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论 文 第 51卷 第 18期 2006年 9月
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多种胁迫下拟南芥气孔“开”和“闭”突变体鉴定及
遗传初步分析
宋玉伟 康燕丽 刘 浩 赵孝亮 王棚涛 安国勇 周 云 苗 琛 宋纯鹏*
(河南省植物逆境生物学实验室, 河南大学生命科学学院, 开封 475001. * 联系人, E-mail: songcp@henu.edu.cn)
摘要 保卫细胞可以整合和处理多种复杂的环境信号刺激, 从而使气孔处在合适的开闭状态以适应外
界环境的变化. 但是保卫细胞对多种刺激反应过程中许多中间成分及其信号转导的细节知之甚少. 利
用远红外成像仪, 建立起气孔反应的筛选体系, 在不伤害植物的前提下, 对经化学诱变的拟南芥幼苗进
行多种胁迫信号(干旱、H2O2及 CO2等)单独或复合处理, 以幼苗叶片温度高于或低于正常植株 0.5℃以
上为筛选指标, 通过对大约 6万株诱变后的拟南芥M2代幼苗进行筛选, 得到了 40多株拟南芥气孔突变
体. 经过对这些突变体后代进行生理和杂交遗传分析, 发现所得突变体为隐性单基因突变所致, 并且突
变体对气孔关闭的调节上都与野生型有明显的差异. 这些突变体的获得为探索保卫细胞内复杂的信号
转导网络提供了良好的遗传材料.
关键词 远红外热像仪 保卫细胞 遗传分析 信号转导
气孔开闭控制着光合作用所需 CO2 的摄取和蒸
腾作用水分的散失 , 因而气孔开闭的调节严重影响
着作物的产量. 对所有生活着的有机体来说, 最重要
的是如何感受和适应不利环境. 由于植物无法移动,
它必须忍受环境胁迫 , 因此对于研究环境的感知和
适应来说, 植物是最理想的模式. 众所周知, 保卫细
胞具有非常灵敏的感受外界信号变化的能力 , 如在
干旱条件下 , 植物地上部分还未检测到任何水分变
化时, 植物气孔已迅速关闭[1]. 诸多证据表明[2,3], 各
种胁迫或刺激(干旱、淹水、ABA和氧化胁迫等)都可
引起细胞内信号转导过程, 最终表现为气孔运动[4~7].
因此 , 气孔成为植物连接外界环境刺激的重要枢纽
之一. 弄清植物对外界环境的反应机制, 不仅有利于
阐明其基本的生物学特征 , 而且对农业生产极为重
要.
ABA, CO2, H2O2和光等许多因子的刺激可以被
气孔保卫细胞所感知 , 而后保卫细胞迅速整合和传
递这些刺激信号, 最终调节气孔膨压的变化, 使气孔
处于最适宜的开闭状态 , 从而使保卫细胞最大限度
地优化气孔对 CO2 的吸收和减少因蒸腾导致的水分
散失 . 保卫细胞内发生的一系列信号转导过程包括
细胞内离子的流动、糖类变化、细胞骨架的组织、跨
膜转运和基因表达等 [8,9]. 但是 , 不同的刺激又有其
信号转导的特殊性. 首先, 许多干旱胁迫诱导基因表
达需要内源 ABA的积累, 并且能对外源 ABA处理作
出反应. 但在拟南芥 aba 和 abi 突变体中, 在干旱或
者冷胁迫的条件下一些胁迫诱导的基因不需要内源
ABA 的积累[10,11]. 因此, 在干旱胁迫反应中, 存在依
赖于 ABA 和不依赖于 ABA 的信号转导途径. 其次,
H2O2 作为信号分子调节气孔的运动, 其调节过程与
ABA对气孔运动的调节有许多类似之处[7,12,13]. ABA
通过 NADPH 氧化酶激活保卫细胞内 H2O2 的合成,
并激活质膜钙离子通道[13]. 最近发现, ABA诱导保卫
细胞内 H2O2产生和积累的过程中, 磷脂酰肌醇 3-磷
酸(PI3P)正调节了 H2O2的合成[14]. ABI1和 ABI2编码
蛋白质磷酸化酶 2C 类的酶, 二者都参与了气孔的关
闭过程. 已经证明, 在 ABA 不敏感突变体 abi1-1 中,
ABA不能诱导 H2O2的产生; 相反 abi2突变体中仍能
产生 H2O2[15], 说明 ABI1 可能在 H2O2信号转导的上
游, 而 ABI2则在其下游. ost1突变体对 ABA不敏感.
ABA 可以激活野生型保卫细胞原生质体 OST1 激酶
活性, 但是不能诱导 ost1 突变体细胞产生 H2O2, 相
反 H2O2仍能诱导气孔的关闭[16]. 因此, OST1调节的
H2O2可能直接作用于 NADPH氧化酶. 最后, 大气中
CO2浓度的升高可以减小气孔的开度, 同时影响到气
体的交换[17~19]. CO2浓度可以改变胞质游离钙离子浓
度 [20], 进而激活慢速阴离子通道和外向钾离子通
道[21], 因此 CO2在一定程度上和 ABA 相互共享某些
成分. 但是在 abi1-1 和 abi2-1 中 CO2却能像诱导野
生型一样而诱导气孔关闭[21]. 总之, 细胞感受和传导







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CO2信号的途径不同于ABA信号途径. 因此, 保卫细
胞可以感受各种不同环境刺激, 并引起气孔的反应,
但对其信号转导细节仍然所知甚少.
保卫细胞存在许多信号转导途径 [8,9]. 最初人们
认为 , 信号刺激到气孔反应间的信号转导途径是相
互独立的. 但是, 许多证据表明, 这似乎不足以解释
目前所鉴定的许多信号分子的作用[9]. 现在已经知道,
不同信号途径可以共享相同中间成分, 如 ABA, H2O2,
CO2和光等因子在引起气孔运动的过程中, 都可以引
起保卫细胞内游离 Ca2+浓度的升高; 同样, ABI1 和
ABI2编码 PP2C磷酸化酶参与了 ABA, H2O2, CO2 和
暗诱导的保卫细胞信号转导过程. 因此, 气孔开度的
调控需要有机整合许多细胞反应过程 . 随着对保卫
细胞中反馈和整合这些不同过程所需中间成分的了
解 , 进一步认识到各种不同环境刺激所引起的信号
转导途径在保卫细胞内组成一个复杂的网络[2,6,22~24].
因此 , 目前对保卫细胞如何将不同复杂信号整合为
单一的反应缺乏了解 , 这需要进一步鉴别这个网络
中许多新的成分.
然而, 由于很难宏观地检测气孔的开闭, 在植物
保卫细胞信号转导的研究中 , 利用拟南芥模式体系
进行遗传学筛选仍然存在很多技术上的困难 . 叶片
通过气孔而蒸发水分 , 水分蒸发后可以降低叶片表
面的温度 , 远红外成像仪可以检测叶片温度的微小
差异 . 现在已经成功利用对温度敏感的远红外热成
像系统 , 以气孔保卫细胞的开闭引起叶片表面温度
微小变化为监控指标 , 构建了有效的遗传学筛选体
系 [25]. 由于远红外监测系统可以在不伤害植物的情
况下, 使得多种刺激可以同时作用于植物. 因此, 在
此基础上, 我们利用这种研究体系, 首次综合地分析
多种刺激所引起的信号转导突变体 . 用甲基磺酸乙
酯(EMS)诱变拟南芥种子, 其 M2 代幼苗用红外进行
筛选, 得到 40 多株温度不同的气孔反应突变体, 并
分析这些突变体对 ABA, H2O2, 干旱和 CO2的反应.
在我们鉴定多种信号转导的突变体中 , 综合分析各
成分及其刺激之间的关系 , 有可能发现气孔的信号
转导过程中哪些成分是共享的, 哪些成分是特异的,
以及信号转导途径之间的交叉对话 , 以构筑保卫细
胞信号转导网络中不同刺激条件所引起的共同反应
结构细节.
1 材料与方法
(ⅰ) 远红外热像仪. ThermaCAM SC3000 (美
国)配备 320×240 PtSi探测器, 它能够探测短波红外
线(8~9 µm). 在室温下温度分辨率可小于 0.03℃. 成
像仪安装在距叶片 35~45 cm 的高度进行检测, 同时
连接有监视器以利于得到可视的植物热成像 . 拍摄
的热成像以 14 bit TIFF的格式图存于 PMCIA存储卡
中 , 随后通过计算机用仪器所配热成像处理程序对
热成像、面积分析、温度频度分布直方图进行分析处
理.
(ⅱ ) 植物材料诱变 . 以拟南芥 (Arabidosis
thaliana Ecotype C24)种子为材料 . 诱变方法如下 :
称取 1.5 g (约 70000 粒)野生型种子, 用双蒸水浸泡
6~8 h 后 , 置于含有 0.4% (体积比 )甲基磺酸乙酯
(EMS)的 100 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.5)的三角瓶中,
封口后放在水浴(25℃)振荡器上振荡 8 h. 然后用双
蒸水漂洗种子 10~15次, 每次 10 min. 漂洗后的诱变
种子放于滤纸上, 干燥后备用.
(ⅲ) 诱变植株培养. 将经 EMS 诱变处理后的
拟南芥种子(M1)均匀播种于混有蛭石的营养土中(蛭
石:营养土为 3:1, 体积比), 每株周缘间隔大约 1 cm
左右, 种植后覆盖塑料薄膜以保持湿度. 待 4℃春化3 d
后, 放于温室(温度18~22℃, 光照强度200 µmol·m−2·
s−1, 光暗周期 16 h/8 h, 相对湿度 65%)培养, 并采收
M2代种子. M2代筛选群体的培养同 M1代.
(ⅳ) 干旱, H2O2, CO2处理及远红外成像仪对 M2
代幼苗的筛选. 待诱变的M2代幼苗生长 4~6片真叶
时, 以 5 d干旱、900~1000 µL/L CO2和 5 mmol/L H2O2
处理. 其中 CO2处理在人工气候箱内进行. H2O2处理
则采用根部浇施. 通过远红外成像仪对干旱、CO2和
H2O2处理后的 M2代幼苗进行叶面温度检测, 筛选出
叶温有明显差异的植株作为潜在突变体 , 将其从群
体中移出单独培养 . 待单株收种子后进行遗传和生
理分析.
(ⅴ) 气孔开度和叶片失水率测定. 气孔开度实
验参照 Zhang等人[7]的方法略加改动, 小心撕取拟南
芥野生型和突变体叶下表皮 , 用毛笔轻轻刷去叶肉
细胞 , 置于载玻片上 , 在倒置显微镜(10×40)下 , 用
测微尺测量气孔的开度大小. 每次观察取 3片表皮条
随机选取 6个视野, 每个视野测量 40个气孔. 每种处
理共记测定记录 240 个气孔的开度. 每个实验重复
3~5 次, 统计其平均值和平行实验间的方差. 叶片失
水率测定参照 Mustilli等人[16]的方法.







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2 结果
2.1 ABA, 干旱, H2O2和 CO2对拟南芥叶片表面温
度的调节
首先 , 将远红外热像仪安装并固定在特定的培
养室内(图 1(a)). 然后确立干旱, H2O2和 CO2筛选条
件. 干旱筛选条件的确定是把 ABA缺失突变体 aba3
和野生型植物种植于同一盆中 , 然后取生长不同时
间的拟南芥幼苗进行不同时间的断水处理(以天数计
算), 得到叶片表面显示温差的准确时间(图 1(b)和
(c)). 对于 CO2和 H2O2则通过选取一系列的浓度对不
同时期的拟南芥野生型幼苗进行胁迫处理(图 1(d)和
(e)), 所有胁迫处理前都进行红外分析存取对应的非
胁迫热成像作为对照 . 同时对于每一次处理都有严
格的非胁迫处理作为对照, 最后确定结果为 5 d的干
旱, 5 mmol/L H2O2和 900~1000 µL/L CO2处理 8 d左
右的拟南芥野生型幼苗叶温有明显差异 , 差异都在
1℃左右(图 1(f)), 从而确定它们为筛选的最佳条件.
2.2 气孔对 ABA, 干旱, H2O2和 CO2反应的突变体
的筛选
为了大规模筛选气孔反应的突变体 , 我们用甲
基磺酸乙酯(EMS)诱变了的拟南芥野生型种子, 分成
30 组撒播于土壤中, M1 代种子通过自交获得大约 8
万粒 M2代种子. 如果调节气孔运动的某个基因发生
了突变, 在干旱、H2O2 及 CO2 等的胁迫中往往会造
成植株气孔的开闭调节失调 , 从而造成植物叶片水
分的蒸腾出现差异 , 而叶面水分的蒸腾强弱则使叶
面温度出现差异 , 进而通过远红外成像仪精确的检
测出来 , 并且能把这种通过传统手段很难量化的指
标以可视化图像呈现出来.
当某一个基因的突变造成气孔对某胁迫刺激调
节失调后, 会表现出过分的“开”和“关”. 我们把胁迫
刺激下气孔过分的“开”称作不敏感(insensitive), 过
分的“关”则称作敏感(sensitive). 与正常植株叶片温
度相比, 过分的“开”和“关”会导致叶温偏低和偏高.
当对诱变的 M2代幼苗进行筛选时, 叶温有低于周围
幼苗的突变体, 也有叶温高于周围幼苗的突变体. 其
中对于干旱胁迫反应的突变体中 , 叶温低的命名为
dri (drought-insensitive) (图 2(b)), 叶温高的命名为
drs (drought-sensitive); 对于 H2O2胁迫反应的突变体
中, 叶温低的命名为 hpi (hydrogen peroxide- insensi-
tive), 叶温高的命名为 hps (hydrogen peroxide- sensi-
tive); 对于 CO2胁迫反应的突变体中, 叶温低的命名
为 cdi (carbon dioxide-insensitive), 叶温高的命名为










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图 2 拟南芥幼苗气孔对干旱、H2O2和 CO2反应的突变体的筛选
(a) 筛选植物的生长状态; (b) 筛选的红外热成像(箭头所示为叶温差异突变体); (c) 野生型叶温和突变体叶温的变化;
(d) 多胁迫条件下筛选拟南芥气孔突变体流程图

cds (carbon dioxide-sensitive).
为了使筛选的结果更准确 , 我们对实验的外部
条件也进行了优化 . 控制室温为 21~23℃ , 湿度为
55%~60%. 在筛选时尽量保证筛选箱内空气流速低
于 0.1 m/s, 以保证通过监视器显示的叶面温度稳定,
尽量使由于气孔不同开关程度可能导致叶片温度的
差异达最优化 . 在被观测的热成像范围内 , 所有蒸
腾速率相同的植株尽量保持均一的温度显示. 同时,
为了能够在热成像中把单个的幼苗区分开来 , 也尽
可能减少筛选突变体所需培养的面积 . 种植的密度
为每株约 1.5 cm2, 对筛选出的叶温差异突变体进行
移栽和单独培养 . 对叶温低和叶温高的突变体进行
叶面温度统计分析 , 其结果分别可达 1.0 和 0.5℃
左右.
通过远红外成像仪对大约 70000 棵经胁迫处理
(干旱、H2O2和 CO2)的拟南芥 M2幼苗进行初步筛选,
共得到了 40 多株叶温差异的潜在突变体, 根据叶温
的差异程度进行了分类(表 1). 把这些潜在突变株进
行单独培养, 其中的 42 株是可育的, 得到的种子即
M3代用于遗传分析.
2.3 突变体的遗传学特性分析
对所得到的突变体进行遗传杂交及表型分析发
现, 多数是单基因隐性突变(表 2, 图 3(a)和(b)), 突变
体和野生型的叶温差可达 1.8℃(图 3(c)).
表 1 各种潜在突变体气孔反应的分类
类别 1a) 2b) 3c) 共计(株系)
dri (drought-insensitive) 4 5 9 18
drs (drought-sensitive) 1 2 2 5
hpi (hydrogen peroxide-insensitive) 2 4 6 12
hps (hydrogen peroxide-sensitive) 1 1 4 6
cdi (carbon dioxide-insensitive) 1 3 2 6
cds (carbon dioxide-sensitive) 0 0 2 2
a) 温度差异 1.5℃以上; b) 温度差异 1~1.5℃; c) 温度差异 0.5~
1℃

表 2 突变体遗传学分析
F1 F2 杂交类型
野生型 突变体 野生型 突变体 总计 χ2
WT×dri1 266 0 485 158 643 0.05
WT×drs1 399 0 691 225 916 0.08
WT×hpi1 300 0 736 250 986 0.07
WT×hps1 466 0 456 147 603 0.12

2.4 突变体对 ABA, H2O2及 CO2多胁迫因子反应的
特性分析
我们对各类突变体进行 ABA, H2O2, CO2多胁迫
因子处理, 以观察其叶温变化. 结果表明, 不同类型
突变体在不同胁迫处理下 , 叶温差异的表型反应不
同, 同一类型的不同株系也有不同的叶温差异(图 4,
表 3). 如 dri1 不仅对干旱处理不敏感, 同时对 ABA,







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图 3 突变体叶温差异稳定遗传分析.
(a) 干旱处理后 dri1和野生型植物生长状况; (b) 干旱胁迫后 dri1和野生型的叶温差异红外热成像; (c) dri1和野生型
叶温的变化. (a)和(b)中左边两竖行为野生型, 右边两竖行为 dri1


图 4 突变体在 ABA, H2O2和 CO2处理下的叶温分析

H2O2和 CO2的处理都不敏感; 而 dri2 却只对 CO2的
处理没有反应. 这些结果说明, 可能由于突变基因在
保卫细胞中的信号转导链中担当角色不一样 , 有的
在多条信号途径起着交叉点的作用 , 有的却只在一
条信号转导通路中起作用.
测定突变体及野生型胁迫前后叶温的变化结果
表明, 对胁迫处理不敏感的突变体(如 dri, hpi, cdi)前
后差值变化不大, 而对胁迫处理敏感的突变体(如 drs,
hps, cds)前后差值变化较大(图 5(a)). 同时, 分析叶片
失水率(图 5(b))和气孔开度(图 5 (c))的关系, 发现叶
温差异及失水与它们的气孔开度是一致的 . 当胁迫
处理时, 不敏感突变体均表现出叶温低, 叶片失水率
都比野生型要大 , 气孔的关闭机制出现了不同程度
上的失调. 反之, 敏感突变体均表现出叶温高, 叶片
失水率都比野生型要小 , 气孔的张开机制出现了不
同程度上的失调, 其原因可能是当受到胁迫刺激后,
不敏感的突变体表现出气孔的关闭障碍 , 使气孔处
于开的状态, 导致了水分从叶面大量丧失, 其结果使
叶温低; 反之, 敏感的叶温就高.
另外 , 对所筛选到的突变体进行了各种胁迫处
理, 种子萌发检测结果显示, 突变体种子萌发的时间
比野生型提前或延迟 , 有的表现对胁迫的极度不敏
感. 同时, 对它们的生长发育状态进行跟踪观察, 发
现许多突变体的生长表型发生了极大的变化 , 如基
生莲座叶数增多、开花期或推迟或提前、茎生叶莲座
化、产籽量少、气孔数目增多、叶片变小叶色变暗绿、
株型大小发生较大差异的改变等.
3 讨论
气孔可以对ABA, 干旱, H2O2和CO2等刺激迅速







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图5 突变体离体叶片失水率、气孔开度和胁迫前后叶温变化
(a) 野生型和突变体在胁迫处理前后的叶面平均温度差值比较; (b) 野生型和突变体离体叶片失水率;
(c) 在胁迫处理下野生型和突变体的气孔开度

做出反应, 并协调植物水分蒸腾和光合作用. 分析植
物对这些因子的感受及引起信号转导的中间成分, 成
为研究植物对外界感应的重要方面. 通过远红外成像
仪得到几十种气孔反应的突变体, 它们对 ABA 等呈
现不同的反应. 这些可以用于综合分析外部几种环境
刺激和内部发育趋势的整合而形成的复杂信号转导途
径, 得到的信息可能回答植物信号转导的本质.
由于只有在微观情况下才能测定气孔开度 , 因
此对气孔反应的分子遗传学分析一直不够深入 . 目
前已有的突变体都是在分析其生理过程中得到的 ,
如 abi1, abi2, aba2, gin1, san3, sre1是通过萌发筛选
得到[2,6,8,13]. 气孔的关闭会减少水分的蒸腾从而使叶
片表面的温度升高 , 通过远红外成像仪能够把这种
微小的差异检测出. Merlot等人[25]通过此方法筛选到
拟南芥 ost1 突变体, 为理解气孔调控机制提供了许
多有价值的信息. 由于植物水分蒸腾的 98%是通过
气孔进行的 , 因此 , 用这种筛选方法是非常有效的 .
当然 , 蒸腾降温所带来的变化不但依赖于气孔本身
的变化 , 而且还依赖于气孔的密度以及表皮上的水
分丧失. 另外, 遗传突变也可能会影响到植株的发育.
由于突变可能会导致植物叶片表面的蜡质层结构变
化而改变叶片的透性 , 故在某种程度上会造成叶片
失水加速而出现叶温差异. 因此, 这种方法仍然会提
供许多有关气孔发育的遗传变异的材料.
目前得到的这些突变体 , 可能分别特异地对
ABA, CO2, H2O2 和干旱等做出反应, 这也是我们所
预期的. 同时, 还发现有些突变体对所有的因子敏感
和不敏感(图 4), 这些可能是信号转导共享的某些成
份, 因此还有许多地方需要进一步的研究. 但是, 值
得注意的是 , 对筛选到的突变体进行遗传和生理特
性分析发现 , 大部分突变体在气孔的调节上都出现
了失调(图 5(c)), 表明在这种实验条件下叶片的温度
主要依赖于气孔的导度 , 也肯定了保卫细胞控制气
孔开度而造成的水分散失起着主要的作用.
研究表明, H2O2 不仅参与了植物对各种逆境的
防御作用 , 而且作为信号分子参与了许多生理反应
的调节, 如细胞程序性死亡[26]、ABA 诱导的气孔关
闭和基因的表达[7,13]、生长素调节的重力反应[27]、机
械伤害发应[28]、系统获得抗性[29]、植物的病害反应[30]
等. 众多结果表明, 在各种胁迫中, H2O2扮演着不同
的信号角色, 而不同的信号途径又存在相互的交叉.
本研究结果也表明的这一点. dri1对 H2O2, CO2, ABA
的胁迫处理都表现出不敏感 , 表明该基因被多种信
号通路共享 , 因而有可能在整合多种因子的刺激过
程中有非常关键的作用. 而 dri2 虽然对 H2O2, ABA
处理不敏感, 但是却对 CO2敏感, 说明该基因可能没
有介导 CO2 信号的转导(图 4). 研究表明, 叶面气孔
的数目和形成被 CO2严格调控[31], CO2可能直接影响
到质膜上的阴离子通道等[21], 但调节蛋白(CCM1)[32]
和蛋白磷酸酶参与了对CO2的感知. 在哺乳动物中的
研究结果表明, CO2 参与了 MAPK 信号传递途径[33].
Raschke[34]在植物中观察到在 CO2升高的作用下气孔
并不能关闭, 除非叶片用 ABA 处理. 近来在拟南芥
中报道了类似的结果 [35]. 此外 , 对根进行渗透胁迫,
气孔对 CO2的敏感度将增加[36]. 这些结果都表明, 在
CO2和 ABA信号转导途径有紧密的交叉和联系.
目前, 对于ABA, H2O2和CO2的信号转导有许多
问题尚待研究. 尤其在保卫细胞中 H2O2, CO2, ABA
的下游靶目标作用方式是一个重要的研究领域 . 拟
南芥保卫细胞内干旱, H2O2和CO2信号交叉突变体的







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筛选将会极大地推进该领域的研究. 目前, 我们筛选
到大量对干旱, H2O2, CO2有反应的叶温差异突变体,
这些突变体的获得为研究气孔调节的保卫细胞内复
杂的信号转导网络提供了难得的遗传材料 , 为阐明
在干旱、H2O2和 CO2胁迫刺激下植物保卫细胞内外
感受及细胞间和细胞内的信号转导机制建立了一个
重要的遗传分析框架; 为在干旱、氧化胁迫及大气日
益增多的 CO2 下如何提高作物产量提供了分子改良
的遗传学依据和基础.
致谢 感谢董发才教授、侯廷燕老师在实验过程中给予的
大力支持和帮助 . 本工作为国家重点基础研究发展计划
(批准号 : 2003CB114305)和国家自然科学基金 (批准号 :
39870372, 30370765和 30440079)资助项目.
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(2006-03-08收稿, 2006-07-28接受)