全 文 ：第３７卷第５期
２０１４年９月
河 北 农 业 大 学 学 报
ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＯＦ　ＨＥＢＥＩ
Ｖｏｌ．３７Ｎｏ．５
Ｓｅｐ．２０１４
文章编号：１０００－１５７３（２０１４）０５－００１２－０６　 ＤＯＩ：１０．１３３２０／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊａｕｈ．２０１４．０１０６
大量提取拟南芥保卫细胞原生质体方法的优化
梁　芸，孙　宁，魏凤菊
（河北农业大学 生命科学学院，植物逆境研究室，河北 保定 ０７１００１）
摘要：保卫细胞在植物的生理和发育过程中发挥着重要作用，由于拟南芥作为研究材料自身的优越性，其保卫
细胞成为研究信号转导机制的良好系统，对于基因组学和蛋白质组学分析具有重要意义。然而，大量获取保卫
细胞原生质体存在一定的难度。本研究以拟南芥为材料，在两步酶解法的基础上，改用更加经济的纤维素酶，
摸索酶浓度及酶解时间，旨在获得一套可以快捷、高效、低成本提取保卫细胞原生质体的方法。结果表明：黑暗
条件下，２２℃，酶解液Ｉ酶解１ｈ，酶解液ＩＩ（纤维素酶Ｏｎｏｚｕｋａ　Ｒ－１０浓度２．５％）酶解２ｈ，可最大量地收集原生
质体。
关　键　词：保卫细胞；原生质体；大量提取；优化
中图分类号：Ｑ９４３ 文献标志码：Ａ
　　收稿日期：２０１４－０４－１８
　　基金项目：国家自然科学基金专项基金项目（３１０４００５２）；国家自然科学基金青年基金项目（３１１０１０２２）．
　　作者简介：梁　芸（１９９０－），女，河北省平山县人，在读硕士生，主要从事植物逆境研究．
　　通讯作者：魏凤菊（１９７９－），女，河北省衡水人，博士，讲师，主要从事植物抵抗逆境分子机制方面的研究．
Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｅｉｆｊ９８＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｕａｒｄ　ｃｅｌ
ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　ｆｒｏｍＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ
ＬＩＡＮＧ　Ｙｕｎ，ＳＵＮ　Ｎｉｎｇ，ＷＥＩ　Ｆｅｎｇ－ｊｕ
（Ｐｌａｎｔ　Ｓｔｒｅｓｓ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｈｅｂｅｉ，Ｂａｏｄｉｎｇ　０７１００１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｇｕａｒｄ　ｃｅｌｓ　ｐｌａｙ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｐｌａｎｔｓ．Ｔｈｅ
ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｖａｉｌａｂｌｅ　ｆｏｒ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｍａｋｅ　ｉｔ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｆａｖｏｒａｂｌｅ　ｐｌａｎｔ　ｓｐｅｃｉｅｓ
ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｇｕａｒｄ　ｃｅｌ　ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ　ａｎｄ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｇｅｎｏｍｉｃｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，ｂｕｔ　ｉｔ　ｉｓ
ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ　ｔｏ　ｉｓｏｌａｔｅ　ｈｉｇｈｌｙ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｌａｒｇｅ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｏｆ　ｇｕａｒｄ　ｃｅｌ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ
（ＧＣＰｓ）ｆｒｏｍ　ｔｈｉｓ　ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｒｅｐｏｒｔ，ｗｅ　ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ　ｉｓｏ－
ｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＧＣＰｓ　ｆｒｏｍＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ．Ｉｔ　ｉｓ　ｏｕｒ　ｈｏｐｅ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｄｅｔａｉｌｅｄ　ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ　ｐｒｏ－
ｖｉｄｅｄ　ｂｅｌｏｗ　ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　ｓｅｔ　ｏｆ　ｔｉｍｅ－ｓａｖｉｎｇ，ｈｉｇｈ－ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，ｈｉｇｈｌｙ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ，ｌｏｗｃｏｓｔ　ｍｅｔｈ－
ｏｄｏｌｏｇｉｅｓ．Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｔｗｏ－ｓｔｅｐ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ，ｔｈｅ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｒｅｑｕｉｒｅ　ａｆｆｏｒｄａｂｌｅ　ｅｎ－
ｚｙｍｅｓ，ｒａｉｓｅｄ　ｅｎｚｙｍｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｔｏ　ｉｓｏｌａｔｅ　ｈｉｇｈ　ｑｕａｌｉｔｙ
ＧＣＰｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗ　ｔｈｅ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｐｅｅｌｓ　ａｒｅ　ｐｌａｃｅｄ　ａｔ　２２℃ｉｎ　ｅｎｚｙｍｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎⅠｆｏｒ　１ｈ，
ａｎｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｉｎｔｏ　ｅｎｚｙｍｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎⅡ（２．５％ Ｏｎｏｚｕｋａ　Ｒ－１０ｃｅｌｕｌａｓｅ）ｆｏｒ　２ｈｉｎ　ｄａｒｋｎｅｓｓ，
ｔｈｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ＧＣＰｓ　ａｒｅ　ｌａｒｇｅ－ｑｕａｎｔｉｔｙ　ａｎｄ　ｈｉｇｈ－ｐｕｒｉｔｙ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｇｕａｒｄ　ｃｅｌ；ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ；ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
　第５期 梁　芸等：大量提取拟南节假日保卫细胞原生质体方法的优化
　　气孔是植物进行气体交换的门户，由叶片表皮上
的一对保卫细胞组成，可以响应多种外界刺激，如光、
干旱和病原菌侵染等［１－４］。一直以来，气孔是研究信号
转导机制的重要模式系统。多重外界刺激调节着气孔
的运动［５－６］。在保卫细胞中发现了许多与信号转导相
关的蛋白质［７－８］，但是信号通路中的许多受体和一些信
号相关组分在分子水平上仍然有待研究［９］。目前关于
保卫细胞内特异表达基因的研究还很有限［１０－１１］，保卫
细胞的分子调节机制还不是十分的清楚。
原生质体是指去除细胞壁的细胞，保卫细胞原
生质体（Ｇｕａｒｄ　Ｃｅｌ　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，ＧＣＰｓ）是研究气孔
运动分子机制、膜透性和离子转运过程的重要材料。
通常将原生质体与膜片钳技术相结合［１２－１４］来研究膜
电位变化；或通过转化ＧＦＰ等荧光标记基因进行目
的基因的亚细胞定位。以上研究要求提取较为纯
净、完整、有活力的保卫细胞原生质体。小量提取保
卫细胞原生质体的方法已经十分成熟［１５－１８］，获得的
原生质体完全可以满足上述试验需求。然而从生化
和分子水平阐释保卫细胞的功能，如分析保卫细胞中
酶的活力、检测碳代谢效率，或者从ｃＤＮＡ文库中筛
选功能蛋白等，前提需获得大量高纯度、有活力的保
卫细胞原生质体。目前，文献中介绍的保卫细胞原生
质体提取方法大都应用于小量提取，已有的大规模获
得保卫细胞原生质体的方法周期较长、成本过高［１９］。
因此，建立一套省时、高效并且经济的大量制备保卫
细胞原生质体的完整体系显得非常必要。本研究以
拟南芥哥伦比亚野生型为试验材料，在两步酶解法的
基础上，从取材方式、纤维素酶种类、酶解浓度及酶解
时间等方面进行条件摸索，将拟南芥保卫细胞原生质
体分离体系不断优化，并最终确定大量获得高质量原
生质体的试验条件，为拟南芥保卫细胞原生质体的大
量制备和利用原生质体进行基因表达研究提供理论
依据和技术参考。
１　材料与方法
１．１　植物材料的培养
拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）野生型种子首
先经过０．５％次氯酸钠消毒液［０．５％（体积分数）
ＮａＣｌＯ＋０．０１％（体积分数）Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００］消毒处
理，４℃黑暗处理２～３ｄ后点种于 ＭＳ培养基上，培
养７ｄ。将 ＭＳ培养基上生长７ｄ左右的幼苗移栽
到土壤（蛭石∶营养土＝１∶１～１∶２）中，用透明塑料
膜覆在花盆上保持湿度，４～５ｄ后，揭去塑料膜。生
长条件为：光／暗周期为８／１６ｈ，温度２２℃，湿度
６０％，光照强度８０～１００μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ），取生长２８ｄ
的莲座叶的第３，４轮叶片作为试验材料。
１．２　试验试剂
１．２．１　培养基　ＭＳ培养基（１Ｌ）：ＭＳ大量元素
（２０×）５０ｍＬ；微量元素（１００×）１０ｍＬ；Ｆｅ盐（１００
×）１０ｍＬ；蔗糖３０ｇ；琼脂粉８ｇ。将上述药品全部
混合于蒸馏水中，定容至１Ｌ，用Ｔｒｉｓ－Ｍｅｓ调ｐＨ至
５．８。高压灭菌。
１．２．２　基础液　基础液的配方参照Ｐａｎｄｙ等［１７］的
报道，成分为：５ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｅｓ，０．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＣａＣｌ２，
０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２，１０ μｍｏｌ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４，０．５
ｍｍｏｌ／Ｌ　Ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ，用Ｔｒｉｓ调节ｐＨ 值至５．５，
０．５５ｍｏｌ／Ｌ　Ｓｏｒｂｉｔｏｌ调节溶液渗透浓度（溶液最终
渗透浓度为５００ｍｍｏｌ／ｋｇ左右）。
１．２．３　酶解液Ｉ　在５５％（体积分数）基础液和
４５％（体积分数）去离子水的混合组分中加入０．７％
Ｃｅｌｕｌｙｓｉｎ，０．１％（质量分数）ＰＶＰ－４０，０．２５％（质量
分数）ＢＳＡ，０．５ｍｍｏｌ／Ｌ　Ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ。
１．２．４　酶解液ＩＩ　在基础液中加入不同浓度的
（１．５％，２．０％，２．５％）纤维素酶（Ｃｅｌｕｌａｓｅ“Ｏｎｏｚｕ－
ｋａ”Ｒ－１０），０．００７　５％（质量分数）果胶酶（Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ
Ｙ－２３），０．２５％（质量分数）ＢＳＡ，０．５ｍｍｏｌ／Ｌ　Ａｓｃｏｒ－
ｂｉｃ　ａｃｉｄ。
１．２．５　荧光素双醋酸酯溶液　将０．１ｍｇ荧光素双
醋酸酯（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　Ｄｉａｃｅｔａｔｅ，ＦＤＡ）溶于１ｍＬ丙
酮中，配制成０．１ｍｇ／ｍＬ母液，４℃避光保存。工
作浓度为５０μｍｏｌ／Ｌ。
１．３　方法
１．３．１　材料的获取　参照 Ｐｅｉ等［１５］和 Ｐａｎｄｅｙ
等［１７］的方法，将一定数量的拟南芥第３，４轮莲座叶
叶片剪下后洗净，放入匀浆机中，加入适量的冷蒸馏
水，打磨成碎表皮条，用孔径为７５μｍ滤膜过滤，去
除含有大量叶肉细胞的液体，收集碎表皮条。
１．３．２　游离原生质体　参照Ｂａｌｄｒｉａｎ等［１６］的方
法，将碎表皮条放入５０ｍＬ烧杯中，加入适量酶解
液Ｉ，２２℃，１１０ｒ／ｍｉｎ摇床振荡酶解１ｈ左右。用
孔径为７５μｍ滤膜过滤，收集表皮条，加入适量酶
解液ＩＩ，２２℃，１１０ｒ／ｍｉｎ振荡酶解２ｈ。
１．３．３　收集原生质体　第两步酶解过程中，在显微
镜下观察到视野中保卫细胞变圆成为原生质体，或
３１
河 北 农 业 大 学 学 报 第３７卷　
呈球状挂在气孔厚壁上，当这类细胞占到总保卫细
胞大约４０％时停止酶解。将酶解液用移液器轻柔
吹吸几次，以利于原生质体的脱落，然后将酶解液用
２０μｍ滤膜过滤，滤液在１００ｇ下离心１ｍｉｎ，移去
上部溶液，沉淀部分即为保卫细胞原生质体。
２　结果与分析
２．１　表皮获取方式的改进及效率的提高
为了获得足够的有活力的原生质体，传统的通
过撕取表皮酶解来获得原生质体的方法，不能满足
某些试验需要大量保卫细胞原生质体的要求。本研
究采用整片叶片打碎再酶解的方法［２０］。取生长
２８ｄ的拟南芥叶片约２００片，４℃冷水中冰浴１０
ｍｉｎ，转入含约６００ｍＬ冷蒸馏水的匀浆机中打制约
５～６次，速度约为８　０００～１０　０００ｒ／ｍｉｎ，时间分别
为３０ｓ／次（图１，Ａ），然后用７５μｍ的尼龙滤膜过
滤，冷蒸馏水冲洗后再用基础液漂洗，获得所需要的
表皮条（图１，Ｂ）。取约４００片拟南芥野生型叶片即
可获得足够的表皮条。
将所得表皮条转入酶解液Ｉ中（酶解液与叶片
比例为１ｍＬ∶１０片），在２２℃，１１０ｒ／ｍｉｎ（摇床）酶
解约１ｈ，作为第１步酶解。同时吸取部分碎表皮条
在显微镜下进行观察，发现表皮密度适中，并且表皮
上仅带有微量的叶肉细胞（图１，Ｃ、Ｄ），这种方法可
以一次性获得大量的碎表皮条，大大提高了试验效
率，并且从源头上减少了叶肉细胞量，为后续除去杂
质奠定了基础。
Ａ．叶片研磨后；Ｂ．过滤收集到的表皮条；Ｃ．低倍镜下观察
到的表皮条密度，ｂａｒ＝１ｍｍ；Ｄ．高倍镜下观察表皮条上叶
肉细胞残留情况，ｂａｒ＝２０μｍ。
图１　研磨后收集到的碎表皮条
Ｆｉｇ．１　Ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ　ａｆｔｅｒ　ｇｒｉｎｄｅｄ
２．２　更换纤维素酶后酶解效果分析
已有报道提取原生质体试验中，使用的是Ｃｅｌ－
ｌｕｌａｓｅ“Ｏｎｏｚｕｋａ”ＲＳ（Ｙａｋｕｌｔ　Ｈｏｎｓｈａ　Ｃｏ，Ｔｏｋｙｏ，
Ｊａｐａｎ）纤维素酶，酶解效率高，效果好且酶解时间
短，但价格较昂贵。如需要大量的保卫细胞原生质
体，使用该酶成本过高，故选择使用更为经济的Ｃｅｌ－
ｌｕｌａｓｅ“ＯＮＯＺＵＫＡ”Ｒ－１０（Ｙａｋｕｌｔ　Ｈｏｎｓｈａ　Ｃｏ，Ｔｏ－
ｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）纤维素酶进行酶解。为达到较为理想的
试验结果，对酶解液中纤维素酶的浓度、酶解时间进
行了摸索，希望通过增加酶解液中纤维素酶的浓度，
并适当延长酶解时间来达到较高的酶解效率。分别
选取了酶解液ＩＩ中纤维素酶浓度为１．５％，２％，
２．５％，酶Ｉ酶解１ｈ，酶ＩＩ酶解３ｈ，进行观察和数量
统计（表１，图２）。
表１　不同酶液浓度对拟南芥保卫细胞原生质体分离的影响
Ｔａｂｌｅ　１　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｅｎｚｙｍｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
酶液组成／％
Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ
纤维素酶
Ｃｅｌｕｌａｓｅ“ＯＮＯＺＵＫＡ”Ｒ－１０
果胶酶
Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ
Ｙ－２３
酶解时间／ｈ
Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ
ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ
酶解温度／℃
Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
原生质体数量（鲜重）／
（×１０６ 个·ｇ－１）
Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ
ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ
１．５　 ０．００７　５ — — ０．４４
２．０　 ０．００７　５　 ３　 ２２　 ２．１２
２．５　 ０．００７　５ — — １．９４
　　当酶ＩＩ中纤维素酶浓度为１．５％时，原生质体
产量（鲜重）为０．４４×１０６ 个／ｇ，数量很少；纤维素酶
的浓度为２％时，原生质体最多，产量（鲜重）为
２．１２×１０６ 个／ｇ；酶浓度为２．５％时，原生质体数量
居于２种处理之间，产量（鲜重）为１．９４×１０６ 个／ｇ。
综合以上试验结果，可见纤维素酶的浓度为２％时，
酶解３ｈ后游离出的原生质体数量最多。
试验过程中发现３种不同浓度的酶处理条件
下，原生质体形状均不规则，随着酶浓度的增加，悬
浮液中原生质体破裂严重，酶浓度为２．５％时，原生
质体产量相对降低，细胞碎片增加（图２，Ｃ），推测这
种结果可能为酶浓度过高所致。
４１
　第５期 梁　芸等：大量提取拟南节假日保卫细胞原生质体方法的优化
Ａ．纤维素酶浓度１．５％；Ｂ．纤维素酶浓度２．０％
Ｃ．纤维素酶浓度２．５％，ｂａｒ＝２０μｍ。
图２　不同浓度纤维素酶水解３ｈ后的保卫细胞原生质体
Ｆｉｇ．２　Ｇｕａｒｄ　ｃｅｌ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｃｏｌｅｃｔｅｄ　ａｆｔｅｒ　３ｈｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
　　为获得最优细胞分离条件，在原有３种不同酶
解浓度条件下，改变了酶ＩＩ处理时间，分别设１，
１．５，２ｈ３个酶解时间进行观察。显微镜下观察发
现，在酶解１ｈ时，３种酶浓度下细胞形状都较为完
好（图３，Ｂ）。酶解１．５ｈ后，细胞稍有变形，且随着
酶浓度的增高，细胞壁松散度增加，纤维素酶浓度为
２．５％，偶可见悬浮液中有游离的原生质体出现（图
３，Ｃ）。酶ＩＩ酶解２ｈ时，３种酶浓度条件下，都可见
到细胞形状改变，同时可观察到挂在气孔壁上（图
３，Ｄ）及游离的原生质体（拍摄过程中可观察到，因
游离原生质体和表皮多不在同一层面，在此未用图
片展示），随着酶浓度增加，悬浮液中游离原生质体
数目增加（表２）。２ｈ后离心收集，酶浓度为２．５％
时，可分离出较多的、外形圆滑、形状规整的保卫细
胞原生质体（图３，Ｅ）。
Ａ．酶解前；Ｂ．酶解１ｈ；Ｃ．酶解１．５ｈ；Ｄ．酶解２ｈ；Ｅ．原生质体密度（ｂａｒ＝２０μｍ）。
图３　不同浓度纤维素酶及不同时间酶解效果比较
Ｆｉｇ．３　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｅｎｚｙｍｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｏｎ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
表２　不同酶液浓度对拟南芥保卫细胞原生质体分离的影响
Ｔａｂｌｅ　２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｅｎｚｙｍｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
酶液组成／％
Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ
纤维素酶
Ｃｅｌｕｌａｓｅ“ＯＮＯＺＵＫＡ”Ｒ－１０
果胶酶
Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ
Ｙ－２３
酶解时间／ｈ
Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ
ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ
酶解温度／℃
Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
原生质体数量（鲜重）／
（×１０６ 个·ｇ－１）
Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ
ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ
１．５　 ０．００７　５　 ０．３４
２．０　 ０．００７　５　 ２　 ２２　 ０．９７
２．５　 ０．００７　５　 １．１５
２．３　原生质体的活力检测
为了检测上述改进的方法提取出的保卫细胞原
生质体是否具有高活力，参照ＦＤＡ染色技术对原生
质体进行染色。ＦＤＡ本身无荧光，一旦进入原生质
体后，由于受到酯酶分解而产生具有荧光的荧光素。
荧光素不能自由出入原生质膜，因此，在４８８ｎｍ激
发光下，有活力的原生质体产生绿色荧光，无活力的
原生质体不能分解ＦＡＤ，则无绿色荧光产生；绿色
荧光亮度越高表示活力越强。吸取部分原生质体进
行ＦＤＡ孵育。结果显示，应用改进后的方法提取出
５１
河 北 农 业 大 学 学 报 第３７卷　
的原生质体，约９０％发出明亮的绿色荧光（图４），说
明提取出的原生质体活力较高。因为叶绿体在该激
发光下发出红色荧光，所以，观察不到红色荧光说明
原生质体较为纯净，很少有叶肉细胞污染，符合试验
要求，可以用于后续试验。
荧光　　　　　　　　　　明场　　　　　　　　　　叠加
图４　原生质体ＦＤＡ染色
Ｆｉｇ．４　Ｇｕａｒｄ　ｃｅｌ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　ｓｔａｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ＦＤＡ（ｂａｒ＝２０μｍ）
３　讨论
　　拟南芥保卫细胞个体较小，分离提取原生质体
具有一定的难度，周期长或活性低易破碎。本研究
着重从以下几个方面进行了摸索和改进：首先，表皮
条获取方式的改进。拟南芥叶片较小，表皮条极不
易撕取，很难积累足够的样品。采用匀浆机打制的
方法可以一次性获得较多的碎表皮条，该方法省时、
省力，Ｐａｎｄｅｙ等［１７］、Ｏｂｕｌａｒｅｄｄｙ等［１９］研究者曾采用
此方法分离表皮条，均获得良好的效果。本研究中
由于叶片数量较多，故在原来基础上进行了量化改
进：每次约２００片／５００ｍＬ水为宜，打制５～６次，每
次３０ｓ。同时，打制时间应稍作控制，不宜过短或过
长。时间短，叶肉细胞残留较多；时间过长，表皮条
被搅拌的太碎小，导致最终的原生质体产量下降。
其次，酶浓度及酶解时间的摸索。构成植物细胞壁
的主要成分是：纤维素（占细胞壁成分的２５％～
５０％）、半纤维素（占细胞壁成分的５３％）、果胶质
（占细胞成分的５％）。因此，分离植物原生质体的
酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。一般认为原
生质体的分离，纤维素酶和果胶酶是必要的［２１］。纤
维素酶Ｃｅｌｕｌａｓｅ　ＲＳ（Ｙａｋｕｌｔ　Ｈｏｎｓｈａ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａ－
ｐａｎ）和果胶酶Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ　Ｙ－２３（Ｙａｋｕｌｔ，Ｊａｐａｎ）在水
解细胞壁的酶类中因活性高，成为实验人员的首选，
然而大量分离保卫细胞原生质体时，酶的消耗量较
多，成本过高。经比较分析，纤维素酶 Ｏｎｏｚｕｋａ　Ｒ－
１０和离析酶 Ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ　Ｒ－１０可分别作为以上二
者的替代。酶解处理就是要用最低的酶浓度和最短
的酶解时间获得大量有活力的原生质体。Ｃｅｌｕｌａｓｅ
ＲＳ的水解活性约是Ｏｎｏｚｕｋａ　Ｒ－１０的２倍，已有报
道使用Ｏｎｏｚｕｋａ　Ｒ－１０纤维素酶的时候，浓度为３％
～４％［１８］。而原生质体产量和活力均会随纤维素酶
浓度的提高而下降，随着时间的延长而下降。因此，
通过适当增加纤维素酶Ｏｎｏｚｕｋａ　Ｒ－１０（２．５％）的浓
度，适当延长酶解时间（２ｈ）来分离、收集拟南芥保
卫细胞原生质体，提取出的原生质体经过ＦＤＡ染色
检测，细胞活力好，表明该方法可以保证提取出的原
生质体的纯度、活力符合后续试验的要求。
本研究在两步酶解基础上改进的大量获取保卫
细胞原生质体的方法，在原生质体产量上略低于
Ｐａｎｄｅｙ［１７］报道的两步酶解法和过夜酶解法，然而更
为省时、省力，达到了大量、高效、快捷制备保卫细胞
原生质体的目的，同时节约了成本，为后续试验打下
良好基础，也为相关领域科研工作者提供更多的借
鉴和选择。
４　结论
改进后的大量获取保卫细胞原生质体的条件
为：匀浆器打制获得淡绿色表皮条，按照酶液与叶片
为１ｍＬ∶１０片比例，酶解液Ｉ酶解１ｈ，酶解液ＩＩ（纤
维素酶Ｏｎｏｚｕｋａ　Ｒ－１０浓度２．５％）酶解２ｈ，可收集
到约１．１５×１０６ 个／ｇ的保卫细胞原生质体。
参考文献：
［１］　Ｉｓｒａｅｌｓｓｏｎ　Ｍ，Ｓｉｅｇｅｌ　Ｒ　Ｓ，Ｙｏｕｎｇ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｇｕａｒｄ　ｃｅｌ
ＡＢＡ　ａｎｄ　ＣＯ２ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｎｅｔｗｏｒｋ　ｕｐｄａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｃａ２＋
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６１
　第５期 梁　芸等：大量提取拟南节假日保卫细胞原生质体方法的优化
ｓｔｏｍａｔａ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｉｎｎａｔｅ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ａｇａｉｎｓｔ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ
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［１５］ Ｐｅｉ　Ｚ　Ｍ，Ｋｕｃｈｉｔｓｕ　Ｋ，Ｗａｒｄ　Ｊ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ
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ｎｅｌｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ａｂｉ１ａｎｄ　ａｂｉ２ｍｕ－
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ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｃｅｌ－ｔｙｐｅ　ｒｅ－
ｓｐｏｎｓｅｓ　ｔｏ　ｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ［Ｊ］．Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏ－
ｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ，２０１３，２６：８４４－８４９．
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ｆｕｎｇｉ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ
ｄｙｅ　ｅｆｆｌｕｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ａｄｖ，２００３，２２（１２２）：
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［２１］ 郭勇，崔堂兵，谢秀祯．组织培养教程［Ｍ］．北京：化
学工业出版社，２００４．
（编辑：宗淑萍）
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