全 文 ：中国农学通报 2012,28(21):164-168
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
Nudix(nucleoside diphosphates linked to some
moiety X)水解酶是需要Mg2+的一类酶，广泛存在于包
括病毒、细菌、真核生物（包括植物和人类）在内的250
多种生物中，它催化与其他基团(-X)结合的核苷二磷
酸(NDPX)的水解，产物为NMP+P-X。这类酶的共同
特征是含有高度保守的由 23个氨基酸残基组成的
Nudix基序(motif/box)[1]。细菌和人类Nudix水解酶至
基金项目：国家自然科学基金 (30760196)；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（中国热带农业科学院院本级）资助项目
(1630052012007)。
第一作者简介：张秀春，女，1972年出生，福建人，副研究员，博士，研究方向为作物遗传育种及生物技术。通信地址：571101海南省海口市龙华区学
院路 4号 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室，Tel：0898-66988550，E-mail：
zhangxiuchun@itbb.org.cn。
通讯作者：吴坤鑫，男，1969年出生，福建人，副研究员，博士，研究方向为作物遗传育种及生物技术。通信地址：571101海南省海口市龙华区学院
路 4号 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室，Tel：0898-66989380，E-mail：
wukunxin@itbb.org.cn。
收稿日期：2011-12-23，修回日期：2012-02-26。
拟南芥AtNUDT10启动子的分离及其功能分析
张秀春 1,2，李若霖 1,3，唐 文 1,3，夏亦荠 1，彭 明 1,2，吴坤鑫 1
（1中国热带农业科学院热带生物技术研究所/农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室，海口 571101；
2农业部转基因植物及植物用微生物环境安全监督检验测试中心，海口 571101；3海南大学农学院，海口 570228）
摘 要：根据已发表的拟南芥基因组序列设计合成一对引物，以拟南芥基因组 DNA为模板克隆
AtNUDT10上游非编码区，并与 pBAR-GUS3相连构建了植物表达载体 pNUDT10P-GUS，采用农杆菌
GV3101介导的渗透法转化野生型拟南芥，通过除草剂筛选获得了一批抗性纯合子转基因植株。然后
对转基因植株2周幼苗进行GUS活性的组织化学染色分析，并对3.5~4周的转基因植株叶片进行病原
菌诱导表达分析。结果表明，已获得AtNUDT10启动子，该启动子为组成型表达的启动子，并且病原菌
Pst.DC3000及Pst.DC3000 AvrB对该启动子没有诱导作用。
关键词：启动子；AtNUDT10；克隆；GUS染色
中图分类号：S685.12 文献标志码：A 论文编号：2011-3867
Cloning and Function Analysis of Promoter of AtNUDT10 in Arabidopsis thaliana
Zhang Xiuchun1,2, Li Ruolin1,3, Tang Wen1,3, Xia Yiji1, Peng Ming1,2, Wu Kunxin1
(1Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences/Key Laboratory of Biology
and Genetic Resources of Tropical Crops, Ministry of Agriculture, Haikou 571101;
2Environmental Safety Supervision and Inspection Center for Genetically Modified Plants
and Microorganisms Used in Plants, Ministry of Agriculture, Haikou 571101;
3College of Agronomy, Hainan University, Haikou 570228)
Abstract: 5’-UTR of AtNUDT10 was cloned by PCR from Arabidopsis thaliana and was inserted into
pBAR-GUS to form a recombined construct pNUDT10P-GUS. The construct was then used to transform
wide-type Arabidopsis thaliana by Agrobacterium tumefaciens mediating. A batch of transgenic Arabidopsis
thaliana with 5’-UTR of AtNUDT10 was obtained through glufosinate screening. The results showed that, we
had got the promoter of AtNUDT2 that was constitutive promoter. Furthermore, the expression of the promoter
could not be induced by the Pst.DC3000 and Pst.DC3000 AvrB.
Key words: promoter; AtNUDT10; clone; GUS staining
张秀春等：拟南芥AtNUDT10启动子的分离及其功能分析
少具有两大功能：清除细胞内产生的有害的代谢产物
和调节各生化途径的中间代谢产物的积累[1-4]。
与人类和大肠杆菌相比，植物Nudix水解酶基因
家族的研究起步比较晚，但对拟南芥基因组全序列进
行分析已发现拟南芥存在24个Nudix水解酶基因（命
名为AtNUDTs）[5]，分布于细胞质(AtNUDT1-11)、叶绿
体(AtNUDT12-18)和线粒体(AtNUDT19-24)中。目前
对Nudix水解酶基因家族的了解还不够充分甚至在某
些认识上存在矛盾。拟南芥第一个Nudix水解酶基因
(AtNUDT1)，体外生化分析发现 AtNUDT1是一个
NADH焦磷酸化酶[6]，在体内生理状态下表现为具有
对叶酸前体物质和（脱氧）核苷三磷酸的水解酶活性，
表明AtNUDT1是一个双功能酶[5]。
拟南芥GFG1基因(AtNUDT7)是连接细胞代谢和
活性氧信号途径的一个关键基因[7]。Bartsch等[8]的研
究结果还表明，AtNUDT7是EDS1信号途径的负调节
因子，与植物细胞程序性死亡相关。AtNUDT7还是2
个不同防御途径的负调节因子，参与保持内稳态平衡
的 调 节 [9]。 Ogawa 等 [4] 研 究 显 示 ，AtNUDT2、
AtNUDT6、AtNUDT7和AtNUDT10在体外实验中都
可以水解ADP-ribose和NADH。目前植物体内游离
ADP-ribose 的确切作用还不清楚，有研究显示
ADP-ribose很可能在细胞内成为一个损害蛋白的毒性
中间代谢产物[8]。而植物ADP-ribose上游的 PARP酶
表达的下调可以增强植物对外界压力的抗性[10]。在病
原菌侵染部位哺乳动物细胞中多个Nudix水解酶可以
因病原菌的侵入而被激活[11]。跟动物细胞类似，拟南
芥AtNUDT水解酶可能在植物防卫反应中起保护作
用。Ogawa等[12]报道过量表达AtNUDT2能增强拟南
芥的抗氧化能力。Bartsch等 [8]的研究结果也提示，
AtNUDT2、AtNUDT6、AtNUDT7和AtNUDT10可以水
解细胞内ADP-ribose从而减少游离ADP-ribose对细
胞的伤害作用，但它们在植物体内的真实作用还有待
于进一步研究。拟南芥细胞质中多种AtNudix水解酶
的生物学功能还不明确，值得进一步深入研究。为此，
笔者首次从拟南芥基因组中克隆AtNUDT10上游非
编码区，并对该非编码区进行功能分析，以期为
AtNUDT10的功能研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 拟南芥(Arabidopsis thaliana)哥伦比亚
生态型，为农业部热带作物生物学与遗传资源利用重
点实验室保存。
1.1.2 菌株和质粒 大肠杆菌(E. coli) DH5a、根癌农杆
菌 (Agrobacterium tumefaciens) GV3101 和 载 体
pBAR-GUS，病原菌Pst.DC3000及Pst.DC3000 AvrB为
农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室保
存；pMD18-T vector购自TaKaRa公司。
1.1.3 试剂 分子生物学实验用各种限制性内切酶、连
接酶等购自Promaga公司，生化试剂购自Sigma公司。
1.1.4 引物合成 所用DNA引物由上海生工生物工程
有限公司合成：25434p5：GAGATTCGGTCAATCCAG
ATAGG；25434p3：AACTAGTGGAGGAAGATTGGA
AGATTTCAAG。
1.2 方法
1.2.1 质粒提取、DNA片段克隆、重组质粒鉴定 操作
均参照分子克隆实验指南[13]。
1.2.2 DNA片段回收 采用 TIANGEN公司回收试剂
盒，并按其说明书进行操作。
1.2.3 拟南芥总DNA提取 采用CTAB法提取[13]。
1.2.4 拟南芥的转化 采用渗透法转化拟南芥[14]。
1.2.5 抗性植株的筛选 收集的拟南芥种子晒干后，撒
在用除草剂（25 mg/L glufosinate，配制方法为 150 μL
RELY (18.19% glufosinate ammounium)定容至 1 L）浸
泡过的培养基质上。4℃暗培养2天后，置于培养室培
养，培养条件为22~24℃，16 h光照。
1.2.6 抗性植株 PCR检测 采用NaOH法快速提取植
物基因组 DNA，以基因组 DNA为模板，BAR-219F
(GGTCTGCACCATCGTCAACCACTACA) 和 BAR-
671R (GGCAGGCTGAAGTCCAGCTGCCAGAA) 为
引物，反应体系参照产品说明书进行PCR检测。反应
条件为：94℃预变性 5 min；94℃变性 40 s，55℃退火
30 s，72℃延伸 40 s，25个循环；最后 72℃延伸 5 min。
PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离。
1.2.7 病原菌的培养和接种 病原菌DC3000的培养和
接种如文献[15]报道。具体如下：将菌种在固体King’s
Medium（含Rif 50 μg/mL）平板划线，28℃培养24 h，挑
取单菌落转接于40 mL的液体King’s Medium培养基
里，28℃摇床震荡培养，直至OD600=0.6备用。将培养
好的病原菌用 10 mmol/L MgCl2稀释至OD600=0.1，用
没有针头的注射器的注射器口紧贴叶片背面，然后用
力缓慢推折射器使菌液完全注入半片叶子，接种时看
到接种处的右半边叶片湿润为止。每个株系接6个重
复（6棵），每个重复接种 3片叶子，分别取注射 1、5、
24 h后的叶片进行GUS活性的组织化学染色分析，以
注射 10 mmol/L MgCl2为对照。本研究做 8个独立的
转基因株系，重复3次。
1.2.8 GUS活性的组织化学染色分析 经除草剂抗性
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筛选后获得的抗性植株，选择T2代种子抗性筛选存活
比率为3:1的2周幼苗和T2代GUS呈阳性的8个株系进
行自花授粉产生的T3代纯合子4周幼苗进行病原菌注
射后的叶片进行GUS活性的组织化学染色分析[16]，具
体如下：将待检测的样品与底物X-Gluc（1.0 mmol/L
X-Gluc；50 mmol/L磷酸缓冲液，pH 7.0；10 mmol/L
EDTA-Na，pH 8.0；甲醇，终浓度 20%；0.1% Triton
X-100；10 mmol/L巯基乙醇）的染色反应液于 37℃保
温过夜，进行组织化学染色，然后用 50%乙醇进行脱
色。
2 结果与分析
2.1 AtNUDT10启动子的分离、克隆和测序
根 据 GenBank 序 列 (CP002687.1)，设 计
AtNUDT10 上游非编码区的特异引物 25434p5 和
25434p3，以拟南芥基因组DNA为模板，进行 PCR扩
增。反应条件为：94℃预变性 5 min；94℃变性 50 s，
55℃退火 40 s，72℃延伸 90 s，25个循环；最后 72℃延
伸 10 min。PCR产物经质量浓度为 10 g/L的琼脂糖
凝胶电泳分离，得到 1400 bp左右的特异扩增产物，
大小与预期一致，结果如图 1 所示。将其与
pMD18-T载体连接后在含 X-gal和 IPTG的固体 LB
培养基上进行重组子的筛选，并对其中的 1个白斑
进行 PCR和酶切鉴定。PCR鉴定结果如图 1所示，
以 25434p5和 25434p3为引物，从白斑提取的质粒为
模板的 PCR扩增产物与以基因组 DNA为模板的
PCR扩增产物大小相同，均在 1000 bp和 2000 bp之
间出现一条明亮条带，说明待鉴定质粒含有与基因
组扩增产物相同的片段。重组质粒双酶切鉴定如图
2所示，AgeⅠ和 SpeⅠ双酶切切下与预期大小的片
段。经测序确认与GenBank完全一致（图略），得到
含有AtNUDT10上游非编码区的克隆载体，命名为
pNUDT10P。
2.2 植物表达载体的构建
将克隆载体pNUDT10P用AgeⅠ和SpeⅠ双酶切，
回收 1400 bp 的目的片段，与经同样双酶切的
pBAR-GUS 相连，获得的重组质粒以 25434p5 和
25434p3为引物，进行 PCR鉴定结果如图 3所示。并
用AgeⅠ和SpeⅠ双酶切鉴定该重组子，结果如图4所
示。PCR和酶切结果均证明重组质粒的构建是正确
的，经测序确认获得以GUS为报告基因的植物表达载
体，命名为pNUDT10P-GUS。
2.3 抗性植株PCR检测
用渗透转化法，将 AtNUDT2上游非编码区及
GUS报告基因转入拟南芥，经除草剂抗性筛选获得65
1 2 3 M
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1：以基因组DNA为模板的AtNUDT10上游非编码区PCR扩增产物；
2：以重组质粒pNUDT10P为模板的PCR扩增产物；
3：以ddH2O为模板的扩增产物；M：DNA Marker
图1 AtNUDT10上游非编码区PCR扩增和重组质粒
pNUDT10P PCR鉴定
1 M
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1：重组质粒pNUDT10P/AgeⅠ + SpeⅠ；M：DNA Marker
图2 重组质粒pNUDT10P酶切鉴定
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1 M2
1：以质粒pNUDT10P为模板的PCR扩增产物；
2：以质粒pNUDT10P-GUS为模板的PCR扩增产物；M：DNA Marker
图3 重组质粒pNUDT10P-GUS PCR鉴定
1 M
15000 bp
10000 bp
7500 bp
5000 bp
2500 bp
1000 bp
1：重组质粒pNUDT10P-GUS /AgeⅠ + SpeⅠ；M：DNA Marker
图4 重组质粒 pNUDT10P-GUS酶切鉴定
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张秀春等：拟南芥AtNUDT10启动子的分离及其功能分析
株抗性植株。用引物BAR-219F和BAR-671R对抗性
植株进行PCR检测，部分结果如图5所示，所检测植株
的扩增结果均与质粒 pNUDT2P-GUS的扩增结果相
同，在 250~500 bp之间出现一条明亮条带，大小与预
期一致，证明抗性植株均含有bar基因片段，获得了转
基因植株。
2.4 AtNUDT10上游非编码区在拟南芥中组织特异性
表达
对以上筛选 bar基因阳性的T2代转基因材料 2周
的幼苗进行GUS组织化学染色，结果显示AtNUDT10
在真叶中均有表达，但在叶脉中表达量还是比较高（图
6A），在根和茎中均有高效表达（图6B）。
2.5 病 原 菌 Pst.DC3000 及 Pst.DC3000 AvrB 对
AtNUDT10启动子的诱导表达分析
为检测病原菌 Pst.DC3000及 Pst.DC3000 AvrB是
否对 AtNUDT8启动子具有诱导作用。分别用 Pst.
DC3000及Pst.DC3000 AvrB注射T2代GUS呈阳性的8
个株系进行自花授粉产生的T3代纯合子4周幼苗的叶
片，分别取注射1、5、24 h后的叶片进行GUS活性的组
织化学染色分析，以注射 10 mmol/L MgCl2为对照
(CK)。结果如图 7所示，转基因植株右半边的叶片病
1M 2 3
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M：DL2000 DNA ladder；1：质粒pNUDT10P-GUS PCR扩增产物；
2~3：拟南芥抗性植株PCR扩增产物
图5 转基因植株的PCR鉴定
CK 1 h 5 h 24 h
A
B
图7 病原菌Pst.DC3000(A)及Pst.DC3000 AvrB(B)对AtNUDT10启动子的诱导表达分析
A：真叶；B：幼苗
图6 AtNUDT10启动子在拟南芥中的表达
原菌诱导后 1、5、24 h的GUS的表达与左半边没有注
射以及注射10 mmol/L MgCl2的对照并没有区别。
3 结论和讨论
AtNUDT10是真核生物中广泛存在的Nudix水解
酶的一员，分布于细胞质中。目前关于AtNUDT10的
研究报道不多，对其功能不是很清楚。为此，笔者以拟
南芥基因组DNA为模板克隆AtNUDT10上游非编码
区，并与 pBAR-GUS 相连构建了植物表达载体
pNUDT10P-GUS，采用农杆菌GV3101介导的渗透法
转化野生型拟南芥，通过除草剂筛选获得了一批抗性
纯合子转基因植株。然后对转基因植株2周幼苗进行
GUS活性的组织化学染色分析，并对 3.5~4周的转基
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因植株叶片进行病原菌诱导表达分析。结果显示已获
得AtNUDT10启动子，该启动子为组成型表达的启动
子。与Ogawa等[4]的研究报道AtNUDT10在叶中的转
录水平明显底于根和茎中的转录水平不同，笔者的研
究结果显示，AtNUDT10启动子在根、茎和叶中的活性
都比较高并且基本一致。这可能是不同的培养条件引
起的。Jambunathan等 [17]报道野生型拟南芥(Col-0)的
AtNUDT2、AtNUDT6和AtNUDT7在营养丰富程度不
同的培养基质培养表达水平是有差异的。本研究还表
明病原菌Pst.DC3000及Pst.DC3000 AvrB对该启动子
驱动的 GUS表达没有诱导作用，与 Adams-Phillips
等[18]的报道相一致。本研究将为AtNUDT10的功能研
究提供基础。
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