全 文 ：第 34 卷第 2 期 中南民族大学学报(自然科学版) Vol． 34 No． 2
2015 年 6 月 Journal of South-Central University for Nationalities(Nat． Sci． Edition) Jun． 2015
收稿日期 2014-12-28
作者简介 杨光忠(1968-) ，男，教授，博士，研究方向:天然药物化学，E-mail:yanggz888@ 126． com
基金项目 国家科技支撑计划资助项目(2012BAI27B06)
石松属植物化学成分抗炎活性的筛选
杨光忠，崔圆圆，王德彬
(中南民族大学 药学院，武汉 430074)
摘 要 为研究 2 种石松属植物化学成分的抗炎活性，筛选具有较强抗炎活性的化合物，用 LPS 诱导 ＲAW264． 7
细胞建立了体外炎症模型，采用 MTT法检测了化合物对小鼠巨噬细胞株 ＲAW264． 7 细胞增殖的影响．在安全浓度
范围内(细胞存活率大于 80%)给予药物干预，用 Griess法检测了培养上清液中一氧化氮(NO)水平，以各化合物抑
制 NO释放的能力为筛选指标，评价了化合物的抗炎活性．结果表明:乙酰基二氢石松生物碱(16)、对香豆酸甲酯
(21)、豆甾烷-3-酮-21-酸(22)具有较好的 NO抑制率，并呈一定剂量依赖关系，提示它们具有一定的抗炎活性．
关键词 抗炎活性;MTT法;Griess法;NO抑制率
中图分类号 Ｒ914． 4 文献标识码 A 文章编号 1672-4321(2015)02-0052-05
Screening on the Anti-inflammatory Activities of Compounds
from Lycopodium species
Yang Guangzhong，Cui Yuanyuan，Wang Debin
(College of Pharmacy，South-Central University for Nationalities，Wuhan 430074，China)
Abstract To explore the anti-inflammatory activities of the compounds from two Lycopodium species and screen the active
compounds，LPS-induced ＲAW264． 7 cell model was established in vitro． The effect of the compounds on the proliferation
of murine macrophage cell line ＲAW264． 7 was determined by MTT assay． The cell line was intervened with compounds in
the nontoxic concentration range (cell survival rate more than 80%) ，the level of NO in the culture supernatant was tested
by Griess reagent． Their activities were evaluated based on the NO inhibition capability． The results showed that
acetyldihydrolycopodine (16) ，methyl p-coumarate (21) ，stigmastane-3-oxo-21-oic acid (22)could significantly inhibit
NO production in dose-dependent manner，suggesting that they had potential anti-inflammatory activities．
Keywords anti-inflammatory activity;MTT assay;Griess reaction;NO inhibition capability
石松属植物为蕨类植物，多数可入药．伸筋草为
石松属植物石松(Lycopodium japonicum Thunb．)或
者玉柏石松(Lycopodium obscurum L．)的干燥全草，
有祛风散寒，除湿消肿，舒筋活络的功效，主治风湿
性关节痛，四肢麻木，月经不调等症［1，2］． 该属植物
含有大量的石杉型三萜［3］和生物碱［4，5］． 目前研究
发现石杉型三萜具有很好的抗肿瘤活性［6，7］，石松
生物碱的乙酰胆碱酯酶抑制活性［8］被广泛用于抗
老年痴呆症的研究，但对这些化学成分的抗炎活性
研究甚少［9］．
本文用天然产物对 NO释放的抑制能力为评判
标准，对从 2 种石松属植物中提取分离获得的 22 个
单体化合物的抗炎活性进行筛选，以期筛选出活性
较好的天然产物来阐明伸筋草发挥抗炎作用的物质
基础．
1 实验部分
1． 1 材料与仪器
ＲAW264． 7 细胞来源于小鼠巨噬细胞系(中国
典型 培 养 物 保 藏 中 心) ，由 本 室 冻 存． LPS
(lipopolysaeeharide，脂多糖)、地塞米松(美国 Sigma
公司) ，DMEM 培养基、胎牛血清(美国 Hyclone 公
司) ，Griess 检测试剂盒(上海碧云天公司) ，酶标仪
(Tecan Infinite M200，瑞士)．
单体化合物由中南民族大学药学院天然产物化
学研究室从石松和玉柏石松中，运用各种现代分离
技术提取分离得到，通过 MS、NMＲ和 2D-NMＲ等技
术鉴定其结构 (见图 1) ，将其汇总如表 1，其中化合
物 1 ～ 10、12、21 来源于 Lycopodium japonicum，化合
物 11、13 ～ 20、22 来源于 Lycopodium obscurum L．
图 1 来源于石松的化合物的结构
Fig． 1 Structure of compounds isolated from Lycopodium species
表 1 来源于石松化合物的名称
Tab． 1 The names of the compounds isolated from Lycopodium species
化合物编号 化合物名称 植物来源 文献
1 3-oxo，21，24-dihydroxyserrat-14-ene L japonicum ［10］
2 3β，21β，24-trihydroxyserrat-14-ene L japonicum ［10］
3 serrat-14-ene-3β，21β-diol L japonicum ［10］
4 Phlegmaric acid L japonicum ［10］
5 Lycernuic acid A L japonicum ［10］
6 3α，21β，24-trihydroxyserrat-14-ene L japonicum ［10］
7 serrat-14-ene-3β，21α-diol L japonicum ，L obscurum L． ［10，11］
8 26-nor-8-oxo-21-epi-α-onocerin L japonicum ［10］
9 26-nor-8-oxo-α-onocerin L japonicum ［10］
10 (3α，8β，14α，21β)-26，27-dinoroncocerane-3，8，14，21-tetrol L japonicum ［10］
11 α-onocerin L obscurum L． ［11］
12 3α，21α-dihydroxyserrat-14-ene-24-yl 4-hydroxycinnamate L japonicum ［10］
13 lycopodine L obscurum L． ［12］
14 obscurumine B L obscurum L． ［12］
15 acetylannofoline L obscurum L． ［12］
16 acetyldihydrolycopodine L obscurum L． ［12］
17 flabelliformine L obscurum L． ［12］
18 acetylfawcettine L obscurum L． ［12］
19 fawcettiine L obscurum L． ［12］
20 des-N-methyl-α-obscurine L obscurum L． ［12］
21 methyl p-coumarate L japonicum ［10］
22 steroid stigmastane-3-oxo-21-oic acid L obscurum L． ［13］
35第 2 期 杨光忠，等:石松属植物化学成分抗炎活性的筛选
1． 2 细胞培养
ＲAW264． 7 细胞用含 10%灭活胎牛血清、100
U /mL青霉素和 100 μg /mL 链霉素的高糖 DMEM
培养液，在 37℃，5% CO2 培养箱中培养，2 ～ 3 d 传
代 1 次．
1． 3 MTT法检测化合物对细胞活力的影响
取对数生长期的培养细胞，用含 10% FBS 的
DMEM培养基制成 1 × 105个 /mL 单细胞悬液，以每
孔 90 μL 均匀接种于 96 孔板中，置 37℃，5% CO2
培养箱培养．待细胞贴壁良好后，加入不同浓度的化
合物 10 μL，使其终浓度分别为 50，25，12． 5，6． 25
μM，溶剂对照组加入等量的 DMEM 培养基． 每组 4
个复孔，37℃，5% CO2 培养箱培养 48 h 后，弃去培
养基，用含 0． 5 mg /mL MTT的无血清 DMEM孵育 4
h后，弃上清液，每孔加入 DMSO 150 μL，在酶标仪
上于 492 nm 处检测 A 值． 给药组的细胞活力 =
(A给药组 / A溶剂对照组)× 100% ．
1． 4 化合物对 LPS 诱导的 ＲAW264． 7 细胞 NO 释
放的影响
取对数生长期的 ＲAW264． 7 细胞，用含 10%
FBS的 DMEM培养基制成 2 × 105个 /mL 单细胞悬
液，以每孔 85 μL 均匀接种于 96 孔板中，置 37℃，
5% CO2 培养箱培养，待细胞贴壁良好．将细胞分为
7 组:正常组，不加 LPS 和药液;LPS 对照组，LPS 终
浓度为 10 μg·mL －1;阳性对照组，地塞米松(DM)
终浓度为 10 μM，LPS终浓度为 10 μg·mL －1;药物
组，根据 MTT 实验结果设置 4 个浓度梯度，且 LPS
终浓度也为 10 μg·mL －1，每组四个复孔．培养 48 h
后，收集各孔中的细胞培养上清，用 NO检测试剂盒
检测上清中的 NO含量，操作按说明书进行．
1． 5 统计学分析
应用 Graphpad prism软件进行处理，数据用珋x ±
s表示，采用 ANOVA进行统计学分析，以 p ﹤ 0． 05
为差异有统计学意义．
2 结果与分析
2． 1 化合物对 ＲAW264． 7 细胞活力的影响
MTT结果显示化合物 13 ～ 20 在 50 μM 时对
ＲAW264． 7 细胞活力的影响与空白对照组相比，无
显著性差异(p ＞ 0． 05)．化合物 1 ～ 5、9 ～ 10、21 和化
合物 6 ～ 8、11 ～ 12、22 分别在 25 μM和 12． 5 μM时
对细胞活力无明显影响，其中化合物 16、21 和 22 对
细胞活力的影响如图 2 (a，b，c) ，化合物 21 在 50
μM时对细胞活力有影响(p ＜ 0． 001) ，但在 25 μM
以下对细胞活力无影响(p ＞ 0． 05) ，所以浓度设定
在 25 μM以下． 化合物 22 在 25 μM时对细胞活力
有影响(p ＜ 0． 001) ，但在 12． 5 μM以下对细胞活力
无影响(p ＞ 0． 05) ，所以浓度设定在 12． 5 μM以下．
＊＊＊ p ＜ 0． 001，vs control group
图 2 化合物 16，21，22 (a，b，c)对 ＲAW 264． 7 细胞活力的影响
Fig． 2 Effect of compound 16，21，22 (a，b，c)on ＲAW 264． 7 cell viability
2． 2 化合物对 LPS 诱导的 ＲAW264． 7 细胞 NO 释
放的影响
正常细胞上清中 NO的浓度很低，给予 10 μg·
mL －1的 LPS诱导后上清中 NO 的含量显著增加(p
＜ 0． 001) ，阳性药地塞米松组 NO 的释放量降低(p
＜ 0． 001)． 通过对 22 个化合物筛选，发现化合物
16，21，22 可明显抑制 LPS 所致的 NO 释放，其中
化合物 16，21 的 IC50分别为(46． 84 ± 9． 64)μM 和
(10． 73 ± 4． 12)μM，并呈现一定的剂量依赖关系
(见图 3)．
45 中南民族大学学报(自然科学版) 第 34 卷
### p ＜ 0． 001 vs control group;＊＊＊ p ＜ 0． 001 vs LPS group
图 3 化合物 16，21，22 (a，b，c)对 LPS诱导的 ＲAW 264． 7 细胞 NO 释放的影响
Fig． 3 Effect of compound 16，21，22 (a，b，c)on the production of NO in LPS-induced ＲAW 264． 7 cells
3 讨论
LPS激活巨噬细胞模型被广泛用于评价各种化
学物质的抗炎作用．当 ＲAW264． 7 细胞受到 LPS 刺
激时，释放大量炎症因子(NO，PGE2，TNF-α，IL-6
等) ，若药物能抑制炎性介质或抑制产生炎症因子
的酶活性(COX-2，iNOS 等) ，就具有抗炎作用［14］．
NO作为炎症反应中的重要信使分子，既是炎症反
应与免疫调节的效应因子，也是关键的调节因子，它
由一氧化氮合酶(iNOS)催化而成，参与多种炎症信
号传导，并与多种炎症因子相互作用，产生于炎症反
应的每一阶段，故可以通过测定 NO 含量来评价某
一抗炎药物的抗炎活性．
本文研究发现:乙酰基二氢石松生物碱(16)、
对香豆酸甲酯(21)、豆甾烷-3-酮-21-酸(22)均能较
好地抑制 LPS 活化后 ＲAW264． 7 细胞 NO 的释放，
其中化合物 16 为石松生物碱，21 为酚类结构，22 为
甾体类化合物，由此可见石松发抗炎作用是多种化
合物共同作用的结果．
许多生物碱均具有体内［15，16］和体外［17］的抗炎
活性，且石松生物碱也对 LPS 诱导的 BV2 细胞释放
NO具有抑制活性，其中 α-lofoline 的 IC50低至 4． 23
μM，但其作用机制尚未报道［9］．对本文的初步结果
分析可知:乙酰基二氢石松生物碱(16)表现出较好
的抗炎活性，但 8 位引入羰基、羟基或乙酰基等极性
基团后抗炎活性消失;5 位被羰基取代后抗炎活性
也消失．由于化合物数量有限，阐明构效关系有待更
加深入的探讨和研究．
对香豆酸甲酯(21)是对香豆酸的衍生物，对香
豆酸通过 NF-κB信号通路调控炎症反应，抑制 iNOS
活性进而降低炎症因子 NO 的含量［18］．对香豆酸与
阿魏酸结构相似，阿魏酸对多种致炎剂引起的急性
毛细血管通透性增高、炎性渗出增加和组织水肿及
慢性炎性过程均具有明显的抑制作用［19］．对 LPS 诱
导的小鼠小胶质细胞炎性反应，阿魏酸可以浓度依
赖性的抑制 NO、前列腺素 E2、白介素-1β 等炎症因
子的产生，并抑制 iNOS、COX-2 蛋白的表达，作用机
制可能与其抑制 TLＲ4 的表达有关［20］． 研究中还发
现对香豆酸作为官能团连接三萜形成化合物 12 后，
其活性消失． 综上所述，本文推测对香豆酸甲酯
(21)可能通过抑制多种炎症因子及 iNOS、COX-2 等
多种酶活性来抑制 NO的释放．
甾体类抗炎药主要为糖皮质激素类(GC) ，其作
用机制主要为基因效应［21］，但是长期大剂量使用糖
皮质激素会引起许多不良反应，故甾体类抗炎药目
前仅作为治疗一些严重疾病，如多发性肌炎、皮肌
炎、系统性红斑狼疮、病情急剧恶化等． 中药石松包
含各种类型的天然产物，活性成分具有较强的抗炎
作用，对其多种成分在抗炎过程中的相互作用和作
用机制仍有待深入的研究．
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