全 文 ：抗生素抗性基因连锁传播的侧翼保守元件分析*
刘摇 建1 摇 毛大庆1**摇 任摇 君1 摇 罗摇 义2 摇 曹文清1
( 1沈阳药科大学生命科学与生物制药学院, 沈阳 110016; 2南开大学环境科学与工程学院教育部环境污染控制过程与基准重
点实验室 /天津市城市生态环境修复与污染防治重点实验室, 天津 300071)
摘摇 要摇 抗生素在医疗、畜牧和水产养殖业的大量使用造成了环境中耐药细菌和抗性基因的
日益增加,也加速了抗性基因在环境细菌间的传播扩散. 本研究以环境样本直接提取的总
DNA为模板,运用热不对称交错 PCR ( thermal asymmetric interlaced PCR, Tail鄄PCR)技术直接
扩增抗生素抗性基因上下游序列.通过优化 Tail鄄PCR反应程序,单循环同时扩增出 tetW 基因
的多条侧翼序列,包括 6 条上游序列和 9 条下游序列.基于序列的生物信息学分析发现,上游
包括一段反向重复序列和已知的一段 tetW调节肽序列以及一个已知的插入序列,下游包括一
个保守的未知序列和一个开放式阅读框架( the open reading frame,ORF)编码甲基转移酶.结
果不仅发现了可能协助 tetW基因传播的功能元件,也提供了一个未知侧翼序列高效和便捷的
研究方法,即采用 Tail鄄PCR技术,一组样品即能便捷获得多条侧翼序列.
关键词摇 抗性基因摇 实时荧光定量 PCR摇 Tail鄄PCR摇 tetW侧翼序列
文章编号摇 1001-9332(2012)01-0240-07摇 中图分类号摇 X171摇 文献标识码摇 A
Analysis of conserved flanking elements associated with antibiotic resistance genes dissemina鄄
tion. LIU Jian1, MAO Da鄄qing1, REN Jun1, LUO Yi2, CAO Wen鄄qing1 ( 1School of Life Science
and Biopharmaceutical, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China; 2Ministry
of Education Key Laboratory of Pollution Processes and Environmental Criteria / Tianjin Key Laborato鄄
ry of Environmental Remediation and Pollution Control, College of Environmental Sciences and Engi鄄
neering, Nankai University, Tianjin 300071, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2012,23 (1): 240 -
246.
Abstract: The overuse of antibiotics in medicine, animal husbandry, and aquiculture industry in鄄
creases the emergence of antibiotic resistant bacteria and antibiotic resistance genes (ARGs), and
also, accelerates the dissemination of ARGs within environmental bacteria. In this study, the total
DNA was directly extracted from environmental samples, and the upstream and downstream of anti鄄
biotic resistance genes were directly amplified by thermal asymmetric interlaced PCR (Tail鄄PCR)
technique. By optimizing the Tail鄄PCR program, the multiple flanking sequences of tetW, including
6 upstream sequences and 9 downstream sequences, were simultaneously acquired. Through the
bioinformatics analysis, the upstream of tetW presented a perfect inverted repeat ( IR), a known
tetW regulator peptide, and an insertional sequence (IS), whereas the downstream of tetW presen鄄
ted a most conservative fragment and a common open reading frame (ORF) coding methyltrans鄄
ferase. This study not only revealed several conserved flanking tetW gene modules, but also sup鄄
plied a highly鄄efficient and convenient methodology for the research of tetW爷s dissemination within
bacteria, i. e. , several flanking sequences could be concisely obtained from one sample by using
Tail鄄PCR program.
Key words: antibiotic resistance gene; real鄄time PCR; thermal asymmetric interlaced PCR (Tail鄄
PCR); tetW flanking sequencing.
*国家自然科学基金项目(30870363,31170472,20777041,31070333)和天津市自然科学基金项目(08JCYBJC02700)资助.
**通讯作者. E鄄mail: daqingm@ 126. com
2011鄄04鄄02 收稿,2011鄄10鄄09 接受.
应 用 生 态 学 报摇 2012 年 1 月摇 第 23 卷摇 第 1 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Jan. 2012,23(1): 240-246
摇 摇 长期以来,抗生素在保障人类健康和促进畜牧
业发展方面发挥了重要作用,由于能预防疾病和促
进生长,目前经常作为亚治疗剂量添加在动物饲料
中[1] .近年来由于抗生素在养殖业和畜牧业中的大
量使用,诱导出动物体内抗生素抗性基因,经排泄后
将对养殖区域及其周边环境造成潜在基因污染. 抗
性基因在环境中传播、扩散,对公共健康和食品、饮
用水安全构成威胁[2-3] .很多研究发现,临床上的致
病菌、条件致病菌中含有的抗性基因也与环境中分
离的菌种有相同的抗性基因,证明了环境细菌是各
种抗性基因天然的储存库[4-5] .研究表明,抗性基因
(antibiotic resistance gene, ARG)多通过可移动元件
(包括转座子、质粒和整合子等大片段)在菌间转
移,因为其具有不同的传播机制,不同的移动元件传
播效率不同[6],在原核生物的细菌中,连锁表达的
基因可能存在相互调节的功能,如反式调节因子[7]
和操纵子[8]模式等,通过对抗性基因连锁的保守元
件分析,可能揭示出抗性基因传播的一定规律.
抗性基因侧翼序列,即与抗生素抗性基因直接
连接的上下游相关序列. 细菌中基因上游和下游的
元件通常会对这个基因起到调控作用,而抗生素抗
性基因能普遍传播,与这些元件有一定关联.目前对
抗生素抗性基因的研究多停留在传播载体(包括转
座子[9-13]、质粒[14]等大片段)上,而与抗生素抗性基
因连锁的保守元件是否决定了传播载体携带特定抗
性基因的效率,目前还未见相关报道.
四环素是一类广谱抗菌药物,不仅对大部分革
兰氏阳性菌和阴性菌有良好的抑菌效果,而且对衣
原体、支原体也有很好的疗效.所以四环素被广泛应
用在人体和畜牧业的治疗上,很多国家将四环素作
为动物生长促进剂添加到饲料中[15] . 在环境中,大
部分微生物对四环素有抗性,而四环素类抗性基因
也普遍存在于从人体、动物体和环境中分离的各种
菌种中[15] .大量的四环素类抗性基因都是定位在一
些可移动载体上.
本研究以天津海河底泥样品中四环素类编码核
糖体保护蛋白的抗性基因 tetB、tetM、tetO、tetT、tetW、
tetQ为研究对象,在证实了 tetW 普遍高于其他抗性
基因的基础上,通过直接设计 tetW 两侧特异性和随
机性引物,采用 Tail鄄PCR 技术扩增天津海河底泥样
品中 DNA 的 tetW 侧翼序列,结合美国国立生物技
术信息(NCBI)数据库,分析 tetW 侧翼序列的保守
元件. 从底泥样品总 DNA 中成功获得多条侧翼序
列,不仅揭示出多个保守元件,也为同类探究未知序
列功能的研究提供了高效的方法.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 采样地点
沿着海河流域和它的主要支流采集底泥样品
(图 1),共设置 5 个采样点,从上游至下游包括:解
放桥、洪泥河、洪泥河入海河口、外滩、海河入海口.
利用采泥器在不同地点采集 100 g 底泥样品,存放
在消毒容器中,置于冰盒中暗处保存.
1郾 2摇 样品前处理和 DNA提取
将采集的样品进行冻干,取冻干底泥样品 1 g,
按照土壤 DNA 提取试剂盒( soil DNA isolation kit,
MoBioLaboratories, Inc. ) 提取,并用纯化试剂盒
(DNA pure鄄spin kit, Vigorousbio)进一步纯化,以排
除 PCR反应的阻抑剂. DNA的纯度通过琼脂糖凝胶
电泳和分光光度计(ND1000, Nanodrop)进行鉴定.
1郾 3摇 引物设计
普通 PCR扩增 tetB、tetM、tetO、tetT、tetW、tetQ 和
定量 PCR 定量 tetW 和 16S 的引物均来源于文献
[16]. Tail鄄PCR的引物设计在保证 tetW 高保守性的
前提下,尽量靠近侧翼,随机引物主要来源于文献
[17-19].
图 1摇 海河流域底泥样品采集点位
Fig. 1摇 Sediment sampling locations in Haihe River.
A:解放桥 Jiefang Bridge; B:洪泥河 Hongni River; C:洪泥河入海口
Hongni River estuary; D:外滩 Waitan; E:海河入海口 Haihe River es鄄
tuary. 下同 The same below.
表 1摇 Tail鄄PCR所用到的 tetW特异性引物
Table 1摇 Tail鄄PCR special primers in tetW gene amplifica鄄
tion
引物
Primer
引物序列( 5爷鄄3爷)
Primer sequence(5爷鄄3爷)
目标基因
Target gene
tetW鄄R1 AAGTTGTCTTTACTGGCGAGATTCC tetW
tetW鄄R2 ACTGATCTGGCCTCTTACACCAACG tetW
tetW鄄R3 GCCTGGACAAGGTGCGCTATATGTT tetW
tetW鄄L1 GTTGACTTTACATCTGTGCCACTGG tetW
tetW鄄L2 AAGTGACTGCCGCTTGAATGGTAAT tetW
tetW鄄L3 GCTCTCCGTCAAGGTCGTCTTTCCA tetW
1421 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 刘摇 建等: 抗生素抗性基因连锁传播的侧翼保守元件分析摇 摇 摇 摇 摇 摇
1郾 4摇 普通 PCR检测四环素抗性基因
PCR反应体系(25 滋L总体积)包括 2. 5 滋L Taq
缓冲液、0. 2 mmol·L-1 dNTPs、0. 2 滋L引物、1郾 75 单
位 Taq DNA聚合酶和 1 滋L DNA模板.阳性对照(已
验证含有四环素抗性基因的大肠杆菌)和阴性对照
(已验证不含有四环素抗性基因的大肠杆菌)都包
括在 PCR分析中.
1郾 5摇 实时定量 PCR(qPCR)
通过 Bio鄄Rad IQ5 仪器 ( Bio鄄Rad Company,
U. S. )检测 tetW 基因的拷贝数. 通过底泥样品的
DNA普通 PCR扩增、切胶回收、克隆构建,并通过测
序验证 tetW和 16S基因的阳性对照.本试验采用绝
对定量的方法,构建了 tetW 和 16S 基因的定量标准
曲线.定量 PCR反应体系为 25 滋L 反应预混液( iQ
SYBR Green Supermix, Bio鄄Rad),其中包括 0. 2 滋L
引物和 1 滋L DNA模板.
1郾 6摇 Tail鄄PCR 扩增 tetW侧翼序列和测序
根据 tetW 左右侧序列分别设计 3 对特异性嵌
套引物 tetW鄄R1、2、3 和 tetW鄄L1、2、3(表 1),同时 7
条随机简并引物 AD1鄄AD7 来源于文献[17-19],进
行 Tail鄄PCR 扩增,扩增条件参见文献 [18 - 19]
(表 2).
1郾 7摇 目标片段测序和序列比对
Tail鄄PCR产物进行电泳检测,确定电泳 2、3 轮
有梯度的清晰条带,对第 3 轮的条带进行切胶,采用
表 2摇 Tail鄄PCR 扩增 tetW反应条件
Table 2摇 Cycling conditions used for Tail鄄PCR
反应
Reaction
循环数
Cycle No.
扩增条件
Thermal condition
第 1 轮 1 95 益 5 min,95 益 1 min
Primary 5 94 益 30 s,60 益 1 min,72 益 2 min
1 94 益 30 s,25 益 3 min,以 0. 2 益·
s-1升至 72 益,72 益 2 min
10 94 益 30 s,44 益 1 min,72 益 2 min
15 94 益 30 s,60 益 1 min,72 益 2 min
15 94 益 30 s,60 益 1 min,72 益 2 min
15 94 益 30 s,44 益 1 min,72 益 2 min
1 72 益 7 min
第 2 轮 15 94 益 30 s,60 益 1 min,72 益 2 min
Secondary 15 94 益 30 s,60 益 1 min,72 益 2 min
15 94 益 30 s,44 益 1 min,72 益 2 min
1 72 益 7 min
第 3 轮 1 95 益 1 min
Tertiary 15 94 益 30 s,60 益 1 min,72 益 2 min
15 94 益 30 s,60 益 1 min,72 益 2 min
15 94 益 30 s,44 益 1 min,72 益 2 min
1 72 益 10 min
DNA凝胶纯化试剂盒(Transgen)纯化扩增后的目的
基因片段,进行克隆转化,将片段连接在 pGEM鄄
TEasy载体上(Transgen),然后转化感受态大肠杆菌
细胞(Transgen).涂平板后挑选阳性克隆子,进行菌
落 PCR,对于目标片段大小合适的菌落,用 LB 培养
液扩大培养(约 5 mL),取 1 mL 菌液送北京华大基
因组研究中心测序插入基因片段. 最后序列的整合
和连接用 DNAMAN program (Lynnon Biosoft, Pointe鄄
Claire, Quebec, Canada),核苷酸和残基蛋白质序列
的比对通过 NCBI 网站(http: / / www. ncbi. nlm. nih.
gov / blast / Blast. cgi)数据库中的 blast 程序进行同源
性检索比对.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 普通 PCR检测和定量 PCR检测
通过普通 PCR 分析得到,海河采样的 5 个地
点,tetW基因相对于其他四环素类抗性基因在底泥
中更加普遍(表 3),说明这种抗性基因易于扩散并
具有持久的存在能力,这和其他文献的研究结果一
致[20-21] .定量的数据分析发现,在海河流域的 5 个
采样点中,以解放桥底泥的 tetW 基因的含量最高,
说明这一区域的四环素类基因污染严重. 因此本试
验主要以解放桥区域的 DNA 作为模板,进行 tetW
侧翼序列的研究(图 2),以分析其主要侧翼序列及
与 ARG扩散相关的功能元件.
2郾 2摇 Tail鄄PCR结果
2郾 2郾 1 Tail鄄PCR下游序列结果摇 通过 Tail鄄PCR 获得
了 tetW下游序列电泳图(图 3)和 600 bp 序列模式
图(图 4).
摇 摇 对在第 2 轮和第 3 轮中有梯度的条带,进行切
胶回收,分别为 AD2 的 600 bp片段和 300 bp 片段、
AD3 的 1000 bp片段和 600 bp片段、AD4 的 1000 bp
片段和500 bp片段、AD5的600 bp片段和400 bp
表 3摇 海河流域底泥抗性基因 PCR检测结果
Table 3摇 PCR analysis of ARGs in sediment of Haihe River
抗性基因
ARG
A B C D E
tetW + + + + +
tetQ - + + - +
tetO - + + - -
tetT + - - - -
tetM - + - + +
tetB - - - - -
A:解放桥 Jiefang Bridge; B:洪泥河 Hongni River; C:洪泥河入海口
Hongni River estuary; D:外滩 Waitan; E:海河入海口 Haihe River es鄄
tuary.
242 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷
片段、AD6 的 800 bp片段,共 9 条序列.其中 600 bp
片段如下:GCCTGGACAAGGTGCGCTATATGTTTC 鄄
詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬AGAAGGTAATGTA AAGATACATAATCGTCAAGA 鄄
詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬CGGCAACAATCAGAAGTTATGGAGGGTAACA ATG 鄄
GAATATAGTAAGGAAGATTTAATGGAAGCAAAAA 鄄
AGCAAATTTGGGGAGTGGGAGAGAACATGGGAAC 鄄
AGAGGAAAGTAAAAAAATCTGGGAGGAGAACGCA鄄
CAATTTTGGGATAATGCAATGGGTGACGAATCTAA 鄄
TGAATTTCACAGAGAGGTAGTGCGTCCCAAAGTAA鄄
CGGAACTTCTATCTCCTAATCCTGCGGATTACATTT 鄄
TGGATATTGCGTGTGGCAATGGAAATTATTCTTCGT鄄
ATCTTGCACAAAGAGGCGCTTCGGTTGTCGCTTTTG鄄
ATTACAGCAAAAAAATGATAGAATTGGCTAAAAG 鄄
ACGGCAATCACAATATGCAAAACAAATTGAATTTT 鄄
GTGTGGCGGATGCGACCGATAGAAAAAGTATATTA鄄
GAATTAAAAAGAAATCGAGCCTTTAC鄄GAAAGCAG鄄
TTTCTAATATGGCAATTATGGATATTACGGATATTG鄄
AACCACTTCTTATGGCTGTTTATGAACTGTTGCAGG鄄
图 2摇 海河流域底泥样品 tetW抗性基因定量 PCR检测结果
Fig. 2摇 Quantitative PCR analysis of tetW in sediment samples
of Haihe River (mean依SD).
图 3摇 Tail鄄PCR获得 tetW下游序列电泳图
Fig. 3摇 Agarose gel analysis of Tail鄄PCR products for amplifica鄄
tion of tetW downstream sequences.
从左到右依次为随机引物 AD1、2、3、4、5、6、7 的第 2 轮、第 3 轮扩增
产物,最后条带为 15000 bp片段. From left to right side, they were the
secondary and tertiary amplifying products of shorter arbitrary degenerate
primer AD1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, and the last lane was 15000 bp marker.
图 4摇 下游序列模式图
Fig. 4摇 Ideograph of the downstream sequences.
箭头为 tetW基因 The arrows was tetW gene; 含有细纹的长条为 100%
保守的 44 bp 序列 The strip on groove was 100% conservative 44 bp;
ORFY为阅读框架,其表达产物为甲基转移酶 ORFY was the open
reading frame, and the expressing product was methyltransferase.
AAAGCGGAATTTTTGTCTGTGCTTC(单划线为 tetW鄄
R3 引物, 双划线以前序列为 tetW 基因序列, 波浪
线处为 tetW下游 100%保守的44 bp序列, 后面序列
为一个阅读框架).
摇 摇 通过 NCBI数据库 blast程序进行同源性比对所
得的 27 段序列中,tetW右侧的最初 44 bp 具有高度
的保守性,这个重要的 44 bp 存在于 Butyrivibrio
fibrisolvens partial transposon TnB1230 ( GenBank ac鄄
cession number AJ222769),TnB1230 已被证实可以
携带抗性基因在菌间进行横向传递[11] .这段 tetW右
侧 44 bp序列存在于很多分离的菌种和不能培养的
菌种中,保守性 100% .在 Tail鄄PCR扩增的 tetW右侧
序列长度为 569 bp, 其中 558 bp 和 566 bp 长片段
相似度达到 99%的一共有 13 个. 分别隶属于 Sele鄄
nomonas ruminantium、 Faecalibacterium prausnitzi、
Clostridium、 Bifidobacterium thermophilum、 Mitsuokel鄄
la、 Clostridiaceae bacterium、 Roseburia、 Eubacterium
属。 tetW右侧还具有一段保守的 ORF阅读框架,并
且它在菌种 Clostridiales sp. SM 4 / 1、Faecalibacteri鄄
um prausnitzii L 2 / 6、Clostridium saccharolyticum鄄like
K 10、 Eubacterium siraeum V10Sc8a、 Eubacterium
siraeum 70 / 3 中,表达产物是 255 氨基酸序列的甲基
化酶,它参与泛醌和甲基萘醌类的生物合成. 在
Bifidobacterium thermophilum strain LMG 21813 中,表
达产物为 SAM非依赖的甲基转移酶.
2郾 2郾 2 Tail鄄PCR左侧序列结果摇 通过 Tail鄄PCR 获得
了 tetW上游序列电泳图(图 5)和 600 bp 序列模式
图(图 6).
摇 摇 对第 2 轮和第 3 轮有梯度的条带进行切胶回
收,分别为 AD2 的 500 bp、 AD3 的 1000 bp 和
400 bp、AD4 的 600 bp、AD5 的 400 bp、AD6 的 400
bp, 共 6 条左侧序列.其中 600 序列如下:
GTTGCGTATGAAAGGAAGGGAACGATACAGG鄄
GAGAAAACAGGCTATTCCGGCTTTACGGTTGAAAC鄄
CTTATACGATACATTTATGCAGACAACACCACGGA鄄
TCGGCTTTTGGCTGGACAATTCCAATCAAACACCA鄄
3421 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 刘摇 建等: 抗生素抗性基因连锁传播的侧翼保守元件分析摇 摇 摇 摇 摇 摇
CAGCAGACAGCAGAAACCATTCTGAACACCAGGA鄄
詭詭詭詭詭詭詭詭詭詭詭詭AGCCGGTATGATTGT TACATATAAGGGGAAGAAA鄄
詭詭詭詭詭詭AATTTCTTTTAAGTACTTGCTTTCCTAAAACTGATG鄄
TGATATAATAGCTTCATTCTAGAAAAGGAGTAAAA鄄
AATATGCGGCAAGGTATTCTTAAATAAAACTATAA鄄
TCAAATAGTGGGAACAAAGAATTATGATAGCTCCT鄄
TTTGTGGGGGCTTGGTTTTTTGTACCCAATTTAAGA鄄
ATACTTTTGCTTATCAATTTTGACATATTCAAAAAA鄄
CAGCAATCACAAATAGGTG TATGCTGTATATGTGT鄄
詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬ATGTCCGCAACTTAT AATCCCCAGTGGTAAAAGTA鄄
詬詬ATTTTACTG CTGGGGATTTTTATGCCCTTTGGGGCT鄄
GTAAAGGGAGGACAATCAC ATGAAAATAATCAAT鄄
ATTGGAATTCTTGCCCATGTAGACGC TGGAAAGAC鄄
GACCTTGACGGAGAGC(单划线为 tetW鄄L3 引物, 双
划线后序列为 tetW基因序列, 单波浪线为反向重复
序列, 双波浪线为末端插入序列).
摇 摇 通过 NCBI数据库 blast 程序进行同源性比对,
tetW左侧序列中,在基因上游最初的 250 bp 位于含
有保守的调控区域,其中包括由 14 个氨基酸
(MLYMCMSATYNPQW)组成的开放阅读框架,它可
能具有转录延迟作用[22] .这段区域中还有一个完整
的插入重复序列,17 bp(AATCCCCAGTGGTAAAAG鄄
TATTTTACTGCTGGGATT),它能形成一个稳定的茎
图 5摇 Tail鄄PCR获得 tetW上游序列电泳图
Fig. 5摇 Agarose gel analysis of Tail鄄PCR products for amplifica鄄
tion of tetW upstream sequences.
从左到右依次为 15000 bp片段和随机引物 AD1、2、3、4、5、6、7 的第 2
轮、第 3 轮扩增产物 From left to right, they were 15000 bp marker, the
secondary and tertiary amplying products of shorter arbitrary degenerate
primer AD1, 2, 3, 4, 5, 6, 7.
图 6摇 上游序列模式图
Fig. 6摇 Ideograph of the upstream sequences.
箭头为 tetW基因 The arrow was tetW gene; IS序列 Insertion sequences:
TACATATAAGGGGAAGAAAAATTTCTTTTA; IR 序列 Inverted repeat
sequences: AATCCCCAGTGGTAAAAGTATTTTACTGCTGGGGATT;
RP 序 列 tetW鄄regulatory peptide: ATGCTGTATATGTGTATGTCAG鄄
CAACTTATAATCCCCAGTGGTAA.
环,接着就是一段延伸的胸腺嘧啶残基,它扮演着
滓鄄independent终止子的作用,随后在 tetW 基因上游
起始编码位点有一段由 9 bp 的碱基形成的核糖体
结合位点.
在 Tail鄄PCR 扩 增 的 上 游 序 列 中 有 一 段
TACATATAAGGGGAAGAAAAATTTCTTTTA序列,这
一段序列是一段末端插入序列 IS.在 Bifidobacterium
longum strain F8 中,这段序列有特殊意义,这段插入
序列中间含有 818 bp的 ORF,编码 272 个氨基酸的
蛋白质,这个蛋白质同来源于 Bordetella sp. 的
IS1002、the Vibrio cholerae 的致病岛和 the Micrococ鄄
cus sp. strain 28 质粒 pSD10 中的移动元件上发现的
转座酶蛋白有 30%的相似度[15] . 这段插入序列可
能是大部分转座酶的移动位点,在抗性基因的转移
和传播中,起到了重要作用.
3摇 讨摇 摇 论
有文献报道,抗生素抗性基因已经被视作一种
新型污染物在各种微生物之间广泛传播,其能随可
移动载体横向转移,实现快速增值扩散[12-14] . 但某
些种类的抗性基因即使在缺失对应抗生素选择压力
的情况下仍可通过载体高效传播,一种推断是特定
抗性基因依赖特定传播机制,对抗性基因上下游保
守元件进行分析是揭示这种特定机制的必要途径.
大部分研究抗性基因序列的方法多是首先从环
境中分离单一菌种[23-27],而对一个种类丰富的微生
物群体,因工作量巨大而难以实现,并且因为对环境
中难以分离和培养的菌种的序列信息无法得到,会
遗漏很多 tetW的侧翼信息.而从环境样品中直接提
取总 DNA, 进行侧翼序列的分析,能够保证序列信
息的丰富性.
常规的 PCR 只能扩增两引物之间的 DNA 区
段,难以对已知 DNA 序列侧翼的未知序列进行扩
增.反向 PCR、半特异性 PCR 等方法可以部分地克
服上述缺点,但在 PCR反应前必须进行酶切、连接、
加尾等一系列繁琐的操作. Tail鄄PCR 技术能够快速
地扩增得到目标序列侧翼序列信息,具有操作简单、
特异性高、灵敏度高等优势[28-29] .
本试验运用 Tail鄄PCR 技术,从环境样品提取的
总 DNA 模板中扩增出 tetW 的多条上下游的序列,
通过 NCBI数据库 blast 程序进行同源性比对分析,
发现了多个保守元件,其中,tetW 上游 250 bp 序列
在 NCBI 比对的菌种中有 94% 相似性,其中含有
tetW调节肽,它可能具有转录延迟作用,此外有一段
442 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷
AATCCCCAGTGGTAAAAGTATTTTACTGCTGGGGATT
的反相重复序列. 上游 460 bp 序列在 Arcanobacteri鄄
um pyogenes、 Lactobacillus reuteri strain、 Streptococcus
suis、 Butyrivibrio fibrisolvens、 Selenomonas ruminanti鄄
um、Bifidobacterium thermophilum、Bifidobacterium lon鄄
gum、Clostridium saccharolyticum鄄like K10、 Eubacteri鄄
um siraeum V10Sc8a、 Clostridiaceae bacterium K10、
Faecalibacterium prausnitzii菌种中具有 95%相似度,
其中含有序列TACATATAAGGGGAAGAAAAATTT 鄄
CTTTTA,为末端插入序列,很多转移酶蛋白基因是
插入此处的,估计这段序列同抗性基因的传播有必
然联系,但仍需后续试验研究加以确证.
上游 533bp 序列,在 Escherichia coli strain ES2鄄
K21、Streptococcus parasanguinis、Eubacterium saburre鄄
um strain 41. 2T. 2、 Streptococcus salivarius strain
FStet12 菌种相似度达到 99% , 但测序序列为抗性
基因 tet(32),也是一种核糖体保护蛋白,和 tetW 有
同源性,分析可能与四环素类抗性基因的侧翼序列
有更多的相似性.这 4 个菌种中含有两段 ORF,其中
一个为 Orf173 部分序列,表达产物为磷酸转移酶,
随机引物可能就结合在这个酶的部位. 另一个为
Orf23, 前导肽,氨基酸序列为 MIAPFVGAWFFVPN鄄
LRILLPYQF.
tetW下游序列在 44 bp处,与通过 NCBI数据库
blast程序进行同源性比对的菌种具有 100%相似.
在下游 566 bp的序列中,普遍存在一个保守的 OR鄄
FY阅读框架,虽然有些菌种编码氨基酸的长度有些
差异,但酶的活性中心没有变化,这一保守的 ORFY
区域可能与 tetW传播的机制有一定关联.
本试验通过 Tail鄄PCR 从环境模板中获得了多
条 tetW抗性基因上下游序列,其中存在多个已知和
未知的可能同 tetW 传播相关的保守功能元件. 同
时,本试验为研究混合复杂模板的未知功能序列提
供了有效方法.
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作者简介摇 刘摇 建,男,1982 年生,硕士研究生.主要从事抗
性基因的分子生物学研究. E鄄mail: liujian1982@ live. cn
责任编辑摇 肖摇 红
642 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷