全 文 ：第 37 卷　第 2 期
2009 年 2 月
西北农林科技大学学报(自然科学版)
Journal of No rthwest A&F Univer sity(Nat.Sci.Ed.)
Vo l.37 No.2
Feb.2009
甘肃棘豆中产苦马豆素内生真菌的分离与鉴定＊
余永涛1 ,王建华1 ,赵清梅2 ,李海利1 ,宋毓民1 ,王　妍1 ,
张志敏1 ,崔忠华1 ,耿果霞1 ,李勤凡1
(1 西北农林科技大学动物医学院 ,陕西 杨凌 712100;2北方民族大学生命科学与工程学院 ,宁夏银川 750021)
[ 摘　要] 　【目的】确定甘肃棘豆中是否存在产生苦马豆素(SW)的内生真菌。【方法】对甘肃棘豆的内生真菌
进行分离 ,应用薄层色谱法和气相色谱-甲基化-α-D-甘露糖苷内标法分别对菌丝中 SW 进行检测 ,筛选可生成 SW 的
疯草内生真菌;通过形态学观察 , 应用聚合酶链反应对 5.8S rDNA-ITS 序列进行扩增 , 并对扩增序列进行分析 ,构建
系统发育树 ,对其进行种属分类。【结果】筛选出 1 种可以产生 SW 的甘肃棘豆内生真菌 FEL3 ,气相色谱内标法测得
其菌丝中 SW含量为 400.52 μg/g 。根据形态学 、5.8S rDNA-ITS 序列分析结果和文献报道 , 确定 FEL3 为埃里格孢
属真菌。【结论】甘肃棘豆中存在生成 SW的内生真菌 Embellisia sp.FEL3。
[ 关键词] 　甘肃棘豆;苦马豆素;内生真菌;埃里格孢属
[ 中图分类号] 　Q949.32 [ 文献标识码] 　A [ 文章编号] 　1671-9387(2009)02-0040-07
Isolation and identificat ion of swainsonine-producing fungal
endophyte from Oxytropis kansuensis
YU Yong-tao1 ,WANG Jian-hua1 , ZHAO Qing-mei2 , LI Hai-li1 , SONG Yu-min1 ,
WANG Yan1 ,ZHANG Zhi-min1 , CUI Zhong-hua1 ,GENG Guo-xia1 , LI Qin-fan1
(1 Col leg e o f Veter inary Med icine , Nor thewest A&F Universi ty ,Yang l ing , Shaan xi 712100 , China;
2 Col leg e o f Li fe S ciences and Engineer ing , North Univer sity for Nat ionali t ies ,Y inch uan , Ning xia 750021 , China)
Abstract:【Objective】The study w as to conf irm whether Oxy tropis kansuensis i s infected by the
sw ainsonine-producing fungal endophy te.【Method】One of the main lo cow eed in China w as assessed fo r
endophy tic fungi.The chemical composit ion of iso lated fungus w ere detected by thin-lay er chromatog raphy
and gas chromatog raphy-methy l-α-D-mannopyranoside internal standard method.In addi tion to observing
the morpho logy of sw ainsonine-producing fungal endophyte ,we analysed the 5.8S rDNA-ITS sequence of
the fungi that w as amplified by polyme rase chain reaction.Depending on the analyzed resul t of the se-
quence , the phy logenetic t ree w as established based on the morpho logy , the phylo genetic t ree and docu-
ments.【Result】A species of fungal endophy te that producing sw ainsonine , FEL3 , was determined.FEL3
w as identif ied as Embel lisia sp.FEL3.【Conclusion】This is the fi rst repo rt about sw ainsonine-producing
fungal endophy te f rom Oxy tropis kansuensis.
Key words:Oxy tropis kansuensis;sw ainsonine;fungal endophy te;Embel li sia
　　苦马豆素(Sw ainsonine , SW)是一种有毒生物 碱 ,化学名为1 ,2 ,8-三羟基吲哚里西啶 ,是由Co leg-
＊ [ 收稿日期] 　2008-04-15
[ 基金项目] 　国家自然科学基金项目(30871901 , 30571315)
[ 作者简介] 　余永涛(1980-),男 ,宁夏平罗人 ,在读博士 ,主要从事动物中毒病与免疫毒理学研究。
[ 通信作者] 　王建华(1948-),男 ,河南南阳人 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事动物中毒性与营养代谢性疾病研究。
E-m ail:jhw ang1948@sina.com
a te 等[ 1] 1979 年从澳大利亚有毒植物灰苦马豆
(Swainsina canecens)中分离得到。SW 是疯草(豆
科黄芪属和棘豆属的有毒植物)的主要毒性成
分[ 2-5] ,可抑制哺乳动物细胞的溶酶体α-甘露糖苷酶
和高尔基体甘露糖苷酶 Ⅱ的活性 ,导致低聚糖代谢
和糖蛋白合成障碍[ 6-7] ,从而引起动物组织器官功能
紊乱 。动物采食疯草后 ,会发生中毒 ,导致大批家畜
死亡 ,给畜牧业造成巨大损失。除疯草中含有苦马
豆素外 ,人们从豆类丝核菌(Rhizocroniu legumini-
cola)、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopl iae)等真
菌的代谢产物中也分离到 SW[ 8-10] 。Harris等[ 11] 将
疯草 Astragalus oxyphy sus 的化学成分与豆类丝
核菌的代谢产物进行了比较 ,发现这种疯草中的 2
种化学物质与豆类丝核菌合成苦马豆素的前体物质
相同 ,提出疯草中苦马豆素的产生可能是由于疯草
感染豆类丝核菌或类似的微生物所致。Braun等[ 12]
从美国疯草中分离到可以产生苦马豆素的内生真菌
-Embel lisia sp.,并证明疯草中苦马豆素的含量和
内生真菌感染的程度相关 。以上研究结果为人们提
出了新的问题:疯草中苦马豆素是由其寄生的内生
真菌单独生成的 ,还是由疯草的植物细胞和内生真
菌共同生成的。该问题的解答将为从根本上防治动
物疯草中毒病提供科学依据。
Wang 等[ 13] 从我国重要疯草———甘肃棘豆中分
离到一种内生真菌———Embel li sia oxy tropis , 与
Braun等[ 12] 在美国疯草中发现的内生真菌形态相
似 ,同为一属 ,但未对其代谢产物进行研究。中国疯
草中是否存在能够合成苦马豆素的内生真菌 ,目前
还未见报道。为此 ,本研究对甘肃棘豆中的内生真
菌进行了分离 ,筛选出能够合成苦马豆素的内生真
菌 ,并对其进行了种属分类 ,以期为研究甘肃棘豆中
苦马豆素的合成机制提供依据 。
1　材料与方法
1.1　材　料
1.1.1　植物材料　盛花期健康的全株甘肃棘豆 ,
2007-07采于甘肃省天祝藏族自治州乌鞘岭 ,采集后
于 12 h内进行内生真菌的分离 。
1.1.2　仪器与试剂　苦马豆素(SW)标准品 ,由西
北农林科技大学动物医学院生物毒素与分子毒理学
实验室提供;甲基化-α-D-甘露糖苷(me-Gal)和 双
(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BS TFA)+三甲基氯
硅烷(TMCS ),均购自美国 SIGMA 公司;DNA 提
取试剂盒 、琼脂糖凝胶回收试剂盒 、DNA 聚合酶 、T
载体等分子生物学试剂 ,均购自 TaKaRa 公司;AG
50W 树脂 ,购自美国 BIO-RAD公司;有机试剂均为
国产色谱纯或分析纯 。
1.2　产苦马豆素内生真菌的分离
1.2.1　植物材料表面的消毒　用去离子水洗去甘
肃棘豆表面的尘土 ,用灭菌镊子将植物的叶 、茎 、花
分离 ,然后将叶 、茎 、花分别用纱布包扎 ,进行表面消
毒。表面消毒的程序为:首先 ,用体积分数为 70%
的乙醇浸泡 30 s ,再用有效氯含量为 1%的次氯酸
钠溶液浸泡 3 m in ,最后用灭菌的去离子水冲洗 2
次 ,每次 1 min ,收集去离子水接种于新制的 PDA
或 Czapek琼脂培养基表面 ,观察 30 d ,确定该培养
基表面是否有真菌生长 ,以此来检验表面消毒的效
果。
1.2.2　内生真菌的分离　用灭菌的滤纸吸去经表
面消毒植物组织上的水分 ,再用灭菌剪刀将叶 、茎 、
花等分别剪成 3 mm 的组织块 ,分别用灭菌镊子将
各组织块接种于水琼脂培养基表面 ,置培养箱中 18
℃培养 。待组织块周围长出适当大小的菌落时 ,挑
取边缘菌丝接种于 PDA 琼脂培养基表面 ,置 18 ℃
培养箱中培养。若在 PDA 琼脂培养基上生长的菌
落仍未纯化时 ,将其再次接种于新制的 PDA琼脂培
养基表面 ,重复此操作过程 ,直至得到纯化的菌株。
将分离到的真菌编号 ,分别接种于 PCA 斜面 ,于 4
℃中保存。
1.3　产苦马豆素内生真菌的筛选
1.3.1　植物材料及其内生真菌中 SW 的薄层色谱
法检测　将甘肃棘豆样品和从甘肃棘豆中分离的真
菌菌丝分别放入索氏提取器中 ,用甲醇(色谱纯)70
℃回流提取 24 h。将提取液浓缩挥干 ,用去离子水
溶解后 ,加入 5 cm 长的 AG 50W 阳离子交换树脂
柱。先用去离子水洗脱树脂柱 ,再用氨水洗脱树脂
柱 ,收集氨水洗脱液 ,并将其浓缩挥干 ,然后用甲醇
将其溶解 ,制成待检液。将 SW标准品 、甘肃棘豆待
检液 、内生真菌菌丝待检液分别点样于硅胶薄层板
上 ,用 V氯仿∶V甲醇 ∶V氨水 ∶V水 =70∶26∶2∶2展
开剂展开。待展开剂到达薄层板前沿时 ,将其取出
挥干溶剂 ,先将 H2O 2 喷洒于薄层板表面 ,置 110 ℃
加热 10 min;接着喷洒醋酐 ,置 110 ℃加热 10 min;
再喷洒 Ehrlich s试剂 ,置 110 ℃加热 10 min ,最后
观察待检样品在薄层板上的位移和斑点颜色 ,若具
有与 SW 标准品颜色和位移相同的斑点 ,即可初步
确定其对应的内生真菌能够产生 SW 。
41第 2 期 余永涛等:甘肃棘豆中产苦马豆素内生真菌的分离与鉴定
1.3.2　植物材料及其内生真菌中 SW 的气相色谱
法检测　准确称取一定量的 SW 标准品 ,用吡啶配
制成系列质量浓度的标准品溶液 。精确量取 100
μL 各标准品溶液 ,分别加入 20 μL 1 mg/mL 的内
标(甲基化-α-D-甘露糖苷)吡啶溶液 ,混匀 ,再加入
硅烷化(BS TFA +TMCS)试剂 ,室温反应 1 h , SW
标准品溶液的终质量浓度分别为 3.125 , 1.562 5 ,
0.625 ,0.312 5 , 0.125 , 0.062 5 , 0.025 , 0.012 5和
0.005 g/L ,依次进行气相色谱分析。色谱条件为:
GC-14C (日本岛津公司),威玛龙色谱工作站 ,S E54
石英毛细管柱(30 m ×0.25 mm ×0.33 μm),柱温
200 ℃,进样口温度 300 ℃, 氢火焰离子化检测器
(FID)温度 280 ℃,载气为氮气 ,流速为 2 mL/min ,
进样 1 μL ,分流比 60∶1 。以标准样品中 SW 的峰
面积和内标峰面积之比为横坐标 x 、以 SW 的质量
浓度(g/L)为纵坐标 y ,绘制标准曲线。将 1.3.1中
制备的植物样品待检液和经薄层色谱初步确定能够
生成 SW 的内生真菌待检液离心 ,除去不溶物后挥
干 ,用吡啶溶解 ,然后同上法依次加入内标溶液和硅
烷化试剂进行气相色谱分析。若样品溶液经气相色
谱分离后出现与标准品中 SW 色谱峰保留时间相同
的峰 ,即可确定样品溶液中含有 SW ,然后根据标准
曲线方程 ,计算样品溶液中 SW含量。
1.4　产苦马豆素内生真菌的形态学观察
将 1.3中筛选得到的产苦马豆素内生真菌接种
于 PCA平板上 ,置 18 ℃恒温培养 30 d ,记录菌落的
颜色 、形状 、气生菌丝的疏密程度 ,并挑取少许菌丝
于载玻片上 ,以水或棉兰乳酸酚作浮载剂 ,观察并记
录真菌的分生孢子梗及其分生孢子形态 ,测量分生
孢子大小 。
1.5　rDNA-ITS 序列分析
1.5.1　真菌基因组 DNA 的提取　刮取 PDA培养
基表面生长 2个月的产 SW 内生真菌菌丝 ,液氮研
磨 ,然后用 TaKaRa 公司提供的 DNA 提取试剂盒
提取真菌基因组 DNA ,用 Biophotometer 测定提取
的 DNA 浓度 。
1.5.2　5.8S rDNA-ITS 片段的扩增与核苷酸序列
的测定　采用引物 I TS1和 ITS4[ 13] 扩增内部转录
间隔区(I TS),该区域包括 ITS1 、5.8S rDN A 、I TS2
的全部序列 ,以及 18S rDNA 、28S rDNA 的部分序
列。PCR反应体系为 50 μL:TaKaRa Taq 2.5 U ,
10×PCR Buf fer 5 μL , MgCl2 3 μL , dN TP 4 μL ,
ITS1和 ITS2引物各 2μL ,模板DNA 0.5 μL ,加双
蒸水至 50μL。反应条件为:95 ℃预变性 5 min;95
℃变性 30 s ,55 ℃退火 30 s , 72 ℃延伸 1 min ,30个
循环;最后 72 ℃延长 10 min 使其完全反应。将
PCR产物加入 15 g/L 琼脂糖凝胶中电泳 ,5.8S rD-
NA-ITS 序列的长度一般为 500 ～ 700 bp 。电泳后 ,
将扩增所得的 5.8S rDNA-ITS 片段切下 ,用琼脂糖
凝胶回收试剂盒回收 。将回收的 5.8S rDNA ITS
片段与 T 载体(T aKaRa pMD19-T Vecto r)连接 ,再
将连接复合物转化 DH5α型感受态大肠杆菌。转化
后的 DH5α型感受态大肠杆菌涂布于含有 Amp 、
IPTG 、X-gal的 LB 琼脂培养基表面 ,置 37 ℃培养
18 ～ 24 h ,挑取白色的单个菌落进行菌落 PCR ,反应
体系和条件同上 。若菌落 PCR产物经凝胶电泳后 ,
出现 5.8S rDN A-ITS 对应条带 ,将该单个菌落接种
于 LB 液体培养基中培养过夜 , 用 TaKaRa Min-
BEST Plasmid Puri ficat ion质粒提取试剂盒提取含
有5.8S rDNA-I TS 片段的质粒 。提取的质粒经适
当稀释后 ,用 BigDye Teminator v3.1 测序试剂盒
扩增目的片段 ,引物为 M13-47。扩增产物经纯化
后 ,在 ABI PRISM 3730XL 序列分析仪上进行序列
测定。
登录 ht tp// :www .ncbi.nlm.nih.gov , 用
BLAST ,将测定的 5.8S rDNA-ITS 序列与 Gen-
Bank 中的 5.8S rDNA-ITS 序列进行同源性比较 ,
以假球壳科(Pleosporaceae)的链格孢属(A lternar-
ia)、匍柄霉属(S temphy lium)、假格孢属(Nimbya)、
埃里格孢属(Embel li sia)、细基格孢属(Ulocladi-
um)、突脐蠕孢属(Exserohi lum)、平脐蠕孢属(Bi-
polaris)、弯孢属(Curvularia)、内脐蠕孢属(Drech-
slera)等菌株序列构建系统发育树。应用 ClustalX
1.83 version 和 MEGA 4.0 软件 , 采用邻接法
(Neighbo r-joining ,N J)构建系统发育树 ,自展法检
测发育树 ,自展数据集为 1 000次 。
1.5.3　产苦马豆素内生真菌的分类　根据内生真
菌的形态学观察结果 ,以及由 5.8S rDNA-ITS 序列
构建的系统发育树 ,并结合参考文献报道 ,对该内生
真菌进行分类。
2　结果与分析
2.1　产苦马豆素内生真菌的分离
在甘肃棘豆的叶 、茎 、花中共分离到 7种真菌 ,
通过薄层色谱法对这 7种真菌菌丝中的 SW 进行分
析 ,其中 FEL3的菌丝提取物经薄层色谱分析 ,出现
与 SW标准品颜色和位移相同的紫色斑点(图 1),
初步确定 FEL3的菌丝中含有 SW 。
42 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 37 卷
图 1　产苦马豆素内生真菌的筛选结果
1.苦马豆素标准品;2～ 3.甘肃棘豆提取物;
4～ 5.内生真菌 FEL3菌丝提取物
Fig.1　Screening o f sw ainsonine-producing fungal endophy te
1.SW;2-3.T he ext raction f rom Ox ytropis kan suensis;
4-5.T he ex t raction f rom endophyte FEL3
以标准样品中 SW 的峰面积和内标峰面积之比
为横坐标(x)、以 SW 的质量浓度(g/L)为纵坐标
(y)绘制标准曲线 , 得到标准曲线方程 y =
0.264 8x +0.016 6(R2 =0.998 7),说明当SW 的质
量浓度在 0.012 5 ～ 1.562 5 g/L 时 , SW 的质量浓
度与 SW 峰面积和内标峰面积的比值呈良好的线性
关系(图 2)。FEL3菌丝待检液经气相色谱分离后 ,
出现与标准品中 SW 色谱峰保留时间相同的峰(图
3),说明 FEL3的菌丝中含有 SW ,根据标准曲线方
程得出 FEL3菌丝中 SW的含量为 400.52 μg/g 。
图 2　苦马豆素的内标标准曲线
Fig.2　Internal standa rd curv e of SW
图 3　甘肃棘豆内生真菌 FEL3提取物的气相色谱图
A.苦马豆素标准品气相色谱图;B.甘肃棘豆内生真菌 FEL3提取物的气相色谱图;1.内标峰;2.苦马豆素峰
Fig.3　GC chromatog r am of ex traction f rom endophy te FEL3
A.Th e GC chromatogram of SW;B.The GC ch rom atogram of ext ract ion f rom endophyte FEL3;1.Th e chromatograp hic peak of
internal standard sub stan ce;2.The the chromatographic peak of SW
2.2　产苦马豆素内生真菌的形态特征
FEL3在水琼脂 、PDA 、PCA 、Czapek 等培养基
上生长非常缓慢 ,其生长速度分别为 0.17 , 0.33 ,
0.40和 0.30 mm/d。在 PDA 、PCA 、Czapek 等培养
基上 ,随着培养时间的延长 ,菌落逐渐由白色变为黄
褐色 、黑褐色 、黑色 ,菌落呈绒状 ,中央凸起 ,气生菌
丝较密集(图 4A)。分生孢子稀少 ,单个散在分布 ,
形态 、大小不一 ,多数呈直的圆柱形 ,少数呈卵圆形 ,
有的呈膝状弯曲;分生孢子呈褐色 ,边缘光滑 ,具有
暗色的横膈膜 ,横膈数为 1 ～ 4 ,无纵膈 ,孢子大小为
20 ～ 60μm×6 ～ 10 μm(图 4B 、4C)。
2.3　产苦马豆素内生真菌 FEL3 的 5.8S rDNA-
ITS 序列分析
应用通用引物 ITS1和 ITS4扩增的片段 ,经凝
胶电泳分离可知 ,所扩增的片段长度约为 600 bp(图
5),该片段包括 ITS1 、5.8S rDNA 、I TS2 的全部序
列和 18S rDNA 、28S rDNA 的部分序列。
核苷酸序列测定结果显示 , FEL3 的扩增片段
长度为602 bp ,5.8S rDNA-ITS 序列的 GenBank登
录号为 EU604066 ,其 31 ～ 547 bp 为 5.8S rDNA-
ITS序列。BLAS T 比对结果显示 ,FEL3与 Embel-
lisia sp.L12的同源性高达99%,仅有2个位点核苷
酸不同 ,变异部位分别位于 I TS1 区和 5.8S rDNA
43第 2 期 余永涛等:甘肃棘豆中产苦马豆素内生真菌的分离与鉴定
区 ,与链格孢属(Alternaria)、埃里格孢属(Embel li-
sia)、细基格孢属(Uloclad ium)等属的一些种同源
性也在 95%以上 。对 FEL3与链格孢属(A lternar-
ia)、匍柄霉属(S temphy lium)、假格孢属(Nimbya)、
埃里格孢属(Embel li sia)、细基格孢属(Ulocladi-
um)、突脐蠕孢属(Exserohi lum)、平脐蠕孢属(Bi-
polaris)、弯孢属(Curvularia)、内脐蠕孢属(Drech-
slera)等属 40个序列进行系统发育分析 ,结果见图
6。由图 6 可以看出 ,系统发育树分成 A 、B 、C 、D 4
个大组:Alternaria 、Embell isia 、Ulocladium 、Nim-
bya构成一个较大的复合组 A;Drechslera和S tem-
phy lium 分别构成 B 、C 组;Exserohi lum 、Bipo-
laris 、Curvularia构成 D组。其中甘肃棘豆内生真
菌 FEL3与 Embell isia sp.L12的遗传距离最近 ,与
Embel li sia 、A lternaria 、Ulocladium 等属中的一些
成员的遗传关系较近 ,而与 Drechslera 、S temphy li-
um 、Exserohi lum 、Bipolaris 、Curvularia 等属的遗
传关系较远 。
图 4　产苦马豆素内生真菌 FEL3 的形态特征(标尺长度为 50 μm)
A.FEL3的菌落;B ～ C.FEL3的菌丝及分生孢子
Fig.4　Morpho lo gical cha racteristics o f sw ainsonine-producing fungal endophy te FEL3(Bar s=50μm)
A.The colony of FEL3;B-C.The conidiophores of FEL3
图 5　甘肃棘豆内生真菌 LEF3 5.8S rDNA-ITS
序列扩增片段的凝胶电泳分析
M.DL2000 Marker;S.FEL3的 5.8S rDNA-ITS 序列的扩增片段
Fig.5　Agaro se elect rophoresis o f amplified 5.8S rDNA-ITS
reg ion f rom fungal endophy te FEL3 , endophy te f rom
Oxy tropis kansuensis by PC R me thod
M .DL2000 Mark er;S.The ampli fied
5.8S rDNA-ITS region of FE L3
3　讨　论
甘肃棘豆是我国的重要疯草之一 ,主要分布于
甘肃 、青海 、西藏等省区 ,可引起放牧牲畜中毒 ,严重
危害西部地区畜牧业的发展 。童德文等[ 14] 从甘肃
棘豆中分离到 SW ,确定 SW 为甘肃棘豆的主要毒
性成分 ,但对 SW 在甘肃棘豆中的合成机理仍未阐
明。Braun等[ 12]从美国的一些棘豆属和黄芪属疯草
中分离到可以生成 SW的内生真菌 Embell isia sp.,
发现分离到该真菌的疯草的 SW含量显著高于未分
离到这种真菌的疯草 ,认为疯草中 SW 的含量一部
分是由该内生真菌来控制的。Wang 等[ 13] 从甘肃棘
豆中分离到 1种内生真菌 Embell isia oxy tropis , Li
等[ 15] 从直立黄芪中分离到 1种病原真菌 Embel li sia
astragali ,这 2种真菌的形态与 Braun 等[ 12] 分离到
的产 SW 内生真菌相近 ,但未检测其菌丝中是否含
有 SW ,目前还未见中国疯草内生真菌产生 SW 的
报道。
本研究对甘肃棘豆的内生真菌进行了分离和筛
选 ,首次证实甘肃棘豆中存在可以产生 SW 的内生
真菌 FEL3 。FEL3的分生孢子具有明显的横隔 ,无
纵膈 ,其形态与埃里格孢属(Embell isia)真菌[ 16-19]
最为相似 ,其分离方法 、培养特性和分生孢子的形
态 ,与 Braun 等[ 12] 、Wang 等[ 13] 报道的疯草内生真
菌 Embel li sia sp.和 Embel li sia oxy tropis 相近 。根
据 5.8S rDNA-ITS 序列构建的系统发育树 , FEL3
与埃里格孢属 、链格孢属 、假格孢属 、细基格孢属同
为一组 ,与埃里格孢属的进化关系较近 , 其中与
44 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 37 卷
Braun等[ 12] 分离的产 SW 内生真菌 Embel li sia sp.
L12最近 ,自检支持率(bootst rap)高达 98%。根据
分离方法 、培养特性 、分生孢子的形态和系统发育分
析 ,可以确定 FEL3 为埃里格孢属真菌。FEL3 与
Embel li sia oxytrop is的分生孢子形态相似 ,但由于
未研究 Embel l isia oxy tropis的 5.8S rDNA-ITS序
列 ,故还不能确定 FEL3 就是 Embel li sia oxy tro-
pis 。
图 6　由 NJ 方法构建 5.8 S rDNA-ITS 序列的系统发育树
比例尺显示水平线的长度 ,代表碱基替换数;分支处数字为大于 50%的 Bootst rap值(1 000次重复),代表分类单位被聚在一起的几率。
Fig.6　Phy lo genetic tree obtained from the pro g ram NJ(Neighbor-joining)
H orizontal bran ch lengths are d raw n to scale and repres ent the ex pected number of subst itut ions;The numbers of nodes are boot
st rap values greater than 50% f requ encies and represent the percentages of 1 000 bootst rap replicat ions in w hich the taxa to the right
are placed togeth er by the program NJ.
　　FEL3 与 Braun 等[ 12] 分离的产 SW 内生真菌
Embel l isia sp.L12的 5.8S rDNA-I TS 序列仅有 2
个核苷酸不同。从美国黄芪属疯草 Astragalus
mol li ssimus和棘豆属疯草 Oxy tropis lambert ii 中
分别分离到的Embel lisia sp.的 5.8S rDNA-ITS序
列也相差 3 个核苷酸 , β-tublin 序列相差 1 个核苷
酸 ,其菌落的颜色亦有不同 ,说明从黄芪属和棘豆属
疯草中分离的 Embel li sia sp.可能为不同的种或亚
种[ 12] 。Embell isia sp.、FEL3等疯草内生真菌是否
为不同的种或亚种 ,还有赖于对其基因间间隔区等
变异较大序列的研究 。
Braun等[ 12]利用酶法和气相色谱质谱联用法对
45第 2 期 余永涛等:甘肃棘豆中产苦马豆素内生真菌的分离与鉴定
Embel l isia sp.菌丝中的 SW 进行分析 ,需要昂贵的
试剂 、设备和复杂的操作过程 ,本研究应用较为快捷
的薄层色谱法对经过离子交换树脂处理过的真菌菌
丝提取物进行检测 ,经薄层色谱法确定菌丝中含有
苦马豆素后 ,即可应用气相色谱-甲基化-α-D-甘露糖
苷内标法对其菌丝中的 SW 进行分析 ,根据样品色
谱峰中是否具有与 SW 色谱峰保留时间相同的峰 ,
来进一步确定样品中是否含有 SW 。与酶法和气相
色谱外标法相比 ,气相色谱内标法不受进样重复性
和试验条件稳定性的影响 ,在没有自动进样器等条
件时 ,其分析结果的精确性和准确性仍能得以保
证[ 20] 。通过气相色谱内标法测得 ,甘肃棘豆内生真
菌 Embel li sia sp.FEL3 的菌丝中 SW 含量为
400.52μg/g ,表明 Embel lisia sp.FEL3 承担着甘
肃棘豆中 SW 的生物合成 ,但甘肃棘豆中的 SW 是
由内生真菌 FEL3单独合成 ,还是仅由其合成一部
分;甘肃棘豆的植物细胞自身是否也可以合成 SW;
其他微生物是否也参与 SW 的合成;甘肃棘豆中
SW含量与内生真菌之间存在何种关系 ,这些问题
仍有待进一步阐明。
据统计 ,我国有 30余种疯草 ,广泛分布于西藏 、
新疆 、青海 、甘肃 、宁夏 、陕西及内蒙古等省(区),面
积超过 1 100万 hm2 [ 21] ,除甘肃棘豆外 ,其他疯草中
是否也存在能够生成 SW 的疯草内生真菌 ,疯草内
生真菌与疯草中 SW 含量之间存在何种联系 ,这些
问题的研究将为进一步阐明疯草中 SW 的合成机理
提供了试验依据和基础 ,并为从根源上解决动物疯
草中毒病提供新的思路。
志谢:感谢西北农林科技大学植物保护学院孙广宇教
授 、赵杰博士在甘肃棘豆内生真菌的分离和鉴定中 , 提供了
宝贵的意见和支持。
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