全 文 ：第４１卷　第２期
２０１３年２月
西北农林科技大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．）
Ｖｏｌ．４１ Ｎｏ．２
Ｆｅｂ．２０１３
网络出版时间：２０１３－０１－１４　１１：３４
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３９０．Ｓ．２０１３０１１４．１１３４．００４．ｈｔｍｌ
拟南芥Ｄｏｆ１基因原核表达载体的构建及应用
　［收稿日期］　２０１２－０５－２４
　［基金项目］　云南省中青年学术与技术后备人才培养基金项目（２００６ＰＹ０１－１０）
　［作者简介］　王艺霖（１９８４－），女，山东潍坊人，在读博士，主要从事植物营养基因工程研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｖｉｏｌｉｎ２１４＠１６３．ｃｏｍ
　［通信作者］　李昆志（１９６３－），男，广西南宁人，教授，博士生导师，主要从事植物营养基因工程研究。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｋｕｎｚｈｉｋｍ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
王艺霖，赵丽伟，李昆志
（昆明理工大学 生物工程技术研究中心，云南 昆明６５０５００）
［摘　要］　 【目的】构建拟南芥转录因子Ｄｏｆ１基因的原核表达载体，进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】
利用ＲＴ－ＰＣＲ方法从拟南芥中克隆转录因子Ｄｏｆ１基因，将其连接到原核表达载体ｐＥＴ－３２ａ（＋）上，构建重组原核表
达载体ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１，经酶切鉴定和测序验证后将其转化至大肠杆菌ＢＬ２１中，经ＩＰＴＧ诱导后，纯化重组蛋白，
以分离到的重组蛋白为抗原免疫小鼠制备抗血清，检测植物中Ｄｏｆ１蛋白表达水平。【结果】成功构建了拟南芥转录
因子Ｄｏｆ１基因的原核表达载体ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１，在２８℃、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ诱导６ｈ的大肠杆菌中可高效表达分
子质量约为４２ｋｕ的重组蛋白，其分泌到细胞质中，不形成包涵体；Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测结果证明，制备的抗血清有
较好的抗原－抗体识别反应。【结论】成功实现了Ｄｏｆ１基因的原核表达，制备出的重组蛋白Ｄｏｆ１多克隆抗体可用于
植物Ｄｏｆ蛋白表达水平的检测，可为Ｄｏｆ１基因的进一步研究奠定基础。
［关键词］　Ｄｏｆ；转录因子；载体构建；原核表达
［中图分类号］　Ｑ７８６ ［文献标志码］　Ａ ［文章编号］　１６７１－９３８７（２０１３）０２－０１９５－０８
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｌａｓｍｉｄ
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｄｏｆ１　ｇｅｎｅ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ
ＷＡＮＧ　Ｙｉ－ｌｉｎ，ＺＨＡＯ　Ｌｉ－ｗｅｉ，ＬＩ　Ｋｕｎ－ｚｈｉ
（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｋｕｎｍｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ　６５０５００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｈｅ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｄｏｆ１ｇｅｎｅ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉ－
ａｎａ　ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｔｈｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ
ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ａｎｄ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｕｔｉｓｅｒｕｍ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ．【Ｍｅｔｈｏｄ】Ｔｈｅ　ｆｕｌ　ｌｅｎｇｔｈ　ｃＤＮＡ　ｏｆ　Ｄｏｆ１ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉ－
ｆｉｅｄ　ｆｒｏｍＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｂｙ　ＲＴ－ＰＣＲ，ａｎｄ　ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ａ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＥＴ－３２ａ（＋）．Ｔｈｅ　ｒｅ－
ｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１．Ｔｈｅ　ｒｅ－
ｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＰＴＧ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ａｎ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｔｏ　ｉｍ－
ｍｕｎｉｚｅ　ｔｈｅ　ｈｅａｌｔｈｙ　ｒａｔｓ　ｆｏｒ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｓｅｒｕｍ．【Ｒｅｓｕｌｔ】Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＥＴ３２ａ（＋）－
Ｄｏｆ１ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ａｎｄ　ｈｉｇｈｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１ｉｎｄｕｃｅｄ　ｗｉｔｈ　ＩＰＴＧ．Ａ　４２ｋｕ　ｆｕ－
ｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｓｅｃｒｅｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍ．Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｓｅｒｕｍ　ｃｏｕｌｄ
ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｙ　ｒｅａｃｔ　ｗｉｔｈ　Ｄｏｆ１ｐｒｏｔｅｉｎ．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｏｆ　Ｄｏｆ１ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｓｕｃ－
ｃｅｓｓｆｕｌｙ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄｏｆ１ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　Ｄｏｆ１
ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｐｌａｎｔ，ａｎｄ　ｐｒｏｖｉｄｅｄ　ｒｅｌｉａｂｌｅ　ｔｏｏｌｓ　ｆｏｒ　ｓｔｕｄｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔ　ｏｆ　Ｄｏｆ１．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｄｏｆ；ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ；ｖｅｃｔｏｒ；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
DOI:10.13207/j.cnki.jnwafu.2013.02.004
　　Ｄｏｆ转录因子是一类植物特异性转录因子，
１９９３年从玉米中首次分离得到Ｄｏｆ蛋白的ｃＤＮＡ
序列［１］，随后陆续从多种单子叶和双子叶植物中获
得Ｄｏｆ蛋白，包括玉米、大麦、小麦、水稻、烟草、拟南
芥、南瓜、马铃薯和豌豆等［２］。Ｄｏｆ转录因子作为激
活剂或抑制剂参与调控植物生长发育的多个生理过
程，如参与光应答和碳氮代谢、种子发育和萌发、植
物激素应答、微管系统发育等。
研究表明，拟南芥Ｄｏｆ转录因子家族包括３６个
基因［３］，其中，ＤＡＧ１和ＤＡＧ２基因结构特征相似，
但以相反的作用参与控制种子萌发［４］；ＣＯＧ１编码
的Ｄｏｆ转录因子在光敏色素信号转导过程中起负调
控ｐｈｙＡ和ｐｈｙＢ信号转导的作用，其过量表达使得
植物对红光和远红光的敏感性降低［５］；水杨酸作为
植物防御反应中的信号分子，可不同程度诱导
ＯＢＰ１、ＯＢＰ２和ＯＢＰ３的表达［６］，ＯＢＰ３是ｐｈｙＢ和
隐花色素ｃｒｙ１信号途径的组分之一，参与调控拟南
芥光敏色素和隐花色素的信号转导［７］，过量表达
ＯＢＰ３会引起植物生长缺陷［６］。ＡｔＤｏｆ２．４和ＡｔＤ－
ｏｆ５．８启动子参与维管束的早期形成过程［８］；此外，
Ｉｍａｉｚｕｍｉ等［９］和Ｌｉ等［１０］报道，Ｄｏｆ转录因子与光
周期开花调控有关；Ｄｏｆ５．６／ＨＣＡ２参与调控微管
组织的形成［１１］。但目前关于含有拟南芥转录因子
Ｄｏｆ１基因原核表达载体构建及Ｄｏｆ１抗体制备的
研究尚未见报道。为此，本研究以拟南芥ｃＤＮＡ为
模板，克隆得到正确的Ｄｏｆ１基因序列，将其连接到
原核表达载体ｐＥＴ－３２ａ（＋）中，获得了原核表达载
体ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１，通过制备其特异性抗体，检
测植物中Ｄｏｆ１蛋白表达水平，以期为进一步研究
Ｄｏｆ１参与植物代谢的机制奠定基础。
１　材料与方法
１．１　材　料
将野生型拟南芥植株（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ，ｅ－
ｃｏｔｙｐｅ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ）作为试验材料。
ＴＲＩｚｏＬ　Ｒｅａｇｅｎｔ为Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品；反转
录 ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭ－ＭｕＬＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　Ｋｉｔ
为Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司产品；ｐＭＤ１８－Ｔ载体、Ｔａｑ　ＤＮＡ
聚合酶及各种限制性内切酶等，均为ＴａＫａＲａ公司
产品；原核表达载体ｐＥＴ－３２ａ（＋）购自Ｎｏｖａｇｅｎ公
司；质粒提取试剂盒购自博大泰克生物技术有限公
司；其余试剂均为进口或国产分析纯。Ｅ．ｃｏｌｉ
ＤＨ５α感受态细胞购自天根生化科技公司；受体菌
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１为昆明理工大学生物工程技术研究中
心保存。
１．２　方　法
１．２．１　拟南芥总ＲＮＡ的提取及ｃＤＮＡ的合成　
根据ＴＲＩｚｏＬ　Ｒｅａｇｅｎｔ说明书，提取幼嫩拟南芥植
株总ＲＮＡ，以电泳和紫外分光光度计检测其浓度和
纯度，然后按照说明书使用 ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭ－ＭｕＬＶ
Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　Ｋｉｔ合成ｃＤＮＡ，作为扩增基
因的模板。
１．２．２　Ｄｏｆ１基因扩增　根据 ＮＣＢＩ上公布的
Ｄｏｆ１基因序列（ＮＭ＿１０４０４８．３）设计特异性引物，
Ｆ：５′－ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＴＧＡＣＧＴＣＡＧＣ－３′和Ｒ：５′－
ＧＴＣＧＡＣＴＣＡＡＴＴＣＴＴＣＴＣＣＡＴＴＣＴＧＴＴＣ－３′，
分别添加ＮｃｏⅠ（Ｆ）和ＳａｌⅠ（Ｒ）酶切位点（引物中
下划线处），引物由上海生工生物工程公司合成。以
拟南芥ｃＤＮＡ 为模板进行 ＰＣＲ扩增。反应体系
（２０μＬ）为：１０×Ｅｘ　Ｔａｑ　Ｂｕｆｆｅｒ　２μＬ，ｄＮＴＰ（２．５
ｍｍｏｌ／Ｌ）１．６μＬ，ｃＤＮＡ　１μＬ，上、下游引物（１０
μｍｏｌ／Ｌ）各１μＬ，Ｅｘ　Ｔａｑ聚合酶（５Ｕ／μＬ）０．３μＬ，
ｄｄＨ２Ｏ　１３．１μＬ。ＰＣＲ反应条件为：９４℃预变性３
ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５５℃退火３０ｓ，７２℃延伸４５
ｓ，３０个循环；７２ ℃延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ 产物使用
１．０％琼脂糖凝胶电泳检测后，回收并纯化目的
ＤＮＡ片段，并与ｐＭＤ１８－Ｔ载体连接，转化至Ｅ．ｃｏｌｉ
ＤＨ５α中，在 含 有 Ｘ－ｇａｌ和 ＩＰＴＧ 的 Ａｍｐ（１００
μｇ／ｍＬ）平板上进行蓝白斑筛选，挑取白斑质粒，经
ＰＣＲ 和酶切检测后进 行测序，确定阳 性 克 隆
（ｐＭＤ１８－Ｄｏｆ１）。
１．２．３　原核表达载体ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１的构建　
将阳性ｐＭＤ１８－Ｄｏｆ１质粒和ｐＥＴ－３２ａ（＋）载体质
粒分别用ＮｃｏⅠ和ＳａｌⅠ进行双酶切，回收目的片
段后，利用Ｔ４ＤＮＡ连接酶１６℃连接过夜，以连接
体系转化Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α，将转化产物涂布于含有
Ａｍｐ（１００μｇ／ｍＬ）的ＬＢ固体培养基中，３７℃过夜
培养，获得目的基因的原核表达载体ｐＥＴ３２ａ（＋）－
Ｄｏｆ１，经ＰＣＲ和酶切鉴定后转化到宿主菌Ｅ．ｃｏｌｉ
ＢＬ２１中进行表达。
１．２．４　Ｄｏｆ１基因的原核表达　挑取含ｐＥＴ３２ａ
（＋）－Ｄｏｆ１的Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１单菌落，接种到ＬＢ液体
培养基（含 Ａｍｐ　１００μｇ／ｍＬ）中，３７ ℃下培养至
ＯＤ６００≈０．６，加入ＩＰＴＧ至终浓度为１ｍｍｏｌ／Ｌ，然
后置于２８和３７℃下诱导表达，分别取诱导０，２，４
和６ｈ的菌液２ｍＬ，１２　０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ，收集
菌体，用１ｍＬ　Ｗａｓｈｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（体积分数１０％甘
油，１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ７．４Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）清洗２次，加入
６９１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４１卷
１００μＬ蛋白抽提缓冲液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ７．４磷酸
钠缓冲液）悬浮菌体，超声破碎至溶液澄清，４℃、
１２　０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ后分别取上清和沉淀，加
入适量上样缓冲液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８），
体积分数１０％甘油，质量分数２％ ＳＤＳ，质量分数
０．１％ ＢＰＢ，体积分数１％β－巯基乙醇），进行ＳＤＳ－
ＰＡＧＥ电泳分析，筛选Ｄｏｆ１蛋白的最优表达条件。
１．２．５　Ｄｏｆ１蛋白的纯化及抗体的制备　在最优条
件下大量表达重组蛋白，超声波破碎后，４ ℃、
１２　０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，收集上清液，进行ＳＤＳ－
ＰＡＧＥ电泳，电泳结束后置于０．２５ｍｏｌ／Ｌ预冷的
ＫＣｌ溶液中，４℃浸泡至白色蛋白条带出现，切下目
的条带，放入预处理好的透析袋中，注入２ｍＬ　ＳＤＳ－
ＰＡＧＥ电泳缓冲液，封口后进行水平电泳直至凝胶
透明，最后使用预冷的１×ＰＢＳ溶液于４℃下透析
过夜，将鉴定正确的蛋白溶液送至云大生物公司，制
备多克隆鼠抗血清。
１．２．６　Ｄｏｆ１多克隆抗体的 Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析
　分别取５０，１００，１５０和２００μＬ重组蛋白进行
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，通过电转移法将重组蛋白转印于硝酸
纤维素膜上，用含５％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液
（ＰＢＳ）于３７℃下封闭２ｈ后，用封闭缓冲液将Ｄｏｆ１
多克隆鼠抗血清稀释作为一抗（１∶１　０００），３７℃下
孵育１ｈ，用含０．０５％吐温的ＰＢＳ缓冲液洗膜３次，
与１　０００倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠
ＩｇＧ反应３０ｍｉｎ，洗膜３次后，放入预先配制的底物
显色液（０．５ｍＬ　Ｌｕｍｉｎｏｌ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ和０．５
ｍＬ　ＣＬ　Ｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中，室温避光显色。
１．２．７　转Ｄｏｆ１基因烟草植株的筛选及植物蛋白
的提取　采用叶盘转化法，用带有 ｐＫ２Ｇ７－３５Ｓ－
Ｄｏｆ１植物表达载体（图１）的农杆菌转染野生型烟
草，抗生素筛选获得阳性转基因烟草，经ＰＣＲ和
ＲＴ－ＰＣＲ验证转入Ｄｏｆ１基因的存在，其中ＰＣＲ引
物、反应体系及条件参照１．２．２。待烟苗长至４～５
片真叶时，取野生型烟草及转Ｄｏｆ１基因烟草叶片。
将烟草叶片用液氮研磨后，取１．０ｇ加入１ｍＬ蛋白
抽提液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　７．５），体积分数
１０％甘油，１０ｍｍｏｌ／Ｌ巯基乙醇，１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＰＭＳＦ，
质量分数５％ ＰＶＰ）混匀，４℃、１２　０００ｒ／ｍｉｎ下离
心１５ｍｉｎ后取上清，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，再按照１．２．６
步骤进行 Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测。
图１　ｐＫ２Ｇ７－３５Ｓ－Ｄｏｆ１植物表达载体的结构
ＬＢ和ＲＢ．左端和右端序列；Ｋｍ．卡那霉素抗性基因；
Ｐ３５Ｓ．ＣａＭＶ　３５Ｓ启动子序列；ａｔｔＢ１和ａｔｔＢ２．Ｇａｔｅｗａｙ重组
反应中的２个特异性结合位点；Ｄｏｆ１．拟南芥Ｄｏｆ１基因
编码区；ＮｏｓＴ．胭脂碱合酶终止子序列
Ｆｉｇ．１　ｐＫ２Ｇ７－３５Ｓ－Ｄｏｆ１ｐｌａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｖｅｃｔｏｒ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｄｉａｇｒａｍ
ＬＢ．Ｌｅｆｔ　ｂｏｒｄｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＲＢ．Ｒｉｇｈｔ　ｂｏｒｄｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ；
Ｋｍ．Ｋａｎａｍｙｃｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｇｅｎｅ；Ｐ３５Ｓ．ＣａＭＶ　３５Ｓｐｒｏｍｏｔｅｒ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ａｔｔＢ１ａｎｄ　ａｔｔＢ２．Ｔｗｏ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｓｉｔｅｓ　ｆｏｒ
Ｇａｔｅｗａｙ　ＢＰ　ｒｅａｃｔｉｏｎ；Ｄｏｆ１．Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｄｏｆ１ｇｅｎｅ；ＮｏｓＴ．Ｎｏｐａｌｉｎｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ
ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
２　结果与分析
２．１　Ｄｏｆ１基因的扩增
对提取的拟南芥总ＲＮＡ进行１．５％琼脂糖凝
胶电泳检测，发现ＲＮＡ产物条带清晰（图２Ａ），紫
外分光光度计分析显示，Ａ２６０／Ａ２８０＝１．９０，表明获得
的拟南芥总ＲＮＡ纯度较高，可用于基因全长扩增。
图２　拟南芥总ＲＮＡ的提取及Ｄｏｆ１基因的ＲＴ－ＰＣＲ扩增
（Ａ）１～３．拟南芥总ＲＮＡ；（Ｂ）Ｍ．λＤＮＡ／ＨｉｎｄⅢ Ｍａｒｋｅｒ；１～３．Ｄｏｆ１基因的ＲＴ－ＰＣＲ产物
Ｆｉｇ．２　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ａｎｄ　ＲＴ－ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄｏｆ１ｆｒａｇｍｅｎｔ
（Ａ）１－３．Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ；（Ｂ）Ｍ．λＤＮＡ／ＨｉｎｄⅢ Ｍａｒｋｅｒ；１－３．ＲＴ－ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　Ｄｏｆ１ｇｅｎｅ
７９１第２期 王艺霖，等：拟南芥Ｄｏｆ１基因原核表达载体的构建及应用
　　反转录产物经１．０％的琼脂糖凝胶电泳，得到
了约５８５ｂｐ的条带（图２Ｂ）。将扩增产物回收并与
ｐＭＤ１８－Ｔ载体连接后转化到大肠杆菌 Ｅ．ｃｏｌｉ
ＤＨ５α中，挑取阳性克隆，提取质粒（图３Ａ），经ＰＣＲ
扩增（图３Ｂ）和ＮｃｏⅠ和ＳａｌⅠ双酶切（图３Ｃ）检测，
确定阳性克隆，经测序分析证明是拟南芥Ｄｏｆ１全
长基因的ｃＤＮＡ。
图３　重组质粒ｐＭＤ１８－Ｄｏｆ１的检测
（Ａ）１．阳性对照（分子量为３　３００ｂｐ的质粒）；２～３．重组ｐＭＤ１８－Ｄｏｆ１质粒（３　２７７ｂｐ）；（Ｂ）Ｍ．ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；
１．阳性对照（以拟南芥ｃＤＮＡ为模板的ＰＣＲ产物）；２～３．以ｐＭＤ１８－Ｄｏｆ１质粒为模板的ＰＣＲ产物；
（Ｃ）Ｍ．ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；１～２．ＮｃｏⅠ和ＳａｌⅠ双酶切重组质粒ｐＭＤ１８－Ｄｏｆ１
Ｆｉｇ．３　Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｐＭＤ１８－Ｄｏｆ１
（Ａ）１．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｐｌａｓｍｉｄ（３　３００ｂｐ）；２－３．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｐＭＤ１８－Ｄｏｆ１（３　２７７ｂｐ）；
（Ｂ）Ｍ．ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；１．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ（ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃＤＮＡ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ａｓ　ｔｅｍｐｌａｔｅ）；
２－３．ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐＭＤ１８－Ｄｏｆ１ａｓ　ｔｅｍｐｌａｔｅ；（Ｃ）Ｍ．ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；１－２．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＭＤ１８－Ｄｏｆ１ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＮｃｏⅠａｎｄ　ＳａｌⅠ
２．２　ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１载体的构建
根据ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１载体的构建图谱（图
４），利用ＮｃｏⅠ和ＳａｌⅠ双酶切纯化ｐＥＴ－３２ａ（＋）和
ｐＭＤ１８－Ｄｏｆ１质粒，回收目的片段（图５）后进行连
接，构建成目的基因的原核表达载体ｐＥＴ３２ａ（＋）－
Ｄｏｆ１。对ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１重组质粒（图６Ａ）进
行ＰＣＲ（图６Ｂ）和酶切（图６Ｃ）检测，确定阳性克隆，
并将阳性重组质粒转化到宿主菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１中。
图４　原核表达载体ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１的构建图谱
Ｆｉｇ．４　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１
８９１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４１卷
图５　ｐＭＤ１８－Ｄｏｆ１和ｐＥＴ－３２ａ（＋）质粒的ＮｃｏⅠ和ＳａｌⅠ双酶切
Ｍ．Ｔｒａｎｓ　２ＫｐｌｕｓⅡ ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１．Ｄｏｆ１片段；２．ｐＥＴ－３２ａ（＋）片段
Ｆｉｇ．５　Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐＭＤ１８－Ｄｏｆ１ａｎｄ　ｐＥＴ－３２ａ（＋）ｐｌａｓｍｉｄ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＮｃｏⅠａｎｄ　ＳａｌⅠ
Ｍ．Ｔｒａｎｓ　２ＫｐｌｕｓⅡ ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１．Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｄｏｆ１；２．Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ｐＥＴ－３２ａ（＋）
图６　原核表达载体ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１的检测与鉴定
（Ａ）１．ｐＥＴ－３２ａ（＋）质粒（５　９００ｂｐ）；２～４．重组ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１质粒（６　４８５ｂｐ）；（Ｂ）Ｍ．Ｔｒａｎｓ　２ＫｐｌｕｓⅡ ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；
１～２．阴性对照（分别以ｄｄＨ２Ｏ和ｐＥＴ－３２ａ（＋）质粒为模板扩增的ＰＣＲ产物）；３．阳性对照（以ｐＭＤ１８－Ｄｏｆ１质粒为模板扩增的
ＰＣＲ产物）；４～６．以ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１质粒为模板扩增的ＰＣＲ产物；（Ｃ）Ｍ．Ｔｒａｎｓ　２ＫｐｌｕｓⅡ ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；
１．ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１　ＮｃｏⅠ和ＳａｌⅠ双酶切产物
Ｆｉｇ．６　Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１
（Ａ）１．Ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＥＴ－３２ａ（＋）（５　９００ｂｐ）；２－４．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１（６　４８５ｂｐ）；（Ｂ）Ｍ．Ｔｒａｎｓ　２ＫｐｌｕｓⅡ ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；
１－２．Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ（ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ｄｄＨ２Ｏ　ａｎｄ　ｐＥＴ－３２ａ（＋）ａｓ　ｔｅｍｐｌａｔｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）；３．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ
（ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐＭＤ１８－Ｄｏｆ１ａｓ　ｔｅｍｐｌａｔｅ）；４－６．ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１ａｓ　ｔｅｍｐｌａｔｅ；
（Ｃ）Ｍ．Ｔｒａｎｓ　２ＫｐｌｕｓⅡ ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅ；１．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＮｃｏⅠａｎｄ　ＳａｌⅠ
２．３　Ｄｏｆ１蛋白的原核表达分析
收集经１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ诱导不同时间的含有
重组质粒ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１的宿主菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１
菌液，以含有 ｐＥＴ－３２ａ（＋）质粒和未经诱导的
ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１菌液为阴性对照，分别取超声破
碎后菌液的上清和沉淀，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分
析，结果（图７）表明，与阴性对照相比，含ｐＥＴ３２ａ
（＋）－Ｄｏｆ１质粒的菌液在２８和３７℃下诱导２，４，６
９９１第２期 王艺霖，等：拟南芥Ｄｏｆ１基因原核表达载体的构建及应用
ｈ后，可不同程度地特异性表达相对分子质量约４２
ｋｕ的目的蛋白，蛋白表达量随诱导时间的延长明显
升高；但表达的重组Ｄｏｆ１蛋白仅以可溶性形式存在
于上清液中，并不形成包涵体，且２８℃更有利于蛋
白的诱导。因此，以１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ在２８℃条件
下诱导６ｈ为蛋白最优表达条件，通过割胶纯化从
上清液中可获得高纯度的重组蛋白。
图７　Ｄｏｆ１蛋白表达的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析
Ｍ．Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍａｒｋｅｒ－０４３１；１．转ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１的ＢＬ２１菌液全蛋白（未加ＩＰＴＧ诱导，０ｈ）；２．转ｐＥＴ－３２ａ（＋）的ＢＬ２１菌液全蛋白
（１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ诱导４ｈ）；３～５．转ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１的ＢＬ２１上清液（３７℃，１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ分别诱导２，４，６ｈ）；
６．转ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１的ＢＬ２１沉淀（３７℃，１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ诱导４ｈ）；７～９．转ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１的ＢＬ２１上清液
（２８℃，１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ分别诱导２，４，６ｈ）；１０．转ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１的ＢＬ２１沉淀（２８℃，１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ诱导４ｈ）
Ｆｉｇ．７　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｄｏｆ１ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｙ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
Ｍ．Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍａｒｋｅｒ－０４３１；１．Ｔｏｔａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ＢＬ２１ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１（ｗｉｔｈｏｕｔ　ＩＰＴＧ，０ｈ）；２．Ｔｏｔａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ＢＬ２１
ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｐＥＴ－３２ａ（＋）（１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ，４ｈ）；３－５．Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ＢＬ２１ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１
（３７℃，１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ，２，４ａｎｄ　６ｈ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）；６．Ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ＢＬ２１ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１
（３７℃，１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ，４ｈ）；７－９．Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ＢＬ２１ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１（２８℃，１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ，２，４ａｎｄ　６ｈ，
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）；１０．Ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ＢＬ２１ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１（２８℃，１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ，４ｈ）
２．４　Ｄｏｆ１多克隆抗体的纯度检测及 Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ－
ｔｉｎｇ分析
　　以制备的鼠抗血清为一抗进行 Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ－
ｔｉｎｇ分析，结果表明，以纯化蛋白制备的抗血清可特
异性与重组蛋白反应（图８），证明Ｄｏｆ１蛋白已经在
大肠杆菌ＢＬ２１中融合表达，且纯化成功。
转基因烟草经ＰＣＲ（图９Ａ，Ｂ）及ＲＴ－ＰＣＲ（图
９Ｃ，Ｄ）检测，进一步证明Ｄｏｆ１基因已转入烟草。
对提取的野生型烟草和阳性转基因烟草叶片的总蛋
白进行 Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测，结果（图１０）显示，
Ｄｏｆ１多抗血清能与转基因烟草蛋白进行特异性结
合，产生了１条４２ｋｕ左右的条带，而野生型烟草植
株无此条带，说明制备的抗血清具有较好的特异性。
图８　Ｄｏｆ１蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ａ）及 Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ（Ｂ）分析
（Ａ）Ｍ．Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍａｒｋｅｒ－０４３１；１～４．转ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１的ＢＬ２１上清液，上样量分别为５０，１００，１５０和２００μＬ；
（Ｂ）１～４．５０，１００，１５０和２００μＬ重组蛋白上清液对应的杂交条带
Ｆｉｇ．８　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ａ）ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ（Ｂ）ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ
（Ａ）Ｍ．Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍａｒｋｅｒ－０４３１；１－４．５０，１００，１５０ａｎｄ　２００μＬ　ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ＢＬ２１ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；
（Ｂ）１－４．Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｂａｎｄｓ　ｏｆ　５０，１００，１５０ａｎｄ　２００μＬ　ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ＢＬ２１ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ
００２ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４１卷
图９　转Ｄｏｆ１基因烟草的基因组ＰＣＲ及ＲＴ－ＰＣＲ检测
（Ａ）１～４．转ｐＫ２Ｇ７－３５Ｓ－Ｄｏｆ１基因烟草基因组；（Ｂ）Ｍ．ＤＮＡ　ＭａｒｋｅｒⅢ；１～４．以转基因烟草基因组ＤＮＡ为模板的ＰＣＲ扩增产物；
—．阴性对照（以野生型烟草基因组ＤＮＡ为模板扩增的ＰＣＲ产物）；＋．阳性对照（以ｐＭＤ１８－Ｄｏｆ１质粒为模板扩增的ＰＣＲ产物）；
（Ｃ）１～３．转ｐＫ２Ｇ７－３５Ｓ－Ｄｏｆ１基因烟草总ＲＮＡ；（Ｄ）Ｍ．ＤＮＡ　ＭａｒｋｅｒⅢ；１～３．以转基因烟草ｃＤＮＡ为模板的ＰＣＲ扩增产物；
—．阴性对照（以野生型烟草ｃＤＮＡ为模板扩增的ＰＣＲ产物）；＋．阳性对照（以ｐＭＤ１８－Ｄｏｆ１质粒为模板扩增的ＰＣＲ产物）
Ｆｉｇ．９　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｌｉｎｅｓ　ｂｙ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ＲＴ－ＰＣＲ
（Ａ）１－４．Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｌｉｎｅｓ；（Ｂ）Ｍ．ＤＮＡ　ＭａｒｋｅｒⅢ；１－４．ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｔｏｂａｃｃｏｓ　ａｓ　ｔｅｍｐｌａｔｅ；—．Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ（ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｏｆ　ＷＴ　ａｓ　ｔｅｍｐｌａｔｅ）；＋．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ
（ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐＭＤ１８－Ｄｏｆ１ａｓ　ｔｅｍｐｌａｔｅ）；（Ｃ）１－３．Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｌｉｎｅｓ；（Ｄ）Ｍ．ＤＮＡ　ＭａｒｋｅｒⅢ；
１－３．ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃＤＮＡ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏｓ　ａｓ　ｔｅｍｐｌａｔｅ；—．Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ（ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃＤＮＡ　ｏｆ
ＷＴ　ａｓ　ｔｅｍｐｌａｔｅ）；＋．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ（ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐＭＤ１８－Ｄｏｆ１ａｓ　ｔｅｍｐｌａｔｅ）
图１０　转Ｄｏｆ１基因烟草的 Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析
１．阴性对照（野生型烟草）；２．阳性对照
（ＩＰＴＧ诱导后含ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１的宿主菌）；
３．转ｐＫ２Ｇ７－３５Ｓ－Ｄｏｆ１烟草
Ｆｉｇ．１０　Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｐｌａｎｔｓ
１．Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ（ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ｔｏｂａｃｃｏ）；２．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ
（ｐＥＴ３２ａ（＋）－Ｄｏｆ１ｖｅｃｔｏｒ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ＢＬ２１ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＩＰＴＧ）；
３．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｌｉｎｅｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｐＫ２Ｇ７－３５Ｓ－Ｄｏｆ１
３　讨　论
近１０多年来，人们从植物体内鉴定出了一系列
的Ｄｏｆ转录因子基因，通过对其结构和功能进行研
究，发现其参与调控植物多个生理生化过程中相关
基因的表达。例如，玉米的Ｄｏｆ１可以激活Ｃ４植物
的ＰＥＰＣ启动子［１２］；大麦的ＢＰＢＦ可激活Ｂ－醇溶蛋
白基因启动子、抑制类组织蛋白酶Ｂ基因启动子的
转录［１３］；松树ＰｐＤｏｆ５转录因子参与调控谷氨酰胺
合成酶（ＧＳ）基因的表达，激活ＧＳ１ｂ启动子的同时
抑制ＧＳ１ａ的转录［１４］等。植物体内的转录调控是
许多生物学调控的关键步骤，Ｄｏｆ转录因子可同时
正向和负向调控多个靶启动子，引起植物性状的改
变。Ｙａｎａｇｉｓａｗａ等［１５］将玉米 Ｄｏｆ１在拟南芥中过
量表达发现，碳骨架合成关键酶（ＰＥＰＣ和ＰＫ）基因
的表达被激活，酶活性、氨基酸和氮含量显著提高，
葡萄糖含量减少，低氮条件下转基因拟南芥的生长
状况得到改善。因此利用基因工程手段进行转录因
子的遗传操作可改良农作物的品质和抗性，获得优
良的品种资源。
本研究以拟南芥ｃＤＮＡ为模板，克隆出 Ｄｏｆ１
转录因子基因全长，构建其原核表达载体ｐＥＴ３２ａ
（＋）－Ｄｏｆ１，该载体含有 Ｔ７启动子、细菌核糖体结
合位点和１个组氨酸标签，利用该载体转化大肠杆
菌ＢＬ２１可实现Ｄｏｆ１蛋白的高水平表达，回收分泌
到细胞质中的Ｄｏｆ１蛋白，制备抗血清，可用于植物
体内Ｄｏｆ１表达水平的检测，为后期研究Ｄｏｆ１蛋白
１０２第２期 王艺霖，等：拟南芥Ｄｏｆ１基因原核表达载体的构建及应用
的生理功能和分子功能奠定了基础。
［参考文献］
［１］　Ｙａｎａｇｉｓａｗａ　Ｓ，Ｉｚｕｉ　Ｋ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｗｏ　ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｍａｉｚｅ　ｔｈａｔ　ａｒｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｂｕｔ　ｉｎｔｅｒａｃｔ
ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｍｏｔｉｆ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，１９９３，２６８（２１）：
１６０２８－１６０３６．
［２］　Ｙａｎａｇｉｓａｗａ　Ｓ．Ｄｏｆ　ｄｏｍａｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｐｌａｎｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
ｆａｃｔｏｒｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｄｉｖｅｒｓｅ　ｐｈｅｎｏｍｅｎａ　ｕｎｉｑｕｅ　ｔｏ　ｐｌａｎｔｓ
［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００４，４５（４）：３８６－３９１．
［３］　Ｌｉｊａｖｅｔｚｋｙ　Ｄ，Ｃａｒｂｏｎｅｒｏ　Ｐ，Ｖｉｃｅｎｔｅ－Ｃａｒｂａｊｏｓａ　Ｊ．Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ
ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｉｃｅ　ａｎｄ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
Ｄｏｆｇｅｎｅ　ｆａｍｉｌｉｅｓ［Ｊ］．ＢＭＣ　Ｅｖｏｌ　Ｂｉｏｌ，２００３，３：１７．
［４］　Ｇｕａｌｂｅｒｔｉ　Ｇ，Ｐａｐｉ　Ｍ，Ｂｅｌｕｃｃｉ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｄｏｆ　ｚｉｎｃ
ｆｉｎｇｅｒ　ｇｅｎｅｓ　ＤＡＧ２ａｎｄ　ＤＡＧ１ｉｎｆｌｕｎｃｅ　ｗｉｔｈ　ｏｐｐｏｓｉｔｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ
ｔｈｅ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｓｅｅｄｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ，２００２，１４：
１２５３－１２６３．
［５］　Ｗａｒｄ　Ｊ　Ｍ，Ｃｕｆｒ　Ｃ　Ａ，Ｄｅｚｅｌ　Ｍ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　Ｄｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
ｆａｃｔｏｒ　ＯＢＰ３ｍｏｄｕｌａｔｅｓ　ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ａｎｄ　ｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｏｍｅ　ｓｉｇｎａ－
ｌｉｎｇ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ，２００５，１７：４７５－４８５．
［６］　Ｋａｎｇ　Ｈ　Ｇ，Ｓｉｎｇｈ　Ｋ　Ｂ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ－ｒｅｓｐｏｎ－
ｓｉｖｅ，Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｄｏｆ　ｄｏｍａｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ
ＯＢＰ３ｌｅａｄｓ　ｔｏ　ｇｒｏｗｔｈ　ｄｅｆｅｃｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｊ，２０００，２１（４）：３２９－
３３９．
［７］　Ｉｗａｍｏｔｏ　Ｍ，Ｈｉｇｏ　Ｋ，Ｔａｋａｎｏ　Ｍ．Ｃｉｒｃａｄｉａｎ　ｃｌｏｃｋ－ａｎｄ　ｐｈｙｔｏ－
ｃｈｒｏｍｅ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　Ｄｏｆ－ｌｉｋｅ　ｇｅｎｅ，Ｒｄｄ１，ｉｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｇｒａｉｎ
ｓｉｚｅ　ｉｎ　ｒｉｃｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ，２００９，３２：５９２－６０３．
［８］　Ｋｏｎｉｓｈｉ　Ｍ，Ｙａｎａｇｉｓａｗａ　Ｓ．Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｗｏ　Ｄｏｆ　ｔｒａｎ－
ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｉｎ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００７，４５（８）：
６２３－６２９．
［９］　Ｉｍａｉｚｕｍｉ　Ｔ，Ｓｃｈｕｌｔｚ　Ｔ　Ｆ，Ｈａｒｍｏｎ　Ｆ　Ｇ，ｅｔ　ａｌ．ＦＫＦ１Ｆ－ｂｏｘ　ｐｒｏ－
ｔｅｉｎ　ｍｅｄｉａｔｅｓ　ｃｙｃｌｉｃ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ　ｏｆ　ＣＯＮＳＴＡＮＳ
ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００５，３０９（５７３２）：２９３－２９７．
［１０］　Ｌｉ　Ｄ　Ｊ，Ｙａｎｇ　Ｃ　Ｈ，Ｌｉ　Ｘ　Ｂ，ｅｔ　ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ
ｒｉｃｅ　ＯｓＤｏｆ１２［Ｊ］．Ｐｌａｎｔａ，２００９，２２９：１１５９－１１６９．
［１１］　Ｇｕｏ　Ｙ，Ｑｉｎ　Ｇ　Ｊ，Ｇｕ　Ｈ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｄｏｆ５．６／ＨＣＡ２，ａ　Ｄｏｆ　ｔｒａｎ－
ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｇｅｎｅ，ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｉｎｔｅｒｆａｓｃｉｃｕｌａｒ　ｃａｍｂｉｕｍ　ｆｏｒ－
ｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｔｉｓｓｕｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．
Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ，２００９，２１：３５１８－３５３４．
［１２］　Ｙａｎａｇｉｓａｗａ　Ｓ．Ｄｏｆ１ａｎｄ　Ｄｏｆ２ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ　ａｒｅ　ａｓｓｏｃｉ－
ａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｃａｒｂｏｎ　ｍｅ－
ｔａｂｏｌｉｓｍ　ｉｎ　ｍａｉｚｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｊ，２０００，２１（３）：２８１－２８８．
［１３］　Ｍｅｎａ　Ｍ，Ｃｅｊｕｄｏ　Ｆ　Ｊ，Ｉｓａｂｅｌ－Ｌａｍｏｎｅｄａ　Ｉ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｒｏｌｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ
ＤＯＦ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ＢＰＢＦ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｉｂｂｅｒｅｌ－
ｌｉｎ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｂａｒｌｅｙ　ａｌｅｕｒｏｎｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，
２００２，１３０：１１１－１１９．
［１４］　Ｒｕｅｄａ－Ｌóｐｅｚ　Ｍ，Ｃｒｅｓｐｉｌｏ　Ｒ，Ｃáｎｏｖａｓ　Ｆ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ
ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｇｌｕｔａｍｉｎｅ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ　ｇｅｎｅｓ　ｂｙ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　Ｄｏｆ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｊ，２００８，５６：７３－８５．
［１５］　Ｙａｎａｇｉｓａｗａ　Ｓ，Ａｋｉｙａｍａ　Ａ，Ｋｉｓａｋａ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｅｎｇｉ－
ｎｅｅｒｉｎｇ　ｗｉｔｈ　Ｄｏｆ１ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ：Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｎｉ－
ｔｒｏｇｅｎ　ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｕｎｄｅｒ　ｌｏｗ－ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，２００４，１０１（２０）：７８３３－７８３８．
２０２ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４１卷