全 文 ：1 992年第 4 期 3
变异黄茂有毒成分的分离与分析`
黄有德
( 甘肃农业大学
肖志国
兰州 7 3 0 0 7 0 )
孟聚诚 分 辛 孔 繁征
( 中国农业科学院中兽医研究所 )
摘要 从 变异黄茂 ( 月 s才: a夕 a l o s o a r公a b f l is B u n g e ) 中分离出结 晶 I , 经紫外 、 红外光谙
及液相 色谱分析 、 a 一甘 露糖谷酶抑制试验 , 并与苦马豆素 ( S w ia sn o in n e ) 标品进行 了比较 。 确
证 变异黄茂所含主要有毒成分为叫味兹定生物碱— 苦 马豆素 , 经测 定其含量为。 . 02 9% 。关健饲 变异黄茂 ; 叫味 兹 定醉 ; 苦 马豆素
豆科紫云英属 ( A : 才ar 夕 ol 哪 L . ) 的变异黄茂
( A
. v a r f a b i l`: B u n g e ) , 广泛分布于荒漠、 半
荒漠地 区 , 是西北和内蒙等地区的主要毒草之一。
仅就甘肃省河西地区初步调查来看 , 由于分布面积
较广 , 给养羊业造成的经济损 失 不亚 于棘豆 。 据
1 9 8 7一 1 9 8 8年对国营黄羊河农场的调查 , 绵羊变异
黄蔑中毒的发病率为 1 4 . 8% , 死亡率为 10 % 。
国外学者根据棘豆属 ( O x y tr o p ic ) 和有毒紫
云 英属 ( A s t r a g al o s ) 的植物对动物 有基本相同
的毒害作用的特点 , 统称其为疯草 ( L o co w e e d ) 。
国外对疯草中毒的研究始于 20 世 纪 初 , 直到 S . M .
C ol e g at
e等人 ( 1 9 7 9 ) 首次从澳大利亚 的灰 白苦
马豆 ( S vt a `。 s o o a 。 a n e s e e n : B u n g e ) 中分离出写I
跺兹定生物碱— 苦马 豆 素 为一 种 对 a 一甘露 糖昔 酶 的 强 力 抑 制 剂 ; D . R . P . T u ls ia 立 i 等人
( 1 9 8 4 ) 首次利用斑荚黄蔑和苦马豆素对猪进行了
中毒试验 , 证明苦马豆素是疯草中毒的主要致病因
素 。
国内对疯草中毒的系统研究起步较晚 , 但在流
行病学 、 实验中毒、 病理学 以及疯草中毒的防治等
方面已取得可喜成绩 。 曹光荣 ( 1 9 8 9 ) 首次从黄花
棘豆 ( 0 . 0 。人r o 。 。 p 人e l l u m B u n g e ) 中分离出苦
马豆素 。 王生奎 ( 1 9 8 8 ) 首次进行了绵羊实验性变
异黄蔑 和黄花棘豆中毒的比较研究 , 二者中毒症状
相似 , 但变异黄蔑更 为严重 , 其病理变化亦相似 ,
推测二者含同一有毒成分 。
1 9 8 8年 , 笔者对变异黄茂的有毒成分进行了提
取 , 并分离出结晶 I 和结晶 I , 对结晶 I进行了光
谱分析及相关试验 , 确定变异黄茂的主要有毒成分
为叫噪兹定醇— 苦马豆素 ( 斯旺松宁 , S w ia n -s o n i n e ) 。
材抖与方法
( 一 ) 植物样品 王9 8 8年 7 月 , 采自武威市长
城乡红水村 , 晾千备用 。 经内蒙农牧学院富象乾教
授 、 甘肃农业大学李阳春老师鉴定为变异黄茂 ( 月 s -
t r a g a l u s v a r i a b i l i s B u n g e ) ( 图 I ) 。
( 二 ) 生物碱的提取与分离 将植物样品粉碎
为约 4 0目粗粉 。 取干粉 I k g , 用 1 %盐酸浸 渍24 小
时 , 渗流 。渗流液通过 73 2型阳离子氢型交换树脂 ,
待酸德液全部通过树脂后 , 将树脂晾干 , 用氨水碱
化调至 p H g一 10 , 然后装沙氏提取器 , 用 乙醚洗脱
7 2小时 , 再 回收乙醚得粗提物— 总生物碱 ( 约30m g ) 。 粗提物装柱 , 在 1 0 0目硅胶 柱 中, 于 1 0 5 ℃
温控下活化 4小时 , 用氯仿 、 丙酮 、 甲醇液 ( 85 :
1 0 , 5 ) 洗脱 , 得粗结晶 I , 再用氯仿重结晶 , 得
纯结晶 I ( m p 1 4 4~ 145 ℃ ) 。 用氯仿 洗脱粗提物
得粗结晶耳。
( 三 ) 生物碱结晶休的化学鉴定 用 X 4 型显
微熔点测定仪 ( 北京西城光学仪器厂生产 ) 测定变
异黄茂结晶 I 的熔点 。 用 日立 2 70 型红外 分 光光度
计 、 日立 5 7型紫外分光光度计及 S Y S O6 O高压液相
色谱仪 (美国 V A R I A N 公司产 )对结晶 I 进行光谱
和液相色谱鉴定及元素分析 ,绘制出红外光谱图 、紫
外光谱图和液相色谱 图 ,并与美国 R . J . M o l y n e 。戈
博士提供的苦马豆素标准样品的谱图比对 。
( 四 ) 药理学实验
1
. 结 晶体 I 对 a 一甘露糖普酶的抑 制试验 :
( 1 )试剂 ( 基质制剂 ) : 柠檬酸一氢氧化 钠 缓
冲液 ( p H 4 ) Zm l ; 4 一甲基撒 形 酮 基 一 a 一 D 一毗喃
甘露糖昔 ( 美国 S i g m a 公司 ) 。
( 2 )酶制剂 : 1 % 鼠肝匀浆 , 采用 5 . M . C O -
l e g a t e ( 2 9 7 9 ) 报道的方法制取 。
( 3 )试验方法与步骤 : 称取苦马豆 素 标 准 样
品 ( A ) 与变异黄蔑提取结晶体 1 ( B ) 各 10 卜g,
加入酶制剂及基质制剂 , 在 37 ℃温育 30 分钟后 , 置
平皿上 , 在紫外灯 ( 2 5 4 n m ) 下观察 。
2
. 实验性中毒 : 选健康成年绵羊 ( 杂种 ) 4
漪 美国农业部西 区研究中心有毒植物研究室 R . J . M ol y n比 x 博士提供了宝贵 的苦马豆素标品 , 表示衷心 感谢。
. , 本文执笔 “ `
中兽医医药杂志 J T C犷M
图 I变异黄蔑 (A . va r ia b i li , )
万消
30勺 魂0 0
C砂
图夏 苦马豆素标准品紫外光谱图
它40和
只 , 每天何喂青干变异黄蔑 ( 自由采食 , 计算投草
量与利用量 ) 及给予充分饮水 ; 对照组 3 只 , 每天
饲喂燕麦草与箭舌碗豆草 。观察中毒症状 ,采集血 、
尿进行生化检查 , 试验结束时进行病理学检查 , 并
与自然中毒绵羊作对比 。
结果与分析
( 一 ) 生物碱的提取与分离结果 从变异黄茂
粗提物— 总生物碱中分离出无色细针状结晶 1和黄色结晶 I 。
( 二 ) 生物碱单体 I 的化学鉴定 ( 结晶 夏待
测 ) 。
1
. 含量 : 变异黄茂样品经测定分析 , 结品 I
含量为 0 . 029 % 。
2
. 熔 点 : 1 4 4一 1 4 5 oC 。
3
. 元素分析 : C 、 H 、 N 三种元素测定值 ( % )
分别为 5 5 . 5 、 8 . 8 、 7 . 3 ,得出分子式为 C 。 H , 。 N O 。 ,
其C 、 H 、 N 的计算值 ( % ) 则分别 是 C 5 . 灼 、
H 8
.
67
、
N 8
.
09
。元素分析测定值与计算值基本上
一致 。
K B r
、
,
, 二 。 、 . , r _ 、 _ 、 。 . 、 。
4
. 红外 光语 ( 丫器了立) : 用K B r 压片法测得’
IU a X
结晶 I 谱峰为 3 5 0 0一 3 3 0 0 e m 一 ` ( s . b r o a d , 一 O H ) ,
2 8 5 0一 2 7 5 o e m 一 ’ ( s . t r a n s C H一 N ) 。 与标准样
品谱 图重合 , 见附图 I 、 皿、 了 。
之叫介嘟。`
1
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图 l 结晶 I 紫外光谱图
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苦马豆素标品与结晶 I 的紫外光图谱
5
。 紫外光谱 ( M e O H
M a x
— . 苦 马豆素标品 一 。 一 吕 结晶 I结晶 I 在 Z s g n m
( 10 9 4
.
6 7 ) 波长处有最大吸收峰 , 在 2 4 9 n m ( 10 9
3
.
83 ) 波长处有一最小吸收峰 。 与苦马豆素标准样
品紫外光谱图重合 , 见附图 V 、 可、 租。
6
. 液相色谱 : 用M i e r o p a r k M C H 一 5 柱 ,
甲醉洗脱 , 柱温2 5 oC ,流速 l m l / m i n , 2 8 5 a t m ,
测定并绘制出结晶 I和苦马豆素标品高压液相色谱
图 , 见附图租和正。
( 三 ) 结晶 I对 a 一甘餐糖昔酶抑制试验结果
苦马豆素标准样品 ( A ) 和 结 晶 1 ( B ) 液 , 在紫
外灯 ( 2 5 4立泣 ) 下均未见荧光 , 空 白 可 见 较强荧
光 。 证明结晶 I与苦马豆素标准样品都对 a 一甘露糖
昔酶具有较强的抑制作用 。
J 6O
又( n m )
图 V 苦马豆素标准样品红外光谱图
1 9 9 2年第 4期
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图班 结晶 I红外光裔圈 O目加奋凡
6’ ” ” ; 玉 . 成 . _
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图顶 苦马豆素标准品高压液相色图谱
图正 结晶 I高压液相色谱图
泥(月川 )
图飞 苦马豆素标准品与结昌 I红外先谱图
— : 苦马豆素标品 一 。 一 : 结品 I
( 四 )绵羊实验性中毒结果 与自然发病羊在
血液生化指标变化 、 中毒症状及病理变化特征上 完
全相 同 , 出现症状后 的病羊停喂变异黄蔑 , 临床症
状逐渐消失 。 中毒症状均以消瘦 、 被毛粗乱 、 步态
强拘 、 头部水平颤动为特征 。 对血液生化指标的影
响 , 主要表现在碱性磷酸酶活性升高 、 血清谷草转
氨酶活性升高 ; 病理学变化以神经细胞及实质器官
细胞浆空泡变性为特征 。
讨论与结论
( 一 ) 对从变异黄蔑 ( 刃 . o a 时。翻 1 5 ) 中分离
的结晶 I 进行 a 一甘露糖昔酶 抑 制 试验 、 熔 点 测
定 、 元素分析 、 紫外与红外
光谱及液相色谱分析 , 并同
R
.
J
.
M ol y en 认 x 博 士 提 供 H O一
的 苦 马 豆 青 ( S w a l n s o 一
创 n e ) 标准品 比 较 , 证 明
结晶 I 就是叫垛兹定醇—苦马豆素 , 结构如右图所示 。 卿H 0
( 二 ) 绵羊变异黄蔑实验性中毒所表现的对血
液生化指标的影响、 临床症状及神经与实质器官组
织细胞的病理学损害 , 皆与自然中毒病羊相同 , 也
与 L . F . J a m e s 等国外所观察到的疯草中毒 和澳大
利亚的苦马豆中毒 , 以及 肖志 国等 ( 1 9 9 0 ) 国内报
道的棘豆草中毒极相似 。 曹光荣等已确定苦马豆素
是黄花棘豆和甘肃棘豆的主要有毒成分 。 由此亦可
证实苦 马豆素是变异黄茂的主要有毒成分 。
( 三 ) 从流行病学调查及实验性中毒发现 , 绵
羊变异黄蔑中毒的症状较黄花棘豆严重 , 死亡率也
高 。 据王生奎 ( 1 9 8 8 ) 试验 , 绵羊分别 饲 喂 变异
黄芭和黄花棘豆 , 第 17 天出现异常 , 第 30 天 相 继
出现 中毒症状 , 至第52 天全部出现 严重中毒 症状
时 , 变异黄茂组羊 已平 均 食入 48 . 87 k g , 棘豆 组
53
.
25 k g
。 前者比后者少食入 10 . 13 % , 但 症 状却
严重得多 。 另据曹光荣等测得黄花棘豆含苦马豆素
为 0 . 0 12 % , 而我们测得变 异 黄 茂 中 的 含 量 为
0
.
02 9%
。 显然 , 变异黄蔑中毒症状严重 且 死亡率
高 , 同其所含苦马豆素的量有直接关系。
( 四 ) L . F . J a m e s 等将有毒紫云英植物 分 成
3 类 , 即含硝基化合物黄蔑 、 聚硒黄蔑 和 疯 草黄
茂。 我们对变异黄茂全草作了硒含量测定 , 其含硒
仅为 。 . 4 p p m , 远低于 中毒水平 , 而其生长土壤含
硒 0 . 49 ~ 。 . 56 p p m , 证明变异黄茂不是聚硒植物 ,
故变异黄蔑中毒与硒无关 。 又据中毒临床表现和有
关资料 , 它也不含硝基化合物 。 这一切都支持本试
验结果 , 变异黄茂中毒属疯草中毒 。
( 五 ) 根据本试验中 ( 变异黄蔑分离的 ) 结品
I 红外光谱图出现的 2 8 5 0~ 2 7 5 o c m 一 1谱 带 , 与 苦
马豆素标品几重合 , 可判断为 B o hl m a n B a n d 。
说明样品存在 t r a n s C H 一 N的吸收 , 与苦马豆素的
两环结构相符合 , 也说明氮原子附近有反式氢与氮
上孤对电子存在 , 这与叫噪兹定 环 的 光 谱特征相
同 。 但是 , 从紫外 、 红外光谱图中 , 结晶 I 与标品
的谱峰还有许多小吸收峰不尽重合 , 提示其基本结
构上的某些官能团还有某种差异 , 并可能与其毒性
有关 , 有待于作质谱与核磁共振谱 以进一步确定其
6 巾兽医医药杂志 J TC 厂 M
分子结构。 另外 , 对结晶 I 还须进行鉴定分析 。
参 考 文 献
〔 1 〕周维经等 : 中国草原 , ( 1 ) : 7 5~ 7 6 , 1 9 8 4
〔 2 〕王生奎 : 绵羊实验性变异黄蔑和黄花棘豆中毒
的比较研究 ( 研究生论文 , 未发表 ) , 1 9 8 8
〔 3 〕曹光荣等 : 西北农业大学学报 , 17 ( 3 ) : 1
~ 7
,
1 9 8 9
〔 4 〕王凯等 : 畜牧兽医学报 , 2 1 ( 1 ) : 3 0~ 3 5 ,
1 9 9 0
〔 5 〕顾百群等 : 动物毒理学 , 5 ( 1 一 2 ) : 6 ~
1 0
,
1 9 9 0
t 6 〕肖志国等 : 甘肃畜牧兽医 , ( 3 ) : 5 ~ 7 ,
19 9 0
〔 7 〕 J a m e 。 , L . F . e t a l : P a t五. V o t 。 , ( 7 ) :
1 1 6~ 1 2 5
,
1 9 7 0
〔 s 〕 C o l e g a t e , S . M . o t a l : A u s t . J . C h e 皿 . ,
( 3 2 ) : 2 2 5 7~ 2 2 6 4
,
19 7 9
〔 9 〕 D a r l主n g , P . R . e 七 a l: B i o e h e m . J ,
( 19 1 )
:
6 4 9~ 6 5 1
,
1 9 8 2
〔1 0〕M o l e n e u x , R . J . e t a l : S e i e n e e , ( 2 1 6 ) :
1 9 0一 1 9 1 , 1 9 8 2
〔1 1〕 D a v i s , D . e t a l : P l a n t P h y s i o l . , ( 7 6 ) :
9 2 7wt 9 7 5
,
19 8 4
〔1 2〕T u l s i a n i , D . R . P . e t a l : A r e h i v e s o f
B i o e h e m i s t r y a 刀 d B i o P h y s i e s , 2 3 2 ( 1 ) :
7 6~ 8 5
,
1 9 8 4
( 1 9 9 2年 1 月 2 4 日收稿 )
奶牛隐性乳房炎综合防治试验
郁 杰 张志常 刘纯传 张礼华 哀永隆 潘 虎 侯奕 昭
杨玉英 李新固 李宏胜 方远穆
( 中国农业科学院中兽医研究所 兰州 了3 0 0 5 0 )
禹兴珍 周志锋 张富强 魏兰秀 成克文 王惠丰
( 兰州段家滩奶牛场 )
摘要 应 用奶牛乳房炎综合防治技术 , 对 360 头成年 乳牛进行 了 3 年试验观察 , 其结果 , 隐性
乳房炎 发病率由试验前的 3 7 . 5 6 %下降为 18 . 17 % , 与试验前 相比差异极显著 (P < 0 . 0 1) ; 临床型
乳房炎的发病率由试验前 的 1 9 . 5 6 %下降为 9 . 74 % , 与试验前相比差异极显著 ( P < 0 . 0 1) 。 此外 ,
还对泌 乳期 隐性 乳房炎进行 了有效疗法 的筛选试验 ,其中C D一 01 、 C D M 和青霉素均具有 良好 的治
疗效果 。
关键词 奶牛 ; 隐性 乳房炎 ; 综合防 治
乳房炎是当前威胁奶牛业发展 的 主 要疾病之
一 , 特别是隐性乳房炎 , 发展率高 , 危害性大 。 据
世界奶协统计 , 临床型乳房炎发病率占成年乳牛的
2 %
, 隐性乳房炎则达 48 % , 患病乳区 不 仅 产 奶
量下降 10 一 15 % , 而且耗费大量药品和人力 。 兰州
段家滩奶牛场建场早 , 乳房炎的发病率比较高 , 特
别是近儿年 , 由于乳房炎病原菌的耐药菌株增多 ,
其疗效日趋下降 , 使该场的经济受到严重损失 。 为
了减少该病的发生 , 提高生产效益 , 笔者在该场进
行了奶牛隐性乳房炎综合防治试验研究 , 现报道如
下 。
材料与方法
( 一 ) 药械
1
. 兰州乳房炎试验 ( L M T ) 包括 诊断液 、
检验盘 、 可调定量加液器 。
2
. 干奶安油剂 、 C D 一 01 、 C D M 、 当归 护乳
膏 , 上述药物由中国农业科学院中兽医研究所研制
提供 。
3
. 乳头 、 环境和挤奶器具所用 消毒液分别为
0
.
1%新洁而灭 、 来苏儿及碱水等。
4
.
S F 一 I 型氦氖激光治疗仪 , 系哈尔滨激光
技术研究所研制 。
( 二 ) 试验时间和地点 1 9 8 7年 5 月 ~ 1 9 9 0年
5 月 , 在兰州段家滩牛场 1 ~ 6 号牛舍 对 3 60 头成
年乳牛进行试验 。
( 三 ) 奶牛隐性乳房炎综合防治措施要求
1
. 加强 饲养管理 : 根据奶牛饲养管理规范 ,
对奶牛进行标准化饲养。 重点抓好以下 2 个环节 :
( 1 )保证饲草、 料和饮水质量 , 要求新鲜 、 清
洁 , 禁吃霉变饲料 。
( 2 )对牛群的管理应定岗负责 , 牛舍宽敞 、 通
风 , 运动场平坦 、 干燥 、 无杂物 、 排水 良好 。
2
. 重视清洁 卫生和 定期消毒 。