全 文 ：果树学报 2015，32（6）: 1062-1069
Journal of Fruit Science
DOI: 10.13925/j.cnki.gsxb.20140414
石榴果实成熟期不同品种果皮蛋白质
表达的双向电泳分析
曹尚银 1，牛 娟，1 曹 达 2，李好先 1，薛 辉 1，陈利娜 1，张富红 1，赵弟广 1
（1中国农业科学院郑州果树研究所，郑州 450009；2河南师范大学，河南新乡 453000）
摘 要：【目的】石榴果实色泽是影响果品商品价值的重要因素之一，但石榴果皮颜色形成的分子机制还不清楚。应
用差异蛋白组学技术，从蛋白水平上探究石榴果实发育成熟期果皮的代谢进程。【方法】运用双向电泳和MALDI-TOF-
TOF MS质谱鉴定技术研究‘三白’石榴和‘中农红’石榴果实成熟时果皮蛋白质组学差异。【结果】分别对‘三白’、‘中农
红’石榴进行 2-DE和质谱鉴定，在‘三白’和‘中农红’石榴果皮的电泳图谱中发现每一张重复胶上分别可以检测到
892个蛋白点和890个蛋白点，与‘中农红’相比，在‘三白’果皮图谱中共检测到36个表达量相差2倍以上的蛋白质点，
相对于‘中农红’，‘三白’有13个蛋白质点上调表达，19个蛋白质点下调表达。通过质谱鉴定和数据库检索注释了4
个蛋白质点。分别为半胱氨酸合酶1（sport 1402）、细胞色素b6-f复合体（sport 0013）、叶绿素 a/b结合蛋白（sport 5108）
及果糖激酶2-like（sport 0503）。【结论】细胞色素b6-f复合体（sport 0013）、叶绿素a/b结合蛋白（sport 5108）和果糖激酶
2-like（sport 0503）可能与果皮颜色变化相关；半胱氨酸合酶1（sport 1402）可能对提高石榴的抗氧化胁迫能力起到了重
要作用。为研究石榴果实发育蛋白质组学及改善石榴果实品质提供一定的理论依据。
关键词：石榴；果皮；成熟期；蛋白质组学；2-DE
中图分类号：S665.4 文献标志码：A 文章编号：1009-9980(2015)06-1062-08
Comparative proteomics analysis of pomegranate peel in fruit matura⁃
tion period
CAO Shangyin1，NIU Juan1，CAO Da2，LI Haoxian1，XUE Hui1，CHEN Lina1，ZHANG Fuhong1，ZHAO
Diguang1
（1Zhengzhou Fruit Research Institute，Chinese Academy of Agriculture Sciences，Zhengzhou 450009，Henan，China；2Henan Normal Universi⁃
ty，Xinxiang 453007，Henan，China）
Abstract:【Objective】Fruit peel in pomegranates is of economic relevance，yet scarcely studied and
poorly understood in China. The aim of this study is to explore the metabolic process of the pomegranate
peel in fruit maturation period at the proteomic level.【Methods】We compared the proteomic differences
between‘Zhongnonghong’（ red peel）and‘Sanbai’（ white peel）pomegranates by two- dimensional
electrophoresis（2-DE）and MALDI-TOF-TOF MS.【Results】892 and 890 protein spots were detected
on 2-DE gels respectively in two varieties，and 36 protein spots existed two times difference in expres⁃
sion（P<0.05）between two varities. Compared with‘Zhongnonghong’，‘Sanba’possessed 13 up-regu⁃
lated and 19 down-regulated proteins. We identified and annotated 4 of these by using MALDI-TOF-
TOF MS i.e. Cysteine synthase isoform 1（sport 1402），Cytochrome b6-f complex iron（sport 0013），pu⁃
tative chlorophyll a/b-binding protein（sport 5108）and fructokinase-2-like（sport 0503）.【Conclusion】
Cysteine synthase isoform 1（sport 1402）might play a role in improving anti- oxidation capability of
收稿日期：2015-01-15 接受日期: 2015-06-23
基金项目：国家科技基础性工作专项重点项目“我国优势产区落叶果树农家品种资源调查与收集”（项目编号：2012 FY110100）;中国农
业科学院科技创新工程:特色果树资源与育种（编号：CAAS- ASTIP-201X-CCZFI）
作者简介：曹尚银，男，研究员，研究方向为果树遗传育种。 Tel: 037165330963，E-mail：13937192127@163.com
6期
石榴（Punica granatum L.）原产中亚地区，在我
国已有2000多年的栽培历史，是中国近年来发展迅
速的优良小杂果类果树之一，它以较高的经济价值、
营养价值、医药价值和保健功能，越来越受到消费市
场的青睐[1]。石榴果实色泽是石榴果实品质形成的
重要组成部分，也是影响果品商品价值的重要因素
之一。一般来说，果实色泽主要受叶绿素、类胡萝卜
素和酚类色素（主要有花青素、类黄酮和黄酮醇等）
三大类植物色素的含量和比例，及光照、各种非生物
胁迫、温度等影响[2-3]。叶绿素是一类最主要的光合
色素，叶绿素含量的多少能够干扰和影响果面的着
色状况。类胡萝卜素在叶绿素中作为光合作用的辅
助色素，主要是使花果产生不同的色泽[4]。叶绿素、
类胡萝卜素等在着色中起辅助作用，构成果实的底
色，它们的含量与果皮着色和鲜艳程度有关[5]。花青
苷主要构成果实的表色，是决定果色的主要色素，目
前对矮牵牛、金鱼草、玉米、柑橘和苹果等植物花青
素苷的生物合成途径已有深入的研究[6]。研究表明，
苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查尔酮异构酶（CHI）、黄烷
酮-3-羟基化酶（F3H）等关键酶基因（结构基因）和
R2R3–MYB、MYC、WD40蛋白等调节基因[5-7]在花
青素苷的生物合成中发挥着重要作用[8-9]。
目前对石榴果皮的研究主要集中在果皮的外观
性状、光洁度及糖、酸等内含物变化的研究上，如胡
晓雪等 [10]对果实发育过程中不同品种果皮的花青
苷、叶绿素、类胡萝卜素、类黄酮几种色素物质含量
的动态变化规律以及相关关系进行分析，发现‘大籽
酸’石榴果皮花青苷含量最高，‘甜绿籽’和‘三白’石
榴7—9月叶绿素含量变化比较缓慢，且成熟期果皮
叶绿素含量最高。而且‘三白’石榴类黄酮含量最
低，可能与其不着红色有关。朱峰 [11]对成熟期不同
石榴品种果皮的类黄酮和花色苷含量进行测定，发
现‘三白’石榴果皮的类黄酮总量最高，但果皮中不
含花色苷物质。Hernandez等[12]研究发现石榴果实的
汁液中含有 6种类型的花青素苷，但果皮中的花青
素苷很少。目前对石榴果皮相关的分子生物学研究
较少，仅张四普等 [13]从红花石榴果皮中分别克隆了
查尔酮合成酶 PgCHS、PgANS、PgUFGT和 Pgactin
cDNA片断，PgMYB cDNA全长序列和 DNA全长。
Sepideh等[14]利用 qRT-PCR技术对花青素苷合成相
关基因 MYB、basic helix- loop- helix（bHLH）和
WD-repeat基因在果实成熟期不同石榴品种果皮中
的表达进行了分析。就目前研究来看，关于石榴果
皮颜色的研究很少，影响石榴果皮着色的原因还不
清楚，控制石榴果皮颜色形成的分子机理尚不明
确。因此，探明石榴果皮颜色形成的遗传机制以及
从分子水平对果皮颜色进行研究，对于探究石榴果
实发育过程中色素的积累以及遗传驯化具有重要意
义。本试验以白皮的‘三白’石榴和红皮的‘中农红’
石榴为试材，通过运用双向电泳和质谱鉴定方法，分
析石榴成熟期不同品种果皮蛋白质组学差异，为研
究石榴果实发育蛋白质组学及石榴果实外观品质形
成相关蛋白提供理论基础。
1 材料和方法
1.1 试验材料
以中国农业科学院郑州果树研究所石榴优良品
种比较圃七年生白皮的‘三白’石榴与红皮的‘中农
红’石榴（2品种都是扦插苗定植）为试材，‘三白’石
榴为白花、白皮、白籽（硬籽），9月中下旬成熟，耐寒
抗旱性强，‘中农红’石榴为红花、红皮、红籽（软籽），
9月上旬成熟，抗寒性较差，极限低温低于-10 ℃的
地区要进行防寒保护。每品种选取 9株树体健壮、
大小一致、无病虫害的结果树，每3株为一组，3次重
复。在幼果期标记大小基本一致的幼果，于 9月 20
日果实成熟时分别取标记的果实，迅速切取果实中
部果皮，立刻用液氮保存，然后放入 -80 ℃冰箱保存
备用。
1.2 石榴果皮蛋白质组学分析
1.2.1 石榴果皮总蛋白提取 采用 TCA-丙酮沉淀
法提取石榴果皮总蛋白。称取 1.5 g石榴果皮于预
冷的研钵中，加入液氮研磨粉碎（研磨过程中加入
适量 PVP），将磨好的样品粉末放入 50 mL离心管
中，加入-20 ℃预冷的 10% TCA-丙酮溶液（含 0.1%
DTT和 1 mmol·L-1 PMSF），-20 ℃静置 2 h。随后，
4 ℃，12 000 r·min-1，离心 20 min，弃上清；然后在沉
pomegranate in the period of fruit maturation. The other three proteins may be related to fruit peel color
changes. The results may provide a foundation for proteomic study of pomegranate fruit development and
improving the quality of pomegranate fruit.
Key words: Pomegranate；Fruit peel；Maturation period；Proteomics；2-DE
曹尚银，等:石榴果实成熟期不同品种果皮蛋白质表达的双向电泳分析 1063
果 树 学 报 32卷
淀物中加入-20 ℃预冷的丙酮溶液（含 0.1% DTT和
1 mmol·L-1 PMSF），涡旋混匀后于-20℃静置2 h。静
置过程中涡旋两次，4 ℃，12 000 r·min- 1，离心 20
min，弃上清，重复操作 2次。然后将沉淀物放入冷
冻真空干燥机中干燥 30 min，将干燥的蛋白粉末至
于 -20 ℃冰箱中保存备用。采用Bradford法[15]进行
蛋白质定量。
1.2.2 双向电泳 第一向固相 PH梯度等电聚焦
（IEF）：IPG干胶条为 24 cm，pH4~7（线性），双向电
泳时蛋白质上样量为 1 mg，水化液（8 mol·L-1尿素，
4% CHAPS，18 mmol · L- 1 DTT，0.15% IPG Buffer，
0.01% 溴酚蓝）与样品溶液终体积为 450 μL。电
泳参数设定：50 μA/rip，200 V（1 h），500 V（1 h），
1 000 V（1 h），8 000 V（5 h），8 000 V（110 000 V/h），
500 V（forever）。
第二向 SDS-PAGE垂直板电泳：等电聚焦完成
后胶条用平衡液 I（0.375 mol·L-1 Tris-HCl，pH 8.8，
6 mol·L-1尿素，20%甘油，2% SDS，10 g·L-1DTT，痕量
溴酚蓝）和平衡液 II（0.375 mol · L- 1 Tris-HCl，
pH 8.8，6 mol·L-1尿素，20%甘油，2% SDS，10 g·L-1
DTT，2.5%碘乙酰胺，痕量溴酚蓝）分别平衡15 min。
配制浓度为 12%的聚丙烯酰胺凝胶，待胶凝固后，
将胶条轻轻推入玻璃板中，然后用0.15%琼脂糖（电
极缓冲液配制）封顶。开始电泳（5 mA/gel/24 cm，待
溴酚蓝前沿移动到凝胶上加大电流 20~30 mA/gel/
24 cm），直至溴酚蓝前沿跑至离胶底部0.5~1 cm处，
停止电泳。凝胶染色方法采用考马斯亮蓝染色法[16]，
每个品种设置 3个重复。
1.2.3 图像与数据分析 采用 ImageScanner扫描仪
（GE Healthcare）对凝胶进行图像扫描，采用 PD⁃
Quest7.2软件（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）进行图
像分析，如蛋白点检测、背景扣除、人工校正和凝胶
匹配等分析。建立比较组，对同一处理的 3次重复
间进行匹配，只有 3次重复中都存在的点被确定为
事实存在的蛋白点，即重复组蛋白点；采用 Total
quantity in analysis set进行蛋白质定量的均一化，表
达量呈现1.5倍以上变化且差异显著（P < 0.05）的点
被认为是差异表达蛋白点。
1.2.4 质谱鉴定及数据库检索 蛋白质胶内酶切与
质谱分析委托上海日初生物科技有限公司代为完
成。胶内酶解：把差异表达的蛋白点用移液抢头
从凝胶上取出，切碎后放到 Ependorf 管中，加入
25 mmol·L-1的 NH4HCO3清洗。再加入 50 μL含有
50%的乙腈（acetonitrile，ACN）的 25 mmol · L- 1的
NH4HCO3，振荡 10 min后离心，弃上清液，重复上述
步骤 2次，真空干燥。加入 10 μL 12.5 mg·L胰蛋白
酶溶液，4 ℃下放置 45 min，取出后在 37 ℃反应过
夜。酶解产物的抽提：加入 20 μL100 mmol·L-1的
NH4HCO3缓冲液（pH 7.8~8.0），超声 10 min。再加
入 20 μL 50%的 ACN 和 0.1% TFA，超声 15 min 后
离心，取上清液，真空冷冻干燥。在干燥的样品中加
入 10 μL 0.1% TFA，再用 10 μL C18Zip（Millpore）脱
盐，用于质谱鉴定。
质谱鉴定：使用 4800型 MALDI-TOF-TOF质谱
仪（Applied Biosystems，USA）对样品进行质谱分析。
采用氮∶氩激光。波长为 355 nm，激发时间 3~7 ns，
频率为 200 Hz，激光强度为 4 000 lx，加速电压为
20 kV，使用正离子反射模式；肽质量指纹图谱
（PMF）质量扫描范围为 800~4 000 D，采用自动获
得数据的模式采集数据。数据库检索：所得到的结
果用 4800型 MALDI-TOF-TOF质谱仪配备的数据
库工作站 GPS Explorer 3.6（Applied Biosystems）和
MASCOT 软件进行蛋白质检索。检索数据库为
NCBInr，检索种属为绿色植物，数据库检索的方式为
combined，质量误差为 ± 0.3 OD，最大允许漏切位点为
1，酶为胰蛋白酶；质量误差范围设置：PMF 100×10-6，
MS/MS为 0.2 D。亚细胞定位采用CBS软件进行预
测（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP）。
2 结果与分析
2.1 ‘三白’石榴和‘中农红’果皮蛋白丰度分析
利用双向电泳技术对‘三白’和‘中农红’石榴果
皮蛋白进行分离，为保证试验的重复性，在相同条件
下对 2组样品分别进行了 3次重复性试验，将电泳
结果通过PDQuest7.2分析软件对电泳图谱进行点检
测，在‘三白’和‘中农红’石榴果皮的电泳图谱上发
现每一张重复胶上分别可以检测到 892个蛋白点
（图 1）和 890个蛋白点（图 2），说明石榴果皮蛋白质
表达较为丰富。通过对蛋白质点进行背景扣除、凝
胶匹配、等电点和分子质量校正等分析，并根据蛋白
质的等电点和分子质量信息，对‘三白’和‘中农红’
石榴果皮的蛋白质点分布情况进行统计，在等电点
4.0~7.0和分子质量 14.4~116.2 ku的范围内，‘三白’
和‘中农红’石榴果皮蛋白分子质量多在 40~60 ku，
分别占总蛋白的85.4%，86.3%（图3-a），多为酸性蛋
白；等电点多分布于（pI）5.0~6.5，分别占总蛋白的
85.4%，82.6%（图 3-b），多为酸性蛋白。从整体上
看，‘三白’和‘中农红’石榴大部分蛋白质的表达情
1064
6期
况相似，但也存在差异蛋白质。将表达量差异在1.5
倍以上或低于 0.66倍的点定为差异点，与‘中农红’
石榴果皮图谱相比较，‘三白’石榴果皮差异表达蛋
白点共有 70个。其中表达量变化在 2倍以上（P<
0.05）的有36个，上调的有13个，占总差异表达蛋白
质总数的 18.6%。（蛋白点: 2011，4005，4105，2706，
1506，5203，8109，4104，5714，6615，5110，3408，
3607），下调的有 19个（蛋白点: 1306，7711，3606，
2705，6003，3806，2611，6209，2404，4006，8210，
9305，8810，1507，8705，8808，1206，0302，5107），占
总差异表达蛋白质总数的27.1%。另外，有3个蛋白
质点为特异表达的蛋白质点（蛋白点: 1402，0013，
5108）（图1），占总差异表达蛋白质总数的4.29%；在
‘中农红’石榴果皮图谱中，有 1个蛋白质点为特异
表达的蛋白质点（蛋白点: 0503）（图 2），占总差异表
达蛋白质总数的1.43%。
蛋白点 5180 蛋白点1402 蛋白点0013
黑色箭头与代号：质谱鉴定蛋白点5108，1402，0013及它们的局部放大图；蓝色箭头与代号标示为差异蛋白点。
Bluck arrows and code :Identified the specific protein（5108，1402，0013）of by MS and their magnified map ;Blue arrows and code indicate the dif⁃
ferential protein spots.
图1 ‘三白’硬籽石榴果皮蛋白双向电泳分析
Fig. 1 2-DE protein maps of‘Shangbai’fruit peel of pomegrante
4.0 pI 7.0Mr（ku）
116.2
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
曹尚银，等:石榴果实成熟期不同品种果皮蛋白质表达的双向电泳分析 1065
果 树 学 报 32卷
2.2 ‘三白’和‘中农红’石榴果皮差异蛋白质谱鉴
定和差异蛋白表达趋势分析
差异蛋白点经胶内酶解，对‘三白’和‘中农红’
软籽石榴果皮蛋白质双向电泳凝胶上4个特异表达
的蛋白点进行MALDI-TOF-TOF MS质谱分析，得到
的图谱信号都比较强且基线平稳，质谱图质量较高，
得到的MS/MS数据以蛋白点1402为例（图4）。通过
GPS-MASCOT的离子搜索模式检索 NCBInr真核生
物蛋白质数据库，共鉴定成功（Score＞66）4个差异
蛋白（表 1），这4个蛋白中与光合作用相关的蛋白有
叶绿素 a/b结合蛋白（sport 5108）、细胞色素 b6-f复
合体（sport 0013）；与代谢途径相关的蛋白为果糖激
酶 2-like（sport 0503）；与植物抗氧化胁迫相关的蛋
白为半胱氨酸合酶1（sport 1402）。
鉴定得到的 4蛋白的蛋白丰度在‘三白’与‘中
农红’石榴果皮中存在一定差异。与光合作用相关
的蛋白-细胞色素b6-f复合体（sport 0013）、叶绿素a/
b结合蛋白（sport 5108）及与植物抗氧化胁迫相关的
蛋白-半胱氨酸合酶 1（sport 1402）蛋白丰度在‘三
白’石榴果皮中显著高于‘中农红’石榴，其中蛋白
点 1402与‘中农红’石榴相比，上调表达 4.5倍。而
与代谢途径相关的果糖激酶2-like（sport 0503）的蛋
白丰度在‘中农红’果皮中高于‘三白’石榴。
3 讨 论
蛋白质组学是研究果实生长发育极有利的工
具，不但可以揭示果树生长发育的分子机制[17]，还可
提高果树的育种效率[18]。近年来植物蛋白质组学越
黑色箭头与代号：质谱鉴定蛋白点0503及它的局部放大图；蓝色箭头与代号标示为差异蛋白点
Bluck arrows and code :Identified the specific protein 0503 of by MS and its magnified map;Blue arrows and code indicate the differential protein spots
图2 ‘中农红’软籽石榴果皮蛋白双向电泳分析
Fig. 2 2-DE protein maps of‘Zhongnonghong’fruit peel of pomegrante
蛋白点 0503
Protein spot 0503
4.0 pI 7.0Mr（ku）116.2
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
图 3 石榴果皮蛋白质点分布统计
Fig. 3 Statistical distribution of protein spots of pomegrante
0
50
100
150
200
250
4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0
白皮 红皮
The
num
ber
of p
rote
ins
pH
0
100
200
300
400
500
600
20 40 60 80 100 120
白皮 红皮
The
num
ber
of p
rote
ins
分子质量 Molecular mass/ku
White peel Red peelWhite peel Red peel
1066
6期
来越受到关注，并取得了一定的研究成果，目前在柑
橘、桃、苹果、香蕉、葡萄[19-22]等果树中得到了广泛应
用。由于石榴遗传背景较为复杂，对性状的遗传变
异研究较困难，蛋白质组学在石榴中还未被广泛应
用。本试验利用 2-DE技术对不同品种石榴果皮差
异蛋白质组学进行分析发现‘三白’与‘中农红’石榴
果皮图谱中的蛋白数量、等电点分布及分子质量的
差异不明显，但它们也各自有单独表达的蛋白点，通
过质谱鉴定技术，成功鉴定了 4种蛋白质。其中，参
与光合作用的蛋白—捕光叶绿素 a/b结合蛋白（spot
5108）与细胞色素 b6-f复合体（spot 0013）及与植物
抗氧化胁迫相关的蛋白—半胱氨酸合酶 1（sport
1402）在‘三白’石榴的成熟期果皮中表达丰度较
高。捕光叶绿素 a/b结合蛋白基因（Cab）编码的蛋
A蛋白点1402肽指纹图谱；B蛋白点1402肽碎片图谱
A. Peptide mass fingerprint of 1402 protein; B. The MS/MS map of peptide of 1402 spec#1（labeled with * in A）.
图 4 蛋白点1402的MALDI-TOF-TOF MS质谱图
Fig. 4 Mass spectrum of 1402 protein from MALDI-TOF-TOF MS
表1 石榴果皮差异蛋白质的MALDI-TOF-TOF MS鉴定
Table 1 Identification of differentially expressed proteins in pomegrante fruit peel by MALDI-TOF-TOF MS
蛋白编号
aSpot No.
1402
0013
5108
0503
蛋白名称
bProtein name
半胱氨酸合酶1
Cysteine synthase isoform 1
细胞色素b6-f复合体
Cytochrome b6-f complex iron
叶绿素a/b结合蛋白
putative chlorophyll
a/b-binding protein
果糖激酶2-like
probable fructokinase-2-like
物种登录号
cAccession No.
可可gi|508719254
Theobroma cacao
豌豆gi|136707
Pisum sativum
蝴蝶兰/gi|4512125
Phalaenopsis hybrid
cultivar
森林草莓gi|470148532
Fragaria vesca subsp.
vesca
理论等电点/
实际等电点
dTpI/EpI
4.78/5.22
4.65/8.63
5.65/5.49
4.72/4.94
理论分子量/
实际分子量
eTMr/EMrs
40.5/34.4
21.8/24.7
35.3/29.7
35.0/45.9
得分*
fScore
101
92
74
105
gSC
9
10
6
7
序列覆盖率
（%）
hMP
2
2
1
2
亚细胞定位
iSL
线粒体
Mitochondrial
叶绿体
Chloroplast
线粒体
Mitochondrial
分泌通路
Secretory
pathway location
aFig. 2-2中的2-DE凝胶图谱中对应的蛋白编号；b利用MASCOT软件得到的蛋白在NCBInr数据库中对应的蛋白名称；c鉴定蛋白在NCBInr
数据库中对应的物种名称和登录号；dTpI and EpI分别为鉴定蛋白的理论等电点和真实等电点；eTMr and EMr分别为鉴定蛋白的理论分子质
量和真实分子质量；f鉴定蛋白的Mowse得分；g鉴定蛋白的序列覆盖度；h鉴定的总肽段数；i鉴定蛋白的亚细胞定位
aNumbering corresponds to the 2-DE gel in Fig. 2-2；bNames and species of the proteins obtained via the MASCOT software from the NCBInr data⁃
base；cAccession number from the NCBInr database；dTpI and EpI are theoretical isoelectric point and experimental isoelectric point，respectively; eTMr
and EMr are theoretical molecular mass and experimental molecula rmass，respectively; fMOWSE score probability for the entire protein. gThe sequence
coverage of identified proteins; hThe total number of identified peptide; iThe Subcellular Location of identified proteins.
1 000 1 500 2 000 2 500 3 000 m/z A 500 1 000 1 500 2 000 2 500 m/z B
3 000
2 000
1 000
0
5 000
4 000
3 000
2 000
1 000
0
258
1.30
8
247
4.16
4*
230
2.05
4214
9.04
9
205
7.95
7187
2.90
2
187
2.91
1
157
8.91
1
142
7.78
8
135
9.73
0
104
4.66
0
239
9.10
0
247
4.16
1
185
0.45
5
134
7.48
0
205
7.95
7
508
.124
499
.091
371
.049299
.993
175
.027
112
.007
121
6.51
5
915
.344
780
.202
101
.419
曹尚银，等:石榴果实成熟期不同品种果皮蛋白质表达的双向电泳分析
6 000
1067
果 树 学 报 32卷
白质与色素所形成的色素蛋白复合体（LHC）是一
类能捕获光能并把其编码的蛋白与色素所形成的色
素蛋白复合体，在类囊体膜中除了进行光能的吸收
和传递之外，在维持类囊体膜的结构，调节激发能量
在光系统 I和光系统П（PSII）之间的分配等过程中都
起着重要的作用[23]。细胞色素b6f蛋白复合体（Cyto⁃
chrome b6/f complex，Cyt b6f）是光合膜上参与光合
作用原初反应过程的主要膜蛋白超分子复合体之
一，在光合作用的电子传递及能量转换过程中扮演
着重要的角色。它还具有参与调节LHCII激酶的活
化，使植物在环境的变化中得以维持其尽可能高的
光能转换效率的作用[24]。如Monde等[25]通过敲除烟
草细胞色素 b6/f（Cyb6/f）复合体的三个编码基因
petA、petB、petC，得到了黄绿色突变体。而且本实验
室通过对‘三白’与‘中农红’石榴果实成熟期的带果
肉种子进行转录组分析发现，叶绿素 a/b结合蛋白与
叶绿素 a/b结合蛋白CP29等基因在‘三白’石榴中表
达量很高，在‘中农红’石榴中表达量极低（未发
表）。另外，Saure[26]指出，只有在叶绿素开始降解或
完成时，花青素形成才有可能。可能是由于叶绿素
a/b结合蛋白与细胞色素 b6-f复合体在‘三白’石榴
果实成熟时的表达量较高，果实不断进行光合作用，
叶绿素含量迅速增加，高叶绿素的含量加重了果面
的显色背景，使得表色与底色的比值下降，进而导致
了‘三白’石榴在成熟时果皮呈现黄白色，与前人研
究的‘三白’石榴成熟期果皮叶绿素含量较高，类黄
酮含量最低，可能与其不含花色苷物质而不着红色
的结论相一致[10-11]。其次，过量表达半胱氨酸合成酶
（cystaine synthase）能够增加半胱氨酸和谷胱甘肽
（GSH）的含量[27]，而GSH是胞内代谢过程和植物遭
受氧化胁迫产生的过氧化物有效清除剂之一，因此
过量表达半胱氨酸合成酶能够提高植物对过氧化物
的清除能力进而提高植物本身抗氧化胁迫能力。目
前，已经克隆出菠菜、水稻、烟草、拟南芥等多种植物
的半胱氨酸合成酶的不同异形体，发现转基因植株
能够提高抗氧化应激等非生物胁迫能力[28-29]。而且
半胱氨酸合酶 1（spot 1402）在‘三白’石榴果皮中的
蛋白丰度是‘中农红’石榴的 4倍，可能是由于半胱
氨酸合酶的积累增加了半胱氨酸和谷胱甘肽的含
量，从而提高了‘三白’石榴的抗逆性。
另外，在本研究中得到的果糖激酶 2-like（spot
0503）在‘中农红’石榴成熟期果皮中表现出上调表
达的趋势。果糖激酶是催化己糖磷酸化的酶，这一
步是己糖代谢中的第一步不可逆反应，但目前对植
物果糖激酶基因与糖分组成关系的研究还不多。由
于糖对花色素苷合成的影响仅次于光，已有试验证
明糖可通过己糖激酶磷酸化相关的信号转导途径
调节矮牵牛花冠中花色素苷合成和相关酶基因的
表达[30]。而且本研究通过对‘三白’与‘中农红’石榴
果实成熟期的带果肉种子进行转录组分析发现
FRK1在‘中农红’石榴中上调表达，在‘三白’石榴中
表达量很低（未发表），说明植物果糖激酶基因在不
同石榴品种中存在时空表达的特异性。而果糖激酶
属于己糖激酶的一种，我们推测果糖激酶的表达可
能与糖分的组成，花色素苷合成和相关酶基因的表
达存在某种关系，可能在石榴果皮着色中发挥着重
要作用。
本试验采用蛋白质组学技术，对不同石榴品种
的果皮差异蛋白进行了分析，发现捕光叶绿素 a/b结
合蛋白与细胞色素b6-f复合体在‘三白’石榴的成熟
期果皮中呈上调表达的趋势，而果糖激酶 2-like在
‘中农红’石榴成熟期果皮中表现出上调表达的趋
势。这为研究石榴成熟期果皮颜色变化的分子机制
提供了理论基础，但由于双向电泳技术对于低丰度
蛋白质（<1 000 copies）等分离较为困难，可能影响石
榴果皮颜色的主要蛋白质未分离出，还需通过进一
步的试验分析和验证这些参与果皮颜色形成的复杂
的代谢通路，进而找出控制石榴果皮发育的关键因
子，为改善果树的果实品质提供参考。
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