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厚荚相思花粉活力测定及贮藏研究



全 文 :书·研究报告·
收稿日期:2015-05-12
基金项目:国家“十二五”科技支撑计划项目(编号:2012BAD 01B
0402)。
作者简介:詹 妮(1990—),女,天津塘沽人;在读硕士研究生,研究方
向:相思育种;E-mail:jennyzn1122@163.com。
通迅作者:黄烈健,副研究员;E-mail:13802987948@163.com。
厚荚相思花粉活力测定及贮藏研究
詹 妮, 黄烈健
(中国林业科学研究院热带林业研究所, 广东 广州510520)
摘 要:开展花粉的活力测定及贮藏研究,对进一步开展相关树种的杂交育种研究具有重要意义。关于厚荚相思
(Acacia crassicarpa)的花粉活力测定及贮藏研究,却没有见报道。本试验通过对厚荚相思花粉开展不同活力测定方法
的比较、花粉管萌发法的最佳条件的筛选以及花粉贮藏一定时间的活力测定等系列研究,建立了厚荚相思花粉有效的活
力测定方法和最佳技术体系,以及有效的贮藏方法,为今后进一步开展厚荚相思的杂交育种以及通过人工控制授粉创制
新的育种材料等奠定重要的基础。
关键词: 厚荚相思;花粉;活力;测定;贮藏
DOI编码: 10.16590/j.cnki.1001-4705.2015.11.001
中图分类号: S 944.42   文献标志码: A   文章编号: 1001-4705(2015)11-0001-04
Storing and Viability Testing of Acacia crassicarpaPolen
ZHAN Ni,HUANG Liejian
(Research Institute of Tropical Forestry,CAF,Guangzhou Guangdong 510520,China)
Abstract:It has important significance to study on the polen viability determination and storage on the
cross breeding research for related species.No any reports have been reported about polen viability
determination and storage of Acacia crassicarpa.In this paper,through the comparison of polen tube
method for the determination of optimum conditions,to carry out the different activity of A.crassicar-
papolen germination and polen storage method of screening for a certain period of time the activity
series of research,has established the A.crassicarpapolen effective activity determination method and
the best technology system,and the effective method of storage,for further development of
A.crassicarpahybrid breeding and laid an important foundation by artificial polination in develop-
ment of breeding.
Key words: Acacia crassicarpa;polen;viability;testing;storing
  开展花粉的活力测定及贮藏研究,对进一步开展
相关树种的杂交育种研究具有重要意义。林木的杂交
育种研究中,花期不遇是经常碰到的现象;根据育种目
标需要,长距离运输花粉也是常有的事情。这些问题
的存在,决定了进行相关树种杂交育种研究工作时,开
展其花粉活力测定及贮藏等研究就显得非常重要。
关于花粉活力测定及贮藏等相关研究已有较多报
道。黄烈健等对林木花粉保存及活力测定进行了较为
详细的综述[1]。张东旭等对罗汉松(Podocarpus mac-
rophyllus)和五针松(Pinus parviflora)体外花粉萌
发进行研究,发现罗汉松花粉最佳培养温度为30℃,
五针松花粉最佳培养温度为25℃[2]。赵剑颖等对万
寿菊(Tagetes erecta L.)花粉的活力检测进行研究,
发现其最佳贮藏条件为在4℃干燥贮藏[3]。刘玉玲等
对杜鹃红山茶(Camellia azalea)花粉进行研究,发现
在2.5%琼脂+10%蔗糖的培养基上其花粉发芽率最
高[4]。ZHOU Li等对丁香(Syringa)花粉的保存条件
及活力检测进行了相关研究[5]。但关于厚荚相思
(Acacia crassicarpa)的花粉活力测定及贮藏研究,却
没有见报道。本试验通过对厚荚相思花粉开展不同活
力测定方法的比较、花粉管萌发法的最佳条件的筛选
以及花粉贮藏一定时间的活力测定等系列研究,建立
了厚荚相思花粉有效的活力测定方法和最佳技术体
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研究报告  詹 妮 等:厚荚相思花粉活力测定及贮藏研究
系,以及有效的贮藏方法,为今后进一步开展厚荚相思
的杂交育种以及通过人工控制授粉创制新的育种材料
等奠定重要的基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
厚荚相思花粉采自厚荚相思种子园,位于广东省
江门市新会区国家重点相思良种基地。
1.2 花粉采集
于11月中旬至12月底,厚荚相思集中开花时间,
在09:00时之前,采集当天开放的花穗,带回室内阴
干,于次日10:00时后花药大量爆裂时收集花粉,用毛
笔反复轻刷花穗5~6次,并用200目花粉筛过筛,装
入加有干燥硅胶的小玻璃瓶中,盖上盖,抽真空待用。
1.3 花粉活力测定
为了分析比较厚荚相思不同单株间花粉的活力差
异,采用染色法检测了3个单株新鲜采集的花粉活力。
1.3.1 I2-KI染色法
将1g KI溶于10mL蒸馏水中,加入0.5g I2 待
其全部溶解后,加蒸馏水至200mL,配好试剂后,贮于
棕色瓶中备用。取收集好待用的厚荚相思花粉置于载
玻片上,滴加1~2滴配好的I2-KI溶液,1~2min后,
在显微镜下观察统计。每个载玻片分别取3个视野,
被染成蓝紫色的为活力较强的花粉粒,呈黄褐色为发
育不良的花粉粒,无色的为死亡花粉粒。
  花粉活力(%)=平均每视野染色的花粉数/平均
每视野花粉数×100%。
1.3.2 过氧化物酶染色法
取0.5g联苯胺溶于100mL 50%乙醇中,配成
0.5%联苯胺溶液;取0.5gɑ-萘酚溶于100mL 50%
乙醇中,配成0.5%ɑ-萘酚溶液;取0.25g碳酸钠溶于
100mL蒸馏水中,配0.25%碳酸钠溶液。将上述溶
液各取10mL混合均匀配成试剂1,放于棕色瓶中。
载玻片上放少量厚荚相思花粉,加试剂1和0.3%过
氧化氢各1滴,搅匀后盖上盖玻片,放入30℃恒温箱
中30min后,在显微镜下观察统计。每个载玻片分别
取3个视野,花粉粒为深红色则表示有活力;如无色,
则表示已失去活力。
1.3.3 花粉管体外萌发法
1)花粉管体外萌发条件优化:蔗糖浓度设5%、
10%、15%、20%、25%、30%共6个水平,硼酸浓度设
100,200,300mg/L共3个水平,培养温度设22,24,
26,28,30℃共5个温度,以筛选出厚荚相思花粉体外
萌发的最佳培养条件。每个载玻片上取2个视野,取
平均值计算,3个重复。在显微镜下观察统计培养3,
6,9,12,24h时萌发的花粉数量,以花粉管长度大于花
粉粒1倍以上为标准。
  花粉活力(%)=平均每视野萌发的花粉数/平均
每视野花粉数×100%。
1.4 花粉贮藏及检测
将收集好的花粉置于小玻璃瓶中,加入干燥变色
硅胶,抽真空,蜡封,将封好的花粉置于室温、5℃、
-25℃下贮藏1周、1月后,采用1.3.3筛选出的最佳
条件进行活力检测。
1.5 数据分析
数据分析采用软件SPSS 19.0进行。
2 结果与分析
2.1 花粉采集效果检测
11月中旬至12月底,厚荚相思集中开花时间在
09:00时之前,采集当天开放的花穗,置于室内阴干,
于次日10:00时后花药大量爆裂时收集花粉,用毛笔
反复轻刷花穗5~6次,并用200目花粉筛过筛,装入
加有干燥硅胶的小玻璃瓶中,用牙签挑取少许弹在载
玻片上,在显微镜下观察花粉采集效果(见图1)。从图
1可以看出,采集的花粉数量大、纯度高,表明该方法能
够有效地进行厚荚相思花粉的采集,能用于后续研究。
图1 采集的厚荚相思花粉显微镜检测
2.2 体外萌发法的花粉活力随培养时间的变化
  从图2、图3、图4可以看出,体外萌发法检测厚荚
相思花粉活力时,不同贮藏温度、不同贮藏时间,随培
养时间的增加,均表现为逐渐上升的趋势,培养24h
之后,趋于稳定。因此,以下的研究结果均采用培养
24h的数据进行分析。
2.3 花粉活力检测
2.3.1 染色法检测结果
为了研究不同单株间的花粉,其活力是否有差异,
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第34卷 第11期 2015年11月             种 子 (Seed)           Vol.34 No.11 Nov. 2015
采用I2-KI法和过氧化物酶法分别检测了3个单株花
粉的活力,结果见表1。从表1可以看出,2种方法检
测的花粉活力非常接近,且均无差异。说明厚荚相思
不同单株间的花粉,其活力没有显著差异。
图2 采集当天厚荚相思花粉活力随培养时间变化
图3 贮藏1周厚荚相思花粉活力随培养时间变化
图4 贮藏1月厚荚相思花粉活力随培养时间变化
表1 染色法检测厚荚相思不同单株的花粉活力结果
单株编号 I2-KI法(%) 过氧化物酶法(%)
1  98.74  98.12
2  97.98  95.41
3  97.53  94.68
2.3.2 花粉管体外萌发法条件优化
根据2.2.1的结果,厚荚相思不同单株间的花粉
活力无显著差异,故进行花粉管体外萌发法条件优化
及贮藏研究时,只采用1株的花粉。
1)不同培养温度:从表2可以看出,不同培养温
度对厚荚相思花粉体外萌发法的活力影响较大,24℃
的效果最好,与其它的温度处理差异达到极显著;
22℃的效果次之,与另外3个温度处理的差异也达到
极显著;26,28,30℃的效果均较差,且这3个处理间
无显著差异。
表2 不同培养温度体外萌发法检测厚荚相思花粉活力结果
培养温度
22℃ 24℃ 26℃ 28℃ 30℃
花粉活力
(%) 40.25B 64.28A 22.32C 24.26C 23.63C
  注:表中大写字母表示显著水平p=0.01。下同。
  2)不同蔗糖浓度:从表3可以看出,不同蔗糖浓
度对厚荚相思花粉体外萌发法的活力影响在较低浓度
时(5%~20%)没有显著差异,与较高浓度(25%、
30%)之间的差异达到极显著;15%的蔗糖是厚荚相思
花粉体外萌发法的最佳浓度处理。
表3 不同蔗糖浓度体外萌发法检测厚荚相思花粉活力结果
蔗糖浓度
5% 10% 15% 20% 25% 30%
花粉活力
(%) 39.94A45.41A49.87A38.32A16.50B19.66B
  3)不同硼酸浓度:从表4可以看出,不同硼酸浓
度对厚荚相思花粉体外萌发法的活力影响无显著差
异。考虑到节约的原则,后续研究采用100mg/L的
硼酸浓度进行分析测定。
表4 不同硼酸浓度体外萌发法检测厚荚相思花粉活力结果
硼酸浓度
100mg/L  200mg/L  300mg/L
花粉活力(%) 41.62  43.30  39.63
2.3.3 贮藏不同时间的花粉活力检测
综合上述研究结果,体外萌发法检测厚荚相思花
粉活力的最佳条件为:培养温度24℃、蔗糖浓度
15%、硼酸浓度100mg/L。采用最佳条件对采集当
天、贮藏1周、贮藏1月的厚荚相思花粉进行活力检
测,同时也进行染色法检测,结果见表5。
表5 染色法和体外萌发法检测不同贮藏温度、
不同贮藏时间的厚荚相思花粉活力结果
贮藏时间 贮藏温度 I2-IK法(%)
过氧化物酶法
(%)
体外萌发法
(%)
采集当天  — 98.08  96.07  93.77
 -20℃ 95.78  91.16  24.68
1周  5℃ 92.03  82.17  16.39
 室温 88.56  79.81  15.24
 -20℃ 91.14  92.20  69.89
1月  5℃ 91.78  89.50  31.06
 室温 91.68  92.16  17.81
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研究报告  詹 妮 等:厚荚相思花粉活力测定及贮藏研究
  从表5可以看出,在采集当天,染色法和体外萌发
法检测的厚荚相思花粉活力均很高,均在90%以上。
贮藏1周、1月之后,染色法检测的花粉活力仍然很
高;但体外萌发法检测的花粉活力,在贮藏1周时下降
非常明显,贮藏 1 月后花粉活力又有所上升,以
-20℃贮藏的花粉活力较高,为69.89%。
3 结论与讨论
相思类树种的花都很小,花粉更小,花粉收集通常
很困难。K kato等[6]报道,采用试管成功收集大叶相
思(Acacia auriculiformis)以及马占相思(Acacia
mangium)的花粉,并进行了花粉活力的检测分析。
但该方法进行花粉收集的时间非常短暂,仅在开始散
粉(10:00时左右)后的10min内才能有效收集到花
粉,而且收集到的花粉数量也十分有限,不利于后期的
人工控制授粉研究。根据李军等[7]对大叶相思、黄烈
健等[8]对马占相思的开花生物学研究结果,笔者对厚
荚相思的开花生物学特征也进行了详细观察,厚荚相
思在开花当天的10:00时左右散粉,根据这一特点,
09:00时之前采集当天开花的新鲜花序,带回室内阴
干,于次日10:00时后花药大量爆裂时收集花粉,用毛
笔反复轻刷花穗5~6次,并用200目花粉筛过筛,成
功采集大量花粉。这一方法十分简便,采集的花粉具
有较高的活力,而且能收集到大量的花粉,有利于贮藏
以及后期的人工控制授粉等研究。
  K Kato等[9]对马占相思、大叶相思不同种源、无
性系及单株间的花粉活力进行研究,结果表明:马占相
思、大叶相思花粉活力在不同无性系间均具有显著差
异。本研究通过染色法对3株厚荚相思花粉活力检测
的结果表明:厚荚相思不同单株间,花粉活力无显著差
异,与马占相思和大叶相思的花粉具有不同表现。
  不同树种的花粉,体外萌发法检测活力时,所需要
的条件不同,应根据研究对象的不同进行相应条件的
优化。厚荚相思的花粉体外萌发法检测分析尚未见报
道。本研究通过对影响厚荚相思花粉体外萌发的几个
主要条件进行优化,成功建立了厚荚相思花粉体外萌
发的体系:培养温度为24℃、蔗糖浓度为15%、硼酸
浓度为100mg/L,并利用该技术体系分析检测了不同
贮藏温度、不同贮藏时间的厚荚相思花粉活力。厚荚
相思花粉较为有效的贮藏温度为-20℃,贮藏1月,
花粉的活力仍能保持较高(69.89%)。研究结果对今
后开展厚荚相思花粉贮藏及控制授粉具有重要的意
义。据报道,采用染色法检测分析花粉的活力,其数值
通常较高,不能真实反应花粉的活力状况[10]。其原因
是:染色法有时也能使衰老和死亡的花粉着色,有胞质
的花粉粒并不一定具有受精能力,且未成熟和败育花
粉也可正常着色,使花粉的活力估计偏高。在本研究
中,采集当天的厚荚相思花粉,染色法和体外萌发法检
测的活力均很高,均在90%以上,数值较为接近。而
贮藏1周、1月之后,染色法检测的花粉活力仍然很
高;但体外萌发法检测的花粉活力,在贮藏1周时下降
非常明显,贮藏 1 月后花粉活力又有所上升,以
-20℃贮藏的花粉活力较高,为69.89%。本研究结
果也证实了染色法检测花粉活力,其数值比体外萌发
法的高,不能反映花粉活力的真实状况。因此,建议在
进行花粉的活力检测分析时,应尽量采用体外萌发法。
K Kato等[9]研究表明:马占相思和大叶相思的花
粉,其活力在采集当天最高,贮藏180d后表现下降,贮
藏360d后又有所上升;因此,建议采用贮藏花粉进行授
粉时,应根据所检测的花粉活力情况来开展授粉工作,
如果花粉活力较低则需要对更多的花进行授粉,以保证
获得足够数量的种子用于后续研究。本研究中,厚荚相
思的花粉也表现为采集当天的活力最高,贮藏1周后有
所下降,贮藏1月又有所上升,与K Kato等[9]对马占相
思和大叶相思的花粉的研究结果具有类似现象。
参考文献:
[1]黄烈健,詹妮.林木花粉采集、保存及活力检测的研究进展
[J].广东林业科技,2014,30(6):77-80.
[2]张东旭,周凤,刘丽敏,等.罗汉松和五针松体外花粉萌发及
花粉管生长研究[J].山西农业大学学报(自然科学版),
2010,30(3):223-227.
[3]赵剑颖,张华丽,张西西,等.万寿菊花粉活力及柱头可授性
研究[J].中国农学通报,2012,28(19):159-163.
[4]刘玉玲,潘文,张方秋,徐,等.杜鹃红山茶花粉保存及其生
活力测定[J].广东林业科技,2010,26(2):1-6.
[5]ZHOU Li,LUO Feng-xia,DAI Li-min,et al.Vitality and
storage condition of Syringapolen[J].Journal of Forestry
Research,2003,14(1):67-70.
[6]K kato,S Yamaguchi,O Chigira,et al.Tube polination u-
sing stored polen for creating Acacia auriculiformis hy-
brids[J].Journal of Tropical Forest Science,2012,24(2):
209-216.
[7]李军,黄烈健,陈祖旭,等.大叶相思花部形态与开花生物学
研究[J].热带亚热带植物学报,2010,18(4):379-385.
[8]黄烈健,詹妮,李军.马占相思开花生物学特征研究[J].林
业科学研究,2014,27(1):45-52.
[9]K Kato,S Yamaguchi,O Chigira,et al.Flowering phenology and
germination ability of polens for Acacia mangiumand A.auricu-
liformis[J].Silvea Genetica,2012,61(6):228-236.
[10]S Khatun,T J Flowers.The estimation of polen viability in rice
[J].Journal of Experimental Botany,1995,46(1):151-154.
·4·
第34卷 第11期 2015年11月             种 子 (Seed)           Vol.34 No.11 Nov. 2015