全 文 ：施加内生真菌对花生连作土壤微生物
和酶活性的影响*
王宏伟1 摇 王兴祥2,3,4 摇 吕立新1 摇 肖摇 逸1 摇 戴传超1**
(1南京师范大学生命科学学院江苏省微生物与功能基因组学重点实验室, 南京 210046; 2中国科学院土壤环境与污染修复重点
实验室, 南京 210008; 3中国科学院南京土壤研究所, 南京 210008; 4国家红壤改良工程技术研究中心, 江西鹰谭, 335211)
摘摇 要摇 通过盆栽试验,研究了在土壤中施加植物内生真菌拟茎点霉 NJ4. 1 菌株、B3 菌株和
角担子菌 B6 菌株在花生不同生育时期对土壤微生物学特性及酶活力的影响.结果表明: B3
处理显著提高花生荚果产量,为对照的 1郾 2 倍;施加内生菌 NJ4. 1、B3 和 B6 能显著增加花生
根瘤数量,分别为对照的 1郾 2、1郾 3 和 1郾 3 倍. 3 个加菌处理全生育期平均细菌和放线菌数量高
于对照,萌发期和苗期土壤微生物生物量碳(SMBC)显著高于对照,微生物生物量氮(SMBN)
在花生萌发期升高,开花期降低.花生开花期土壤 DGGE 图谱表明,B3 处理土壤细菌和真菌
条带数量以及多样性最高.从萌发期到成熟期,与对照相比,3 个加菌处理的土壤蔗糖酶和过
氧化氢酶活性提高,脲酶活性无显著变化.表明施加内生菌对连作花生土壤环境有一定的改
善作用,其中施用 B3 效果最好.
关键词摇 内生真菌摇 土壤微生物量摇 土壤酶摇 DGGE
文章编号摇 1001-9332(2012)10-2693-08摇 中图分类号摇 S154摇 文献标识码摇 A
Effects of applying endophytic fungi on the soil biological characteristics and enzyme activi鄄
ties under continuously cropped peanut.WANG Hong鄄wei1, WANG Xing鄄xiang2,3,4, L譈 Li鄄xin1,
XIAO Yi1, DAI Chuan鄄chao1 ( 1Jiangsu Key Laboratory for Microbes and Functional Genomics, Col鄄
lege of Life Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China; 2Key Laboratory of Soil
Environment and Pollution Remediation, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China;
3 Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China; 4National Engi鄄
neering and Technology Research Center for Red Soil Improvement, Yingtan 335211, Jiangxi, Chi鄄
na) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2012,23(10): 2693-2700.
Abstract: A pot experiment was conducted to investigate the effects of applying endophytic fungi
Phomopsis liquidambari strain B3, Phomopsis sp. strain NJ4. 1, and Ceratobasidum stevensii strain
B6 on the soil biological characteristics and enzyme activities under continuously cropped peanut at
its different growth stages. Compared with the control, applying B3 increased the peanut yield sig鄄
nificantly by 19. 8% , and applying NJ4. 1, B3 and B6 increased the peanut nodule number signifi鄄
cantly by 20. 4% , 29. 3% and 27. 6% , respectively. In the three treatments of applying endophyt鄄
ic fungi, the average population of soil bacteria and actinomycetes in the whole growth period of
peanut was higher than that of the control, and the soil microbial biomass carbon was significantly
greater at germination and seedling stages. The soil microbial biomass nitrogen increased at germi鄄
nation stage, but decreased at flowering stage. The DGGE analysis indicated that at flowering stage,
the soil bacteria and fungi in treatment B3 had the largest band number and diversity. From germi鄄
nation stage to maturing stage, the three treatments of applying endophytic fungi had higher activi鄄
ties of soil invertase and catalase than the control, but less difference in soil urease activity. It was
suggested that applying endophytic fungi could improve the peanut continuous cropping soil environ鄄
ment, and applying B3 had the best effect.
Key words: endophytic fungi; soil microbial biomass; soil enzyme; DGGE.
*国家自然科学基金项目(30970523)、国家科技支撑计划项目(2011BAD41B01)、国家基础科学人才培养基金项目( J1103507)和江苏省高校
优势学科建设工程项目资助.
**通讯作者. E鄄mail: daichuanchao@ njnu. edu. cn
2011鄄12鄄16 收稿,2012鄄07鄄19 接受.
应 用 生 态 学 报摇 2012 年 10 月摇 第 23 卷摇 第 10 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Oct. 2012,23(10): 2693-2700
摇 摇 花生是一种重要的油料作物,我国播种面积约
400 多万 hm2,然而多年的连作使得花生减产,连作
障碍严重[1] .产生连作障碍的原因很多,主要包括
土壤自毒物质的积累,土壤微生物区系恶化,土壤病
原菌的增加等[2-4] . 土壤微生物是土壤物质循环的
核心,关系到有机质的矿化和植物营养吸收,如果直
接向连作土壤中施加一些有益微生物,可能起到调
节土壤微生物区系、降解有害物质、促进物质循环,
进而缓解连作障碍的作用[5-7] .
植物内生菌和植物是共生关系,传播类型分为
通过植物种子的垂直传播和通过环境的水平传
播[8-9] .环境传播内生菌和植物的关系是诱导型共
生关系,能帮助植物抵御逆境.这类内生菌在生活史
的某一个阶段生活在植物内部,还有一个阶段是在
环境中.最近研究发现,一些内生菌在土壤里也有一
定的活性[10] .其对大分子有机物的分解作用、对其
他病原微生物的拮抗作用等可能对植物生长有
利[11-13] .寻找有较强环境修复能力的内生菌,将其
施加到土壤中,对土壤环境进行优化,可能对克服连
作障碍有一定帮助. 本课题组前期初步研究了一株
植物内生真菌拟茎点霉 B3 缓解花生连作障碍的可
行性[14],但是对施加内生菌后土壤微生物区系的动
态变化,亲缘关系较近或具有相似作用的内生真菌
是否均可以改善连作土壤环境,以及植物内生真菌
可否作为土壤有益微生物的新来源还不清楚.因此,
本文选择了与 B3 同属的植物内生真菌 NJ4郾 1,以及
与 B3 具有同样降解功能的内生真菌角担子菌
B6[15-16]进行研究,探讨植物内生真菌作为有益微生
物克服花生连作障碍的机制及可行性.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 供试材料
供试盆栽土壤取自江西省鹰潭市中国科学院红
壤生态实验站,为红黏土发育的红壤(5 ~ 20 cm),
连作花生 6 年,土壤有机质含量 11郾 8 g·kg-1,全氮
0郾 56 g·kg-1,碱解氮 3郾 07 mg·kg-1,速效磷 7郾 2
mg·kg-1,速效钾 168郾 2 mg·kg-1,pH 6郾 3. 供试植
物内生真菌共 3 株:菌株 NJ4郾 1,为拟茎点霉属
(Phomopsis sp郾 ),分离自菊科茅苍术 ( Atractylodes
lancea)叶片;菌株 B3(Phomopsis liquidambari) [17],
为拟茎点霉属,分离自大戟科重阳木(Bischofia poly鄄
carpa)茎内皮;菌株 B6[17],为角担子菌(Ceratobasi鄄
dum stevensii),分离自重阳木茎内皮. 3 株内生菌均
来自于南京师范大学江苏省微生物与功能基因组学
重点实验室,PDA 斜面 4 益保藏. 真菌培养使用马
铃薯葡萄糖液体培养基,180 r·min-125 益培养 5
d,滤纸过滤后获得菌丝,使用去离子水清洗 3 次,抽
滤后一部分烘干用于计算菌丝干质量,另一部分用
于盆栽试验.
1郾 2摇 试验设计
盆栽试验地点在南京师范大学植物园.试验共
设 4 个处理,7 次重复.处理分别为不加菌(CK)、加
NJ4郾 1 菌丝(NJ4郾 1)、加 B3 菌丝(B3)和加 B6 菌丝
(B6),加菌量每盆折合干菌丝 2 g.试验盆钵直径 28
cm、高 23 cm,每盆装土 12 kg,盆钵埋入土壤,盆口
距地面 2 cm,随机区组排列.每盆施用 1郾 5 g尿素、3
g Ca3(PO4) 2、2郾 5 g KCl和 100 g 有机肥. 5 月 18 日
在盆钵中加入菌丝,与深度 0 ~ 5 cm 的表层土壤拌
匀,随后立即播种花生(泉花 7 号),每盆 4 粒,待出
苗后每盆定植 2 株.整个盆栽试验期间,视土壤含水
量状况不定时浇灌自来水,拔除杂草,花生在露天自
然状况下生长.
分别在播种前 1 d,播种后的 7(萌发期)、30(苗
期)、60(开花期)、90(结荚期)和 110 d(成熟期),
用内径 2 cm 的土钻取 0 ~ 20 cm 深的混合土样,及
时用周边土壤填充以减少钻孔的影响. 土样用于测
定土壤可培养微生物.用于测定微生物量 C、N和土
壤酶活的土壤样品于 4 益保藏,用于 DGGE 分析的
土壤样品冻干后-70 益保藏.
1郾 3摇 测定项目与方法
1郾 3郾 1 土壤可培养微生物数量摇 采用稀释平板法测
定微生物数量,其中细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基,
真菌采用马丁氏培养基,放线菌采用改良的高氏一
号培养基.
1郾 3郾 2 土壤酶活性摇 土壤蔗糖酶采用 3,5鄄二硝基水
杨酸比色法,其活性以 24 h 后 1 g 风干土中葡萄糖
的毫克数表示;土壤脲酶采用苯酚钠比色法,其活性
以 24 h 后 1 g 风干土中 NH4 + 鄄N 毫克数表示;土壤
过氧化氢酶采用高锰酸钾滴定法,其活性以 20 min
后 1 g风干土消耗 0郾 02 mol·L-1高锰酸钾溶液毫升
数表示[18] .
1郾 3郾 3 土壤微生物量碳、氮含量 摇 新鲜的土壤样品
过孔径 2 mm 筛,将含水量调节至约 40%的土壤饱
和持水量,25 益下密封培养 7 d. 采用氯仿熏蒸鄄K2
SO4提取法测定土壤微生物量碳、氮[19],称取 20 g
预处理的土样,在真空干燥器中用氯仿蒸汽熏蒸 24
h,反复抽真空除去残存的氯仿,另取等量土样不熏
蒸,再用 100 mL 0郾 5 mol·L-1K2 SO4溶液浸提震荡
4962 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷
30 min后立即过滤,滤出的浸提液在-20 益下保存
待测定.土壤微生物量碳用重铬酸钾氧化法测定,土
壤微生物量氮用凯氏定氮法测定. 土壤微生物量碳
(SMBC)计算公式为:SMBC = EC / 0郾 38,其中,EC为
熏蒸的有机碳和未熏蒸的有机碳之差,0郾 38 为换算
系数;土壤微生物量氮 ( SMBN)的计算公式为:
SMBN=EN / 0郾 45,其中,EN为熏蒸的全氮与未熏蒸的
全氮的差值,0郾 45 为转换系数.
1郾 3郾 4 土壤 DNA提取及 PCR 扩增和变性梯度凝胶
电泳(DGGE) 摇 使用 UltraCleanTM Soil DNA Isolation
试剂盒(Mo BIO Laboratories)提取土壤中的 DNA,
然后用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测.
土壤 DNA的 PCR扩增条件见表 1,反应体系均
为 50 滋L体系:10伊PCR 缓冲液 5 滋L,MgCl2 3郾 5 滋L
(20 mmol·L-1),dNTP 1郾 5 滋L(10 mmol·L-1), 上
下游引物各 1 滋L(10 滋mol·L-1),Taq DNA 聚合酶
(TIANGEN BIOTECH 公司) 0郾 3 滋L(1郾 5 U),DNA
模板 2 滋L(15 ng),无菌超纯水 35郾 7 滋L. PCR 产物
用 1%的琼脂糖凝胶检测.
摇 摇 使用 CBS鄄DGGE电泳系统(CBS Scientific Co郾 )
进行变性梯度凝胶电泳(DGGE),聚丙烯酰胺凝胶
浓度和变性梯度见表 1,电泳缓冲液为 0郾 5 伊TAE,
PCR产物上样量为 500 ng,60 益100 V 电泳 16 h,
EB染色 20 min,UVP凝胶影像分析系统拍照.
DGGE 指纹图谱使用 Gelcompar 域 软件分
析[22] .其中,聚类分析使用 UPGMA(unweighted pair鄄
group method with arithmetic averages)方法. 用于计
算群落生物多样性的指标[23]有:1) Shannon 指数
H = -移(ni / N)ln(ni / N),式中:ni 为单一条带的峰
面积;N 为所有峰的总面积. 2)条带数量(S),为所
在泳道的条带总数目.
1郾 3郾 5 花生农艺指标检测 摇 在花生成熟期,测定花
生的荚果产量、秸秆质量、根瘤数、分枝数、株高和主
根长.其中,荚果产量为每盆花生荚果总质量,根瘤
数为每盆花生总根瘤数.
1郾 4摇 数据处理
采用 SPSS 13郾 0 和 Excel 2003 软件进行数据统
计分析,不同数据组间差异显著性采用 Duncan法检
验(琢=0郾 05).
2摇 结果与分析
2郾 1摇 内生菌对花生农艺指标的影响
从表 2 可知,3 个处理花生荚果产量均高于
CK,其中,B3 处理增产效果最好,提高 19郾 8% .秸秆
质量在 NJ4郾 1 处理最高,比 CK增加 27郾 1% . NJ4郾 1、
B3 和 B6 处理根瘤的数量均显著高于 CK,分别增加
20郾 4% 、29郾 3% 和 27郾 6% . 分枝数量在 B6 处理最
高,比 CK增加 33郾 3% . B3 处理株高最大,比 CK 高
12郾 4% .主根长在各处理间没有显著差异.
2郾 2摇 内生真菌对土壤微生物的影响
2郾 2郾 1 土壤微生物数量摇 从表 3 可知,NJ4郾 1、B3 和
B6 处理在萌发期土壤细菌数量迅速达到最大值,到
苗期迅速下降,但仍显著高于 CK.在苗期和开花期,
B3 和 B6 处理细菌数量比 CK 分别提高 184郾 1% 、
65郾 5%和 45郾 1% 、29郾 8% .在结荚期 CK细菌数量达
到最大值,高于 3 个加菌处理,成熟期 3 个加菌处理
细菌数量和 CK 之间差异不显著. 土壤真菌数量基
本表现为先增加后减少的趋势,CK和 NJ4郾 1 处理在
苗期达到最大值,而 B3 和 B6 处理在开花期达到最
大值. NJ4郾 1、B3 和 B6 处理的土壤放线菌数量都在
结荚期达到最大值,与 CK 相比分别提高 109郾 5% 、
60郾 6%和155郾 5% . 值得注意的是,NJ4郾 1、B3和B6
表 1摇 PCR鄄DGGE 条件
Table 1摇 PCR鄄DGGE conditions
模板
Target
引物
Primer
扩增条件
PCR condition
电泳条件 DGGE condition
聚丙烯酰胺
凝胶浓度
Polyacrylamide gel (% )
变性梯度
Denaturing
gradient (% )
细菌
Bacteria
357F鄄GC(5忆鄄CGC CCG CCG CGC GCG
GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG
GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG鄄
3忆), 517R (5忆鄄ATT ACC GCG GCT GCT
GG鄄3忆) [20]
94 益4 min; 20 个循环, 94 益1
min, 65益1 min( -0郾 5 益1 个循
环), 72 益1 min; 10 个循环, 94
益1 min, 55 益 1 min, 72 益 1
min; 72 益10 min
8 35 ~ 65
真菌
Fungi
NS1(5忆鄄GTA GTC ATA TGC TTG TCT
C鄄3忆), GC鄄Fung ( 5忆鄄CGC CCG CCG
CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG
CCC CCG CCC CAT TCC CCG TTA CCC
GTT G鄄3忆 ) [21]
94 益 4 min; 35 个循环, 94 益
30 s, 55 益30 s, 72 益1 min; 72
益10 min
7 25 ~ 60
596210 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 王宏伟等: 施加内生真菌对花生连作土壤微生物和酶活性的影响摇 摇 摇 摇 摇 摇
处理的放线菌数量均显著高于 CK(NJ4郾 1 处理成熟
期除外),从萌发期到成熟期其平均值比对照分别
提高 71郾 9% 、68郾 8%和 95郾 5% .
2郾 2郾 2 土壤微生物量碳、氮 摇 由表 4 可知,各处理
SMBC含量随时间的变化基本一致,表现为先增大
后减小的趋势,其中,CK 和 NJ4郾 1 处理在开花期达
到最大值,而 B3 和 B6 处理在苗期达到最大值. 在
整个取样时期,B3 和 B6 处理 SMBC 含量除了结荚
期外没有显著差异.与 CK 相比,NJ4郾 1、B3 和 B6 处
理的 SMBC 在萌发期分别提高 37郾 1% 、92郾 4% 和
93郾 6% ,在苗期分别提高 25郾 4% 、25郾 4%和 31郾 5% .
各处理 SMBN含量随时间的变化趋势一致,从
萌发期到苗期 SMBN含量增加,并达到最高点,随后
逐渐降低.萌发期 NJ4郾 1、B3 和 B6 处理的 SMBN 含
量分别比 CK高出 96郾 8% 、90郾 4%和 76郾 8% .结荚期
3 个加菌处理 SMBN含量和 CK无显著差异.进入成
熟期后,和 SMBC 含量增加不同,3 个加菌处理
SMBN含量继续缓慢减小.
2郾 2郾 3 开花期土壤 DGGE分析摇 开花期为花生植株
生长最旺盛的时期,也是花生生长的关键时期.细菌
的 DGGE指纹图谱聚类分析(图 1a)表明,4 个处理
聚为两类:B3 与 B6 为一类,CK和 NJ4郾 1 为一类,两
表 2摇 供试内生真菌对花生农艺指标的影响
Table 2摇 Effects of endophytic fungi on agronomic traits of peanut
处理
Treatment
荚果产量
Pod yield
(g)
秸秆
Straw
(g)
根瘤数
Root nodules
分枝数
Tillers
株高
Height
(cm)
主根长
Root length
(cm)
CK 53郾 6依2郾 5a 37郾 3依4郾 6a 663依38a 6郾 0依2郾 1a 50郾 8依4郾 3a 18郾 0依5郾 6a
NJ4郾 1 56郾 3依1郾 6a 47郾 4依4郾 4b 798依32b 7郾 6依1郾 8ab 52郾 7依3郾 1a 17郾 5依2郾 6a
B3 64郾 2依2郾 8b 44郾 4依8郾 7ab 857依50b 7郾 0依2郾 3ab 57郾 1依5郾 6b 17郾 8依7郾 0a
B6 55郾 4依2郾 2a 40郾 2依9郾 1ab 846依33b 8郾 0依2郾 0b 52郾 3依4郾 3a 21郾 5依1郾 3a
不同字母表示处理间差异显著(P<0郾 05) Different letters meant significant difference among treatments at 0郾 05 level郾 下同 The same below郾
表 3摇 施加内生真菌对花生连作土壤可培养细菌、真菌、放线菌的影响
Table 3摇 Effects of endophytic fungi on bacteria, fungi and actinomycetes in continuously peanut鄄cropping soil
项目
Item
处理
Treatment
播种前
Presowing
萌发期
Germination
苗期
Seedling
开花期
Flowering
结荚期
Podding
成熟期
Maturity
均值
Average
细菌 CK 2郾 15依0郾 26a 2郾 67依0郾 21a 1郾 45依0郾 05a 3郾 72依0郾 40b 5郾 32依0郾 51b 1郾 23依0郾 06a 2郾 88
Bacteria NJ4郾 1 2郾 28依0郾 30a 30郾 0依2郾 29d 3郾 62依0郾 25c 2郾 70依0郾 14a 3郾 00依0郾 09a 1郾 38依0郾 13a 8郾 14
(伊106 CFU·g-1) B3 2郾 18依0郾 35a 9郾 48依0郾 23b 4郾 12依0郾 53c 5郾 40依1郾 08c 2郾 68依0郾 23a 1郾 40依0郾 33a 4郾 62
B6 2郾 31依0郾 31a 13郾 3依1郾 04c 2郾 40依0郾 05b 4郾 83依0郾 13d 4郾 85依0郾 44b 1郾 55依0郾 10a 5郾 39
真菌 CK 0郾 15依0郾 05a 0郾 25依0郾 05ab 3郾 00依0郾 10b 2郾 03依0郾 14a 1郾 98依0郾 16a 1郾 27依0郾 28b 1郾 71
Fungi NJ4郾 1 0郾 18依0郾 06a 0郾 15依0郾 05a 3郾 85依0郾 47c 3郾 80依0郾 17b 1郾 87依0郾 25a 0郾 23依0郾 06a 1郾 98
(伊104 CFU·g-1) B3 0郾 22依0郾 08a 0郾 42依0郾 08bc 1郾 70依0郾 05a 3郾 08依0郾 29b 2郾 57依0郾 27b 1郾 17依0郾 06bc 1郾 79
B6 0郾 20依0郾 05a 0郾 43依0郾 14c 2郾 20依0郾 21a 6郾 45依0郾 93c 2郾 02依0郾 14a 0郾 97依0郾 10b 2郾 41
放线菌 CK 1郾 45依0郾 15a 1郾 05依0郾 05a 0郾 53依0郾 08a 0郾 63依0郾 03a 1郾 37依0郾 06a 1郾 82依0郾 18b 1郾 08
Actinomycetes NJ4郾 1 1郾 31依0郾 10a 2郾 30依0郾 13c 0郾 78依0郾 08c 1郾 82依0郾 08b 2郾 87依0郾 25c 1郾 53依0郾 19a 1郾 86
(伊105 CFU·g-1) B3 1郾 23依0郾 13a 1郾 55依0郾 13b 1郾 22依0郾 03d 2郾 02依0郾 06c 2郾 20依0郾 18b 2郾 13依0郾 12c 1郾 82
B6 1郾 35依0郾 18a 1郾 62依0郾 04b 0郾 67依0郾 03b 2郾 28依0郾 08d 3郾 50依0郾 13d 2郾 48依0郾 13d 2郾 11
表 4摇 施加内生真菌对花生连作土壤 SMBC和 SMBN的影响
Table 4摇 Effects of endophytic fungi on SMBC and SMBN in continuously peanut鄄cropping soil
项目
Item
处理
Treatment
播种前
Presowing
萌发期
Germination
苗期
Seedling
开花期
Flowering
结荚期
Podding
成熟期
Maturity
SMBC CK 87郾 7依7郾 6a 97郾 0依8郾 9a 189郾 7依2郾 1a 284郾 8依11郾 1b 104郾 8依8郾 9b 184郾 8依10郾 3b
(mg·kg-1) NJ4郾 1 93郾 5依10郾 2a 133郾 1依10郾 8b 237郾 9依28郾 1b 267郾 6依34郾 1b 75郾 5依17郾 2ab 147郾 5依13郾 2a
B3 91郾 0依4郾 6a 186郾 6依9郾 8c 237郾 8依8郾 9b 204郾 4依27郾 3a 62郾 3依5郾 3a 182郾 9依28郾 0b
B6 88郾 5依6郾 8a 187郾 8依17郾 8c 248郾 6依10郾 0b 157郾 9依15郾 7a 74郾 4依29郾 8ab 202郾 2依3郾 5b
SMBN CK 41郾 2依2郾 3a 37郾 5依2郾 4a 93郾 2依24郾 7a 71郾 9依6郾 0b 31郾 0依12郾 5a 28郾 0依5郾 9b
(mg·kg-1) NJ4郾 1 39郾 7依4郾 9a 73郾 8依4郾 2b 96郾 6依1郾 1a 55郾 0依12郾 4a 32郾 4依11郾 9a 17郾 4依4郾 3a
B3 36郾 8依1郾 8a 71郾 4依5郾 2b 95郾 7依21郾 0a 59郾 0依3郾 1ab 28郾 1依4郾 2a 17郾 3依2郾 5a
B6 38郾 1依4郾 2a 66郾 2依5郾 6b 80郾 4依19郾 3a 50郾 6依6郾 9a 30郾 4依6郾 3a 23郾 1依2郾 0ab
6962 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷
类之间的相似度为 82郾 1% .土壤真菌 DGGE 指纹图
谱聚类分析(图 1b)表明,CK 与 NJ4郾 1 以及 B3 与
B6 各属于一类,两类间的相似度为 82郾 4% .
从表 5 可知,3 个加菌处理细菌和真菌的条带
数和香农多样性指数均高于 CK.细菌和真菌条带数
量都是 B3 处理最高,和 CK相比分别提高 31郾 0%和
152郾 2% ;细菌和真菌香农多样性指数最高的也是
B3 处理,和 CK相比分别提高 29郾 0%和 191郾 5% .
2郾 3摇 施加内生菌对土壤酶活性的影响
2郾 3郾 1 蔗糖酶摇 从图 2 可知,从萌发期开始蔗糖酶
的活性开始增大,在苗期、开花期和结荚期均保持较
高水平,到成熟期回落.与 CK相比,NJ4郾 1、B3 和 B6
处理的土壤蔗糖酶活性在萌发期分别提高了
60郾 4% 、 37郾 6% 和 38郾 6% , 在开花期分别提高
17郾 2% 、 13郾 6% 和 32郾 6% . 从萌发期到成熟期,
NJ4郾 1、B3 和 B6 处理土壤蔗糖酶活性平均值分别提
高了 44郾 2% 、28郾 3%和 20郾 1% .
2郾 3郾 2 脲酶摇 从图 2 可知,播种前和萌发期土壤脲
酶活性处于较低水平,到苗期迅速增加并达到峰值,
其后一直下降,到成熟期又略有回升.从苗期到成熟
期,各处理的变化趋势基本一致,除结荚期外均没有
显著性差异.
图 1摇 开花期土壤细菌群落(a)和真菌群落(b)DGGE 指纹
图谱聚类分析
Fig. 1摇 DGGE cluster analysis (UPGMA) of 16S rDNA profiles
of soil bacterial communities (a) and 18S rDNA profiles of soil
fungal communities (b) at flowering stage郾
表 5摇 开花期土壤细菌、真菌群落的基因型多样性
Table 5 摇 Genotypic diversity of soil bacteria and fungi at
flowering stage
处理
Treatment
细菌 Bacteria
条带数
Band
number
香农指数
Shannon
index
真菌 Fungi
条带数
Band
number
香农指数
Shannon
index
CK 42 6郾 20 23 3郾 53
NJ4郾 1 54 7郾 77 29 4郾 93
B3 55 8郾 07 58 10郾 29
B6 51 7郾 07 47 7郾 36
图 2摇 施加内生真菌对土壤蔗糖酶、脲酶和过氧化氢酶活性
的影响
Fig. 2摇 Effects of endophytic fungi on soil invertase, urease and
hydrogen peroxidase activities郾
不同字母表示处理间差异显著(P<0郾 05) Different letters meant sig鄄
nificant difference among treatments at 0郾 05 level郾 下同 The same below郾
玉:播种前 Presowing; 域:萌发期 Germination; 芋:苗期 Seedling; 郁:
开花期 Flowering; 吁:结荚期 Podding; 遇:成熟期 Maturity.
2郾 3郾 3 过氧化氢酶摇 由图 2 可知,4 个处理过氧化氢
酶活性都随花生生长进程逐渐增加,到成熟期略有
下降.从苗期到结荚期,NJ4郾 1、B3 和 B6 处理的土壤
过氧化氢酶活性均高于 CK,并在开花期均达到显著
水平,比 CK 分别提高 22郾 3% 、22郾 4%和 22郾 9% ,从
萌发期到成熟期土壤过氧化氢酶活性平均值比对照
分别提高 6郾 2% 、10郾 8%和 15郾 2% .
3摇 讨摇 摇 论
目前,国内外对植物内生真菌的研究主要集中
于内生真菌的多样性、与宿主植物的相互作用以及
功能化合物的寻找[24] .本文首次对通过环境传播的
796210 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 王宏伟等: 施加内生真菌对花生连作土壤微生物和酶活性的影响摇 摇 摇 摇 摇 摇
植物内生真菌缓解花生连作障碍做了较为全面的评
价,结果表明,B3 菌株以及另外两株环境传播型植
物内生真菌 NJ4郾 1、B6 菌株对花生荚果产量及其他
农艺性状均有不同程度的提高,表明多种植物内生
菌均可作为土壤益生菌使用,这为植物内生真菌的
利用以及新功能的开发提供了新的视角和初步的理
论基础.在本研究中,B3 处理的增产效果最好,推测
其原因主要有:1)B3 处理对连作导致的微生物多样
性降低起到了很好的恢复作用,有利于农业生态系
统的稳定和初级生产力的保持[25-26];2)土壤中作物
的凋落物和残茬是导致连作障碍的重要因素[27],而
B3 菌对秸秆有很好的降解作用,尤其具有很强的漆
酶分泌能力,能够降解植物残体中难以分解的木质
素[28-29];3)随着连作年限的增加,土壤中自毒物质
不断积累[4],B3 菌具有很好的酚酸类自毒物质降解
能力[30],减轻了这类物质对花生种子萌发及植株生
长产生的不利影响;4)B3 菌本身能够分泌植物激素
IAA、氨基酸和脂肪酸等营养物质[31],对花生的生长
起到了促进作用.
摇 摇 微生物在土壤物质转化中具有非常重要的作
用,它能够将植物难以直接吸收利用的物质转化和
分解后为植物提供养分[32] . 有研究表明,花生连作
会导致土壤微生物区系恶化,由细菌型向真菌型转
化[33-34] .封海胜等[35]利用盆栽研究了生物菌剂对
花生连作障碍的缓解效应,但未检测其对土壤微生
物区系的影响.许艳丽等[36]将木霉菌施加到连作大
豆土壤中,结果表明可培养细菌、真菌和放线菌群的
数量无显著变化.本研究首次同时使用稀释涂布法
和 DGGE研究了施加植物内生真菌对连作花生土
壤微生物区系的影响,尽管加入的是真菌,但是对细
菌的数量和多样性也产生了较大影响,处理组花生
根瘤数量的增加也说明了这个问题. 对于外源添加
的真菌如何引起土壤细菌数量的大幅增加还未有系
统深入的研究. 本课题组在前期的研究中发现,B3
和 B6 均能够分解土壤中的酚酸、菲等有毒物
质[15-16,30],使土壤中有效碳源的多样性提高,有毒
物质浓度下降;B6 对连作西瓜土壤环境也表现出良
好的调节作用[37] . 3 株植物内生菌对土壤微生物的
调节可能主要与对土壤有毒物质的分解有关,土壤
有毒物质被降解后,植物的生长环境得到改善,这又
增加了植物根际分泌物的数量和多样性,从而使得
微生物的数量和多样性得到提高.
土壤微生物生物量作为土壤养分转化的活性
库,与土壤肥力密切相关[38] .本研究中,萌发期 3 个
加菌处理的 SMBC含量均显著高于 CK,原因可能是
接入的内生真菌自身带来了 SMBC,另外,内生真菌
胞内和胞外营养物质的释放,促进了其他微生物的
增殖. B3 和 B6 处理的 SMBC的高峰时间较早,是由
于加菌使得土壤微生物数量持续增加,期间可供微
生物生长的碳源和氮源丰富,且此时花生所需营养
少,因此微生物大量生长, SMBC 快速达到高峰. 与
CK相似,NJ4郾 1 处理的 SMBC含量在开花期才达到
高峰,这可能是由于 NJ4郾 1 菌在土壤中存活时间较
短,对土壤微生物量的影响短暂.各处理 SMBC达到
最高值后都开始下降,导致微生物量碳下降的原因
可能有:一是有机肥经过前期的快速分解后,速效碳
源减少,微生物生长受到限制;二是花生生长进入旺
盛阶段,需养量增加,与微生物的营养争夺变得激
烈,导致微生物获得的营养减少.花生成熟期,SMBC
又开始增大,这是由于花生进入成熟期后代谢活动
减弱,对土壤中营养的吸收减少,加之一些根系出现
老化死亡,成为微生物生长的碳源和能源.各处理的
SMBN都在苗期达到峰值,这是由于前期土壤中的
氮素丰富,使得微生物量固持的 N 迅速达到最高.
进入开花期后,4 个处理组的 SMBN 数量都在下降,
这是由于花生对氮素的吸收利用的增多,微生物所
固持的氮又被释放出来.
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作者简介摇 王宏伟,男,1986 年生,硕士.主要从事土壤微生
物生态学研究. E鄄mail: hongweihackyz@ 163. com
责任编辑摇 肖摇 红
0072 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷