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糙苏素的抗肿瘤作用及机制研究



全 文 :中国药房 2010年第21卷第39期 China Pharmacy 2010 Vol. 21 No. 39
形成。
SEM观察结果显示,黄芩苷、黄芩素体外能抑制铜绿假单
胞菌对固体表面的黏附能力,显著抑制铜绿假单胞菌生物膜
的形成,还能破坏铜绿假单胞菌已形成的早期和成熟期生物
膜;且黄芩苷、黄芩素对生物膜的破坏效果与大环内酯类药物
阿奇霉素相似。从而证明黄芩苷、黄芩素与阿奇霉素对铜绿
假单胞菌早期生物膜的形成具有强大的抑制作用,对成熟生
物膜的抑制作用则较弱。结合前期研究[1]可知,黄芩苷、黄芩
素具有逆转MRSA耐药的作用,其机制可能与抑制 PBP2a的
表达有关。而黄芩一旦与某些抗菌药物联合应用就可以明显
提高这些抗菌药物的杀菌效力,体外研究也证实中药可以促
进抗生素对细菌的杀伤作用[5],这些研究结果进一步促进了清
热燥湿(解毒)中药的临床研究和应用,形成了中药“抗菌增
敏”的概念。这也给笔者对于临床上使用黄芩对铜绿假单胞
菌生物膜感染的防治提供了理论依据。但生物膜毕竟只是细
菌耐药的机制之一,要完全弄清黄芩苷、黄芩素的“抗菌增敏”
效应,还有待进一步的研究。
参考文献
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(收稿日期:2009-11-03 修回日期:2010-03-12)
糙苏素的抗肿瘤作用及机制研究Δ
谢文利*,朱 江,万宗明,赵艳威(武警医学院药理学教研室,天津市 300162)
中图分类号 R285;R94 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2010)39-3653-03
摘 要 目的:研究糙苏素的抗肿瘤作用及其对端粒酶活性和细胞周期的影响。方法:采用血清药理学与体内、外抑瘤实验相结
合的方法,MTT法检测糙苏素含药血清对体外培养的人白血病K562细胞增殖的抑制作用,聚合酶链反应-酶联免疫吸附法检测
K562细胞在糙苏素作用后端粒酶活性的变化,流式细胞仪分析细胞周期的改变;体内实验采用小鼠肝癌H22细胞株接种小鼠,连
续给药 14 d,计算抑瘤率。结果:糙苏素含药血清在 10%~50%剂量范围内对K562细胞有抑制作用,且呈剂量依赖关系(P<
0.05);糙苏素作用后端粒酶活性出现抑制,且各给药组随糙苏素浓度增加抑制作用显著增强(P<0.01),同一浓度随作用时间延
长,抑制作用逐渐增强(P<0.05);K562细胞的DNA合成后期/分裂期(G2/M)细胞含量显著增高(P<0.01);糙苏素(2.5、5、10 mg·
kg-1)灌胃能显著抑制小鼠移植性肝癌H22细胞的生长。结论:糙苏素具有抗肿瘤作用,其作用是通过抑制肿瘤细胞的端粒酶活性
而实现的。
关键词 糙苏素;端粒酶;肿瘤细胞
Anti-tumor Effect of Phlomiol and Its Mechanism Study
XIE Wen-li,ZHU Jiang,WAN Zong-ming,ZHAO Yan-wei(Dept. of Pharmacology,Medical College of Chinese
Armed Police Force,Tianjin 300162,China)
ABSTRACT OBJECTIVE:To study the anti-tumor effect of phlomiol,and its influences on the activity of telomerase and cells phas-
es. METHODS:Serologic pharmacological method,in vivo and in vitro anti-tumor experiments were adopted in the study. The inhibi-
tion effect of serum containing phlomiol on the proliferation of K562 tumor cells in vitro were detected by MTT method. The activity of
telomerase in K562 tumor cell was determined by TRAP-PCR-ELISA. Flow cytometry was used to analyze the change of cell cycle. In
vivo experiment,mice was inoculated with hepatic cancer H22 cells and the mice were orally administrated with phlomiol for 14 days.
The inhibition rate of tumor was caculated. RESULTS:Serum containing 10%~50% phlomiol inhibited the proliferation of K562 tu-
mor cells in vitro in dose-dependent manner(P<0.05). Phlomiol inhibited the activity of telomerase in K562 tumor cells. The inhibi-
tion effect was in dose-dependent manner(P<0.01). Meanwhile the inhibition effect increased gradually when the action time extend-
ed in the same dose of phlomiol group(P<0.05). The content of cell in K562 tumor cells were markedly increased in G2/M phase(P<
0.01). Phlomiol(2.5,5,10 mg·kg-1,i.g)inhibited the growth of implanted hepatic cancer H22 cells signiflcantly. CONCLUSION:The
anti-tumor activity of phlomiol is performed by inhibiting the activity of telomerase in tumor cells.
KEY WORDS Phlomiol;Telomerase;Tumor cells
Δ武警总部级课题(WKH2007-2)
*副教授,硕士。研究方向:生化药理。电话:022-60578253。
E-mail:iewenli5@sina.com
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China Pharmacy 2010 Vol. 21 No. 39 中国药房 2010年第21卷第39期
糙苏素(phlomio1)为唇形科(Labiete)糙苏属(Phlomis)植
物螃蟹甲中的一种环烯醚萜苯类成分。现代药理研究表明,
植物中许多环烯醚萜苷类化合物有抗炎、抗肿瘤、抗氧化和抗
菌等活性[1],因此我们推测糙苏素可能具有抗肿瘤作用。端粒
酶的激活可以维持端粒的长度并使细胞获得无限增殖能力而
逃避死亡。近年来,许多研究发现绝大部分肿瘤都呈端粒酶
阳性,提示端粒酶在肿瘤的发生、发展过程中起着重要作用。
本文对糙苏素的抗肿瘤作用及对端粒酶和细胞周期的影响进
行探讨。
1 仪器与材料
1.1 仪器
DG3022A型酶标仪(瑞士Tecan公司);ProfileⅡ型流式细
胞仪(美国 Coulter公司);LDZ4型台式高速离心机(德国
Eppendorf公司);TS100型倒置显微镜(日本Nikon公司)。
1.2 试药
糙苏素(中国药品生物制品检定所,批号:100641-
200401);端粒酶-PCR-ELISA检测试剂盒(美国 Boehringer
Mannheim公司,批号:20071105);MTT(美国 Sigma公司,批
号:071055)。
1.3 动物、细胞株及动物瘤株
健康 ICR小鼠40只,♂♀兼半,体质量(21±4.6)g,北京维
通利华实验动物中心提供(动物生产许可证号:SCXK(京)
2002-0003)。人白血病细胞K562细胞株,由中国医学科学院
药物研究所提供。动物移植性肿瘤小鼠H22细胞,由天津医
药科学研究所提供。
2 方法
2.1 实验血清制备
按文献方法[2]制备2组实验血清,即无药血清和含药血清
组。每组取大鼠 6只,♂♀兼半。实验前禁食不禁水 18 h,含
药血清组 ig糙苏素溶液,剂量为100 mg·kg-1;无药血清组 ig等
容积生理盐水,每天2次,连续3 d。末次给药2 h后乙醚麻醉,
眼眶静脉无菌采血。收集的全血以2 500 r·min-1离心15 min,
取血清,合并同组血清后,经 56℃水浴、30 min灭活,放入-
20℃冰箱中贮藏,备用。
2.2 糙苏素含药血清对体外培养的K562细胞的抑制作用
参考文献方法[3]进行细胞复苏、传代,消化并计数,细胞数
为 1×104个·mL-1。接种于 96孔板上,置于 37℃、5%CO2培养
箱中培养 24 h。细胞分为空白对照(50%)和糙苏素含药血清
高、中、低浓度(50%、20%、10%)组。每孔加入100 μL相应浓
度药物或空白培养基,做4复孔。相同条件继续培养48 h。终
止培养前4 h加入20 mL MTT,培养结束后,离心去除上清液,
每孔加入 200 μL二甲基亚砜,振荡器混匀,在酶标仪上于 490
nm波长处测定溶液吸光度(OD)值。
2.3 糙苏素对小鼠H22肝癌的生长抑制作用
采用常规方法[4],分别设对照(ig,等量生理盐水)、环磷酰
胺(ip,100 mg·kg-1)和糙苏素高、中、低剂量(ig,10、5、2.5 mg·
kg-1)组。各组于接种次日开始每天给药1次,连续给药10 d。
2.4 端粒酶活性测定
分组同“2.2”项下方法操作。K562细胞接种于100 mL培
养瓶中至对数生长期,分别加入浓度为 10%、20%、50%的糙
苏素含药血清作用48、72 h,空白对照组加等量培养液。分别
收集不同浓度糙苏素作用后不同时间点的细胞(105个),加入
500 µL磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤,4℃下3 000 r·min-1离心10
min,弃上清,沉淀加适量细胞裂解液悬浮,置冰浴30 min,4℃
下 14 000 r·min-1离心 20 min,吸取上清于-70℃贮藏,备用。
采用Kim NW等[5]的改良聚合酶链反应-酶联免疫吸附法进行
测定,操作步骤均按试剂盒说明书进行。
2.5 细胞周期分析
参考文献方法[6]分别收集 10%、20%、50%的糙苏素含药
血清作用72 h和未处理的K562细胞,用PBS清洗2次,再用预
冷无水乙醇 700 mL·L-1固定,4 ℃贮藏。检测前离心去除乙
醇,碘化丙啶染色20 min,于流式细胞仪测定细胞周期中不同
时相的细胞数。
2.6 统计学方法
实验数据采用SPSS11.0软件进行分析,2组间比较采用 t
检验,多组间比较行方差分析和q检验。
3 结果
3.1 糙苏素含药血清对体外培养的K562细胞的抑制作用
糙苏素对K562细胞均具有抑制作用,且在浓度为10%~
50%范围内抑制作用呈剂量依赖性(P<0.01或P<0.05)。糙
苏素含药血清对 K562细胞的抑制作用见表1。
表1 糙苏素含药血清对K562细胞的抑制作用(x±s,n=4)
Tab 1 Inhibitory effect of serum containing phlomiol on the
growth of K562 tumor cells(x±s,n=4)
组别
空白对照组
糙苏素含药血清低浓度组
糙苏素含药血清中浓度组
糙苏素含药血清高浓度组
环磷酰胺组
OD值
0.83±0.11
0.62±0.17*
0.43±0.12**
0.25±0.03**
0.21±0.03**
与空白对照组比较:*P<0.05,**P<0.01
vs.blank control group:*P<0.05,**P<0.01
3.2 糙苏素对小鼠H22肝癌的生长抑制作用
实验过程中可观察到糙苏素高、中、低剂量和环磷酰胺组
小鼠饮食饮水正常、皮毛柔顺光滑、活动自如,生活质量明显
优于对照组小鼠。各组间小鼠体质量增加无显著差异(P>
0.05)。同时,高、中、低剂量糙苏素对肿瘤具有抑制作用(P<
0.01或P<0.05),抑制强度呈剂量依赖性。糙苏素对小鼠H22
肝癌的生长抑制作用见表2。
3.3 糙苏素含药血清对端粒酶活性的影响
10%的糙苏素含药血清作用 48 h后端粒酶活性出现抑
制,且各给药组随糙苏素浓度增加抑制作用显著增强(P<
0.01);同一浓度随作用时间延长,抑制作用逐渐增强(P<
0.05)。糙苏素含药血清对端粒酶活性的影响见表3。
3.4 糙苏素含药血清对细胞周期的影响
采用 10%、20%、50%的糙苏素含药血清作用 72h后的
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中国药房 2010年第21卷第39期 China Pharmacy 2010 Vol. 21 No. 39
K562细胞的G2/M期细胞数所占百分比均明显提高(P<0.01
或P<0.05),20%糙苏素含药血清组与 50%糙苏素含药血清
组比较无显著差异(P>0.05)。糙苏素含药血清对细胞周期的
影响见表4。
表4 糙苏素含药血清对细胞周期的影响(x±s,n=4)
Tab 4 Effect of serum containing phlomiol on cell cycle
(x±s,n=4)
组别
空白对照组
糙苏素含药血清低浓度组
糙苏素含药血清中浓度组
糙苏素含药血清高浓度组
环磷酰胺组
K562细胞的G2/M期细胞数所占百分比/%
19.1±1.5
43.3±4.5*
62.5±6.4**
58.1±4.2**
60.9±3.2**
与空白对照组比较:*P<0.05,**P<0.01
vs.blank control group:*P<0.05,**P<0.01
4 讨论
糙苏属植物在全球约有100种以上,在我国,糙苏属植物
多作药用,中医学、民族医学的药性理论认为本属植物具有理
气健脾、清热解毒、消肿止痛、祛风活络、活血调经、止咳化痰
之功效,广泛用于治疗消化不良、筋骨疼痛、疮疥肿毒、咳嗽痰
多、感冒发热、风湿性关节炎、肺炎、支气管炎等疾病[7]。糙苏
素为糙苏属植物螃蟹甲中的一种环烯醚萜类成分,该成分很
可能就是糙苏属植物治疗“疮疥肿毒”的主要药理基础,即抗
肿瘤作用的主要成分[8]。
笔者采用体内、体外2种方法对糙苏素的抗肿瘤作用及其
机制进行了初步研究,其中体外实验采用了血清药理学的方
法,它排除了传统中药体外实验中中药本身的理化性质对实
验的干扰,又能反映药物在体内的生物转化过程及其作用结
果[9]。近年来,中药抗肿瘤分子机制的研究主要集中在诱导凋
亡、诱导分化、端粒酶抑制、微管蛋白活性抑制等方面,笔者选
择的是端粒酶活性测定及细胞周期分析的方法。端粒酶特异
性地表达于各种肿瘤细胞,又是肿瘤细胞无限增殖能力所必
需,那么,理论上端粒酶的抑制可能导致肿瘤细胞生长停止或
死亡[10]。
研究结果表明,糙苏素含药血清体外可以抑制细胞生长,
具有抑制K562细胞端粒酶活性的作用,而且该作用具有时间
和剂量依赖性;采用流式细胞仪进行细胞周期分析表明,端粒
酶活性被抑制72 h后,K562细胞增殖也出现障碍,将49.3%以
上的K562细胞阻滞在G2/M期,结果表明,端粒酶活性依赖于
细胞所处的分裂周期的时相。体内实验中,荷瘤小鼠 ig糙苏
素可以使H22肿瘤显著抑制。总之,糙苏素体内、外均有抗肿
瘤作用,糙苏素对肿瘤细胞的抑制和细胞周期阻滞作用可能
与端粒酶抑制有关。
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(收稿日期:2009-12-07 修回日期:2010-04-18)
表2 糙苏素对小鼠H22肝癌的生长抑制作用(x±s,n=8)
Tab 2 Inhibitory effect of phlomiol on the growth of mice
hepatic cancer H22 cells(x±s,n=8)
组别
空白对照组
糙苏素低剂量组
糙苏素中剂量组
糙苏素高剂量组
环磷酰胺组
体质量增加/g
4.6±1.5
4.8±1.2
4.0±1.4
4.3±1.8
3.1±0.6
瘤重/g
1.77±0.35
1.15±0.23*
0.83±.015**
0.45±0.12**
0.28±0.05**
抑制率/%
35.0
53.1
74.5
84.1
与空白对照组比较:*P<0.05,**P<0.01
vs.blank control group:*P<0.05,**P<0.01
表3 糙苏素含药血清对端粒酶活性的影响(x±s,n=4)
Tab 3 Effect of serum containing phlomiol on the activity of
telomerase(x±s,n=4)
组别
空白对照组
糙苏素含药血清低浓度组
糙苏素含药血清中浓度组
糙苏素含药血清高浓度组
环磷酰胺组
OD值
48 h
1.70±0.09
0.71±0.11*
0.57±0.05**
0.32±0.06**
0.17±0.03**
72 h
1.51±0.02
0.66 ±0.03**
0.47±0.02**
0.27±0.03**
0.25±0.03**
与空白对照组比较:*P<0.05,**P<0.01
vs.blank control group:*P<0.05,**P<0.01
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