%(G
2
M/ ) %(S)
contro l 64. 9 15. 7 19. 4
0. 1%DM SO 68. 5 14. 1 17. 5
5F 25 64. 1 19. 9 16. 0
50 58. 2 24. 1 17. 8
100 43. 3 32. 1 24. 6
在正常状态下沿上述时相演进并发生相应的形态学
变化 。随着人们对细胞周期的调控更加深刻的认
识 ,发现细胞周期有两个重要的时相转移:G 1→S和
G2→M ,分别在它们的转接点 G 1→S及 G2→M上设
有各自的 “检查点”(checkpo int),从而严格控制 “关
图 2　5F作用 HO-8910PM 细胞 24 h后对 NF-κB
(P65)、FAK表达和 p-FAK水平的影响
图 1　5F对 HO-8910PM细胞周期的影响
A. contro l　B. 0.1%DM SO　C. 25 μm o l /L 5F　D. 50 μm o l /L 5F　E. 100μmo l /L 5F
674 中药材第 28卷第 8期 2005年 8月
图 3　5F作用 24 h后 p-FAK /FAK变化的图像分析
卡 ”的通行 ,实现对细胞周期的调控。前者位于 G1
期末 ,在此刻 DNA合成起始至 DNA合成完成 (S
期 );后者是 M期进入点 ,此时染色体开始凝集 ,至
姐妹染色单体分离 。同分裂的正常细胞一样 ,肿瘤
细胞也经历细胞周期的各个时期 ,但是滋长中的癌
细胞却能以极快的速度通过细胞的周期 ,导致癌细
胞恶性增殖 。因此寻求有效的控制肿瘤细胞周期的
药物 ,是提高肿瘤治疗效果的有效途径之一。
NF-κB是一类几乎存在于所有细胞内 ,能与多
种基因的启动子或增强子中 NF-κB结合位点发生
特异性结合并启动基因转录的一组转录调节因子 。
NF-κB是由亚单位 P50和 P65组成的异源二聚体 ,
P50与 DNA直接结合 , P65具有转录活性 。静息状
态下 , NF-κB与抑制性蛋白 I-κB结合滞留于细胞浆
中 ,在一定刺激作用下 I-κB解离 , NF-κB释放 ,进入
细胞核激活靶基因。已有研究表明 , NF-κB通过干
扰细胞周期 “关卡 ”有关的调控因子 、周期素 、周期
素依赖性激酶 (CDK s)和 CDK s的抑制物等的作用
而抑制肿瘤细胞的增殖。 Pozarow sk i P〔5〕发现 NF-
κB的特异性抑制剂 Partheno lide(一种倍半萜化合
物 )能明显抑制 HL-60细胞的增殖 ,阻断细胞于 G 2 /
M期 。K altschm id tB〔6〕等用长春新碱处理野生型的
He la细胞和过表达 I-κBα的 Hela细胞均能抑制
He la细胞的增殖 。流式细胞术检测发现 ,两种细胞
均被阻断于 G 2 M/ 期 ,由于 NF-κB的活性或表达受
到抑制 ,从而影响靶基因 CDK1、CDK2、Cdc2、P53和
P21(细胞周期引擎 CDK的抑制物 )等的表达。研
究表明 ,在 G1期 DNA受到损伤时 ,可以引起 P53的
积累和活化 , P53则诱导 P21的转录。 P21蛋白结
合在 Cdk4 /6或 Cdk2上 ,造成 G1期的休止。最近
又发现 , P53和 P21的活性对维持 G 2期的休止也是
必需的 。本研究表明 , 5F明显阻断 HO-8910PM细
胞周期于 G2期 ,不阻断细胞于 G 1 /S期 ,可能的原
因与 5F(一种二萜类化合物 )的化学结构有关 ,另外
还与 5F通过抑制 NF-κB的表达 ,调控与 G2 M/ 检查
点相关蛋白的表达及活性有关 ,具体的作用机制有
待于更深入的研究 。
细胞生长及存活大多需要粘附于细胞外基质
(ECM),若阻止细胞粘附 ,则引起细胞生长阻滞或
凋亡 。近年研究表明 , FAK在整合素介导 ECM 分
子向细胞内传递信号的过程中起关键性作用 。整合
素是 ECM主要成分纤维粘连蛋白 (FN)及层粘连蛋
白(LN)间相互作用的膜受体 ,当细胞与 ECM粘连 ,
整合素聚集成簇后 ,将 ECM与细胞内骨架蛋白相
连 ,焦点粘附激酶(FAK)磷酸化 ,并产生一系列 SH2
区域的调节蛋白如 pax illin、C rk、G rb2等 , C rb2和 C rk
激活丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)传导通路 ,进而
影响细胞周期的进展。 Zhao JH〔7〕等的研究发现 ,过
表达的 FAK能促使 CHO细胞从 G 1细胞向 S期快
速过渡 ,从而加快细胞周期的进展。 Heinz R〔8〕等的
研究表明 Y392位酪氨酸磷酸化的 FAK通过与 Src
形成复合物 , 而不是与 PI-3K 形成复合物阻断
N IH3T3和 HEK293T细胞周期的进展 。本次研究结
果表明 5F能够明显上调 FAK蛋白的表达 ,轻微降
低 FAK酪氨酸磷酸化水平 ,大幅降低 FAK酪氨酸
磷酸化程度 (p-FAK /FAK)。其阻断 HO-8910PM细
胞于 G 2 M/ 期的原因可能是由于 5F上调 FAK的表
达 ,使细胞快速通过 G 1 /S期 ,而 FAK酪氨酸磷酸化
程度的降低估计能使细胞停留于 G2 M/ 期 ,其中的
机制需要进一步明确。
基金项目:国家自然科学基金资助课题(No 39870900)
参 考 文 献
1　王京滨 , 等 .半边旗中二萜类化合物 5F对 K562细胞
MAPK活性 、表达的影响 . 中国药理学通报 , 2002, 18
(3)∶294
2　王京滨 ,等 .半边旗中二萜类化合物 5F对 K562细胞几
种癌基因表达的影响 .中国药理学通报 , 2002, 18(4)∶
418
3　许沈华 ,等 .高转移人卵巢癌细胞系 HO-8910PM的建立
及其生物学特性 .中华病理学杂志 , 1998, 27(6)∶451
4　王多宁 ,等 .考马斯亮蓝微盘比色法测定蛋白质含量 .
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and independent dea th o f HL-60 and Jurkat cells treated
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2003, 2(4)∶377
6　Kaltschm idt B, e t a l.Repression o fNF-kappaB impa irsH eLa
cell pro lifera tion by functional interference w ith ce ll cyc le
checkpo int regu la to rs.Oncogene, 1999, 18(21)∶3213
7　Zhao JH , e t al.Regulation o f the ce ll cy cle by focal adhe sion
675 中药材第 28卷第 8期 2005年 8月
k inase. J C ell B io l, 1998, 143(7)∶1997
8　Re iskeH R, et a l.Ana lysis of FAK-assoc iated signa ling pa th-
w ays in the regu la tion o f ce ll cyc le prog ression. FEBS Lett,
2000, 486(3)∶275
(2005 - 03 -03收稿)
Study on the Effect and ItsM echanism s of5F from P teri sem ipinnata L.
on the Cell Cyc le ofH ighlyM etastaticO varian CarcinomaHO-8910PM Cells
H e Taiping1 , H e Zhenhu i1 , M o L ier2 , L iang N ianc i1
(1. Institu te o f Biochem istry andM o lecu la rB io logy, GuangdongM ed ica lCo llege, Zhan jiang, Guangdong 524023;2.Guangdong Key La-
boratory fo rResea rch and Developm en t o f Natura l D rugs, Zhanjiang, Guangdong 524023)
Abstrac t　Objective:To study the e ffec t and its po ssib le m echanism o f 5F from P teri sem ipinnata L on the ce ll cy cle o f hum an
highly me tasta tic ovarian carc inom aHO-8910PM ce lls.M ethods:M TT assay was used to exam ine the effec t o f 5F on pro liferation o fHO-
8910PM cells after 24 hou rs treatment;The ce ll cy cle w as asse ssed by flow cy tome try (FCM);The expression leve l of NF-κB(p65)、
FAK and the leve l of phosphory la ted FAK w ere asse ssed byW estern blo t analysis.Resu lts:5F from P teris sem ipinnata L. cou ld inhibit
the pro liferation of HO-8910PM ce ll and b lock the ce ll cyc le at G 2 M/ phase. The expression leve l o f NF-κB(P65) pro tein dec reased
obviously in HO-8910PM cells trea ted w ith 25 ～ 100 μm o l /L 5F for 24 hou rs, and the effec t appea red in a do se-dependentm anner. 5F
up-regula ted significan tly the expression of FAK, down-regu lated the leve l o f phospho ry la ted FAK.Conc lusion:The e ffec t on ce ll cyc le of
5F from P teri sem ipinna ta L is invo lved in the expression o f NF-κF(p65), FAK and the leve l o f phosphory lated FAK.
K ey words　5F from P teri sem ipinnata L. ;P ro te in expression;Ce ll cyc le;Ovarian ca rc inom a
海带多糖对实验性高血脂鹌鹑的降脂及抗动脉粥样硬化作用
李春梅 1, 2　高永林2　李　敏1　史文华 2　刘志峰 1, 2
(1.烟台大学药学院基础医学教研室 ,山东烟台 264005;2.山东省天然药物工程技术研究中心 ,山东烟台
264003)
　　摘要　目的:研究海带多糖对实验性高血脂鹌鹑的降脂及抗动脉粥样硬化作用。方法:采用高脂饲料诱导鹌
鹑建立高血脂动脉粥样硬化模型 ,注射海带多糖 2 wk后 , 测定血清总胆固醇 (TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白
(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)浓度 ,计算 HDL /TC值及肝脏指数;分离动脉 , Sudan染色 ,观察动脉内膜斑块面积及
动脉内膜病理改变。结论:海带多糖可显著降低血清 TC、TG、 LDL及肝脏指数 ,显著升高 HDL /TC值 , 同时明显减
少高血脂实验动物动脉内膜粥样硬化斑块面积和内膜病变程度。 结论:海带多糖能很好的降低血脂 , 抑制动脉粥
样硬化的形成。
关键词　海带多糖;鹌鹑;高血脂;动脉粥样硬化
　　海带又名昆布 ,属于褐藻门 (phaeophy ta)海带
科 ( lam ina raceae)。作为一种重要的褐藻 ,迄今已经
发现其中有效成分为三种褐藻多糖 ,它们分别是褐
藻胶(a lg in)、褐藻糖胶 ( fuco idin)及褐藻淀粉 ( lam i-
narin)〔1〕。临床资料表明 ,海带多糖对缺血性心脑
血管疾病及高血粘度综合症 ,具有明显的抗凝 、解
痉 、解聚 、降压降脂 、降低血液粘度及扩张血管 、改善
微循环的作用〔2〕 ,但未有有关海带多糖抑制动脉硬
化形成的实验报道 。本文从血脂代谢 ,动脉内膜粥
样硬化斑块面积和内膜病变程度等方面探讨了海带
多糖抗动脉粥样硬化形成的作用 ,为海带多糖的开
发和医学临床上的应用提供实验依据 。
1　材料与方法
1.1　试剂及仪器 　海带多糖 (海带多糖含量为
83.2%,山东省天然药物工程技术研究中心提供 ),
洛伐他汀 (江苏扬子江药业集团有限公司 ),胆固醇
(天津市博迪化工有限公司 ), AUTOLAB全自动生
化分析仪 (AMS,意大利 ), TC、TG、HDL和 LDL试剂
盒(北京中生北控生物工程公司);SudanⅣ(上海试
剂三厂);DX51型显微镜(O lympus公司)。
1.2　动物　鹌鹑 , ♂,体重 150±20g,购于烟台兴
旺鹌鹑养殖厂 。
1.3　方法　取经普通饲料喂养 1 wk的健康♂鹌
鹑 72只 ,随机分为 6组:正常对照组 ,喂普通饲料;
676 中药材第 28卷第 8期 2005年 8月