全 文 ： 2012, Vol. 33, No. 02 食品科学 ※分析检测224
HPLC-ELSD法同时测定连翘叶中
齐墩果酸和熊果酸
赵韶华，刘敏彦，王玉峰，许红辉，张永锋，王 猛
(石家庄以岭药业股份有限公司，河北 石家庄 050035)
摘 要：目的：建立高效液相色谱 -蒸发光散射检测法(high performance liquid chromatography -evaporative light
scattering detector，HPLC-ELSD)法同时测定连翘叶中齐墩果酸和熊果酸。方法：色谱柱：Waters Symmetry C18(4.6mm×
250mm，5μm)；柱温 25℃，流动相：甲醇 -0.4%冰醋酸溶液(93:7，V /V )，流速 0.4mL/min；蒸发光散射检测
器检测条件：漂移管温度 8 0℃，气体压力 2 5 p s i。结果：齐墩果酸在 0 . 1 0 7～2.136μg范围内线性关系良好
(r=0.9991)，熊果酸在 0.179～3.584μg范围内线性关系良好(r=0.9993)；齐墩果酸和熊果酸的回收率分别为 98.67%和
9 8 . 5 6 %。结论：此方法简便、准确，重现性良好，为评价连翘叶的质量提供可靠的分析方法。
关键词：连翘叶；高效液相色谱 -蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)；齐墩果酸；熊果酸
Simultaneous Determination of Oleanolic Acid and Ursolic Acid in the Leaves of
Forsythia suspensa by HPLC-ELSD
ZHAO Shao-hua，LIU Min-yan，WANG Yu-feng，XU Hong-hui，ZHANG Yong-feng，WANG Meng
(Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co. Ltd., Shijiazhuang 050035, China)
Abstract ：Objective: To establish an high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector (HPLC-
ELSD) method for the simultaneous determination of oleanolic acid and ursolic acid in the leaves of Forsythia suspensa. Methods:
The chromatographic separation was carried out on a Waters Symmetry C18 column (4.6 mm× 250 mm, 5 μm) with a mobile phase
composed of methanol and 0.4% acetic acid (93:7, V/V) at a flow rate of 0.4 mL/min. An evaporative light scattering detector was
used to detect oleanolic acid and ursolic acid with a drift tube temperature of 80 ℃ and a gas pressure of 25 psi. Results: Both the
developed calibration curves of oleanolic acid and ursolic acid revealed a good linear relationship over the ranges of 0.107－2.136
μg (r = 0.9991) and 0.179－3.584μg (r = 0.9993), respectively. The recovery rates of oleanolic acid and ursolic acid were 98.67%
and 98.56%, respectively. Conclusion: A simple, accurate and credible HPLC-ELSD method has been developed, which is suitable
for the quality contro1 of the leaves of Forsythia suspensa.
Key words：leaves of Forsythia suspensa；high performance liquid chromatography -evaporative light scattering detector
(HPLC-ELSD)；oleanolic acid；ursolic acid
中图分类号：R282.71 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2012)02-0224-03
收稿日期：2011-01-12
基金项目：国家科技重大专项(2009ZX09313-003)
作者简介：赵韶华(1966—)，男，高级工程师，主要从事中药新制剂的开发与应用研究。E-mail：zhaoshaohua66@163.com
连翘为木犀科植物连翘[Forsythia suspense (Thunb.)
Vahl]的干燥果实，具有清热解毒，消痈散结，疏散风
热的功效[ 1 ]。连翘中主要含有木脂素类、黄酮类、苯
乙醇及其苷类、C 6～C 2 天然醇、三萜类、单萜类等化
学成分[2]。连翘叶是连翘植物的干燥叶，具有与连翘相
同的化学成分，并且有些成分含量还高于连翘，如木
脂素、咖啡糖酰苷[ 3 ]。在我国河北、河南、山西、陕
西等地，民间常采集连翘嫩叶，经加工制作成保健茶
饮用，有较好的保健价值。现代药理研究发现，连翘
叶提取物有抗菌、降脂保肝、抗氧化、抗衰老、抗
疲劳等作用[4-10]。文献[11-13]对连翘叶中苷类成分的提取
工艺，不同采收期连翘叶中连翘苷、连翘酯苷和芦丁
的含量，以及连翘叶的干燥方法已有报道，但对连翘
叶中齐墩果酸和熊果酸的研究未见报道。齐墩果酸和熊
果酸为五环三萜类化合物，齐墩果酸具有保肝、解肝
毒作用，对四氯化碳诱导的肝损伤有保护作用，可明
显降低谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活性[14]；熊果酸具有
免疫调节作用及较好的抗肿瘤活性，对肿瘤形成各阶段
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都有预防和抑制作用[15-16]。为了开发利用连翘叶这一天然
资源，本实验采用高效液相色谱 -蒸发光散射检测法(high
performance liquid chromatography-evaporative light scattering
detector，HPLC-ELSD)法对连翘叶中齐墩果酸和熊果酸含
量进行测定，为有效控制连翘叶的质量提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
连翘叶，河北井径县采集，经河北省药品检验所
孙宝惠鉴定。
齐墩果酸对照品(批号：110709-200505)、熊果酸对
照品(批号：110742-200517) 中国食品药品检定研究院；
甲醇(色谱纯) 美国 Fisher公司；水为双蒸馏水，其他
试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
2695 Separations Module高效液相色谱仪[配有Wa-
ters 2424型蒸发光散射检测器] 美国Waters公司；KQ-
250B超声波清洗器(250W) 昆州市超声仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 色谱条件
色谱柱：Waters Symmetry C18(4.6mm× 250mm，5
μm)；柱温：25℃，流动相：甲醇 -0 .4% 冰醋酸溶液
(93:7，V/V)，流速：0.4mL/min；蒸发光散射检测器检
测条件：漂移管温度 80℃，气体压力 25ps i。齐墩果
酸和熊果酸达到良好的分离。理论板数熊果酸和齐墩果
酸峰均不得低于 5000。
1.3.2 供试品溶液的制备
取连翘叶于 60℃干燥 8h，粉碎成细粉，取约 0.5g，
精密称定，置 5 0 m L 具塞三角瓶中，精密加入甲醇
25mL，密塞，称质量，超声提取 40min(功率 250W，
频率 40kH z )，放冷，称量，用甲醇补足减失的质量，
过滤，取续滤液，用 0 . 4 5μm 微孔滤膜过滤，即得。
1.3.3 对照品溶液的制备
精密称取齐墩果酸对照品和熊果酸对照品适量，
置 50mL量瓶中，加无水乙醇制成每 1mL约含齐墩果酸
0.11mg和熊果酸 0.18mg的溶液，即得。
2 结果与分析
2.1 线性关系考察
精密吸取齐墩果酸和熊果酸对照品溶液 1、2、5、
10、15、20μL，注入高效液相色谱仪中，进行测定。
以进样量的自然对数为横坐标、峰面积积分值的自然对
数为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，齐墩果酸在
0.107～2.136μg范围内呈良好线性关系，其进样量与峰
面积积分值自然对数回归方程为 lny=1.669lnx+15.591，
r=0.9991。熊果酸在 0.179～3.584μg范围内呈良好线性
关系，其进样量与峰面积积分值自然对数回归方程为：
lny=1.660lnx+15.651，r=0.9993。
2.2 精密度实验和稳定性实验
精密吸取齐墩果酸和熊果酸对照品溶液 10μL，分
别连续进样 5次，测定峰面积，结果齐墩果酸峰面积的
RSD为 2.43%，熊果酸峰面积的RSD为 2.69%，表明仪
器精密度良好。
精密吸取同一供试品溶液，分别于 0、2、4、8、
12h进样测定峰面积，结果在测定的 12h内，齐墩果酸
峰面积RSD为 2.56%，熊果酸峰面积RSD为 2.79%，表
明供试品溶液在 12h内基本稳定。
2.3 重现性实验
分别取同一份连翘叶样品高、中、低 3个剂量(0.3、
0.5、0.7)，每个剂量 3份，按供试品溶液的制备方法，分
别进行超声提取，过滤，各精密吸取 10μL注入液相色谱
仪测定，结果齐墩果酸的 RSD为 2.32%，熊果酸的RSD
为 2 .58%，表明方法的重现性良好。
2.4 回收率实验
采用加样回收实验方法，取同一连翘叶样品，9份，
分别加入低、中、高 3 个水平的齐墩果酸对照品和熊果
酸对照品溶液，按供试品溶液的制备方法，分别进行超
声提取，过滤，各精密吸取 10μL注入液相色谱仪测定，
计算回收率。齐墩果酸的平均回收率为 98.67%(n=9)，
RSD为 2.21%，熊果酸的平均回收率为 98.56%(n=9)，RSD
为 1 .64%，说明方法准确度良好。结果见表 1、2。
序号
取样 对照品加 样品中含齐墩 总测得 回收 平均回
RSD/%量 /g 入量 /mg 果酸的量 /mg 量 /mg 率/% 收率/%
1 0.2515 0.6810 1.1055 1.7647 96.80
2 0.2523 0.6810 1.1090 1.7765 98.02
3 0.2556 0.6810 1.1236 1.7958 98.71
4 0.2496 1.1350 1.0972 2.2168 98.64
5 0.2585 1.1350 1.1363 2.2476 97.91 98.67 2.21
6 0.2467 1.1350 1.0844 2.2542 103.1
7 0.2465 1.5890 1.0836 2.6235 96.91
8 0.2526 1.5890 1.1104 2.6464 96.66
9 0.2486 1.5890 1.0928 2.7024 101.3
表 1 齐墩果酸回收率实验测定结果
Table 1 Recovery rates of oleanolic acid from spiked samples
序号
取样 对照品加入 样品中含熊果 总测得 回收 平均回
RSD/%量/g 量 /mg 酸的量 /mg 量 /mg 率/% 收率/%
1 0.2515 1.3896 2.3008 3.6675 98.35
2 0.2523 1.3896 2.3081 3.7023 100.3
3 0.2556 1.3896 2.3383 3.6749 96.19
4 0.2496 2.3160 2.2834 4.5834 99.31
5 0.2585 2.3160 2.3649 4.6034 96.65 98.56 1.64
6 0.2467 2.3160 2.2569 4.6011 101.2
7 0.2465 3.2424 2.2551 5.4563 98.73
8 0.2526 3.2424 2.3109 5.4832 97.84
9 0.2486 3.2424 2.2743 5.4645 98.39
表 2 熊果酸回收率实验测定结果
Table 2 Eecovery rates of ursolic acid from spiked samples
2012, Vol. 33, No. 02 食品科学 ※分析检测226
2.5 样品测定
取不同批次的连翘叶样品，按供试品溶液的制备方
法进行超声提取，过滤，各精密吸取 10μL注入液相色
谱仪测定，记录色谱图(图 1)，计算齐墩果酸和熊果酸
的含量，结果见表 3。
A.混合对照品溶液；B .连翘叶样品。
图 1 混合对照品溶液和连翘叶样品色谱图
Fig.1 HPLC chromatogram of mixed standards and extract from
Forsythia suspense leaves
400
200
0
齐
墩
果
酸
L
S
U
时间 /min
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
熊
果
酸
A
400
200
0
L
S
U
时间 /min
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
B
齐
墩
果
酸
熊
果
酸
样品 采集时间 齐墩果酸含量 /(mg/g) 熊果酸含量 /(mg/g)
1 2010.6.3 4.3957 9.1484
2 2010.6.11 4.4483 9.7260
3 2010.6.27 4.2957 8.9378
表 3 连翘叶样品测定结果
Table 3 Results of determination of samples of Forsythia suspense leaves
3 讨 论
供试品溶液的制备方法，常采用回流提取和超声提
取的方法。本实验采用甲醇为提取溶剂，对回流提取
时间和超声提取时间分别进行考察，结果显示超声提取
40min提取率最高，回收率实验结果表明此方法准确度
较好。齐墩果酸和熊果酸均为五环三萜类化合物，两
者性质相似，不易分离，因此对流动相进行选择，采
用甲醇 -乙腈 -0.5%冰醋酸溶液、甲醇 -0.4%冰醋酸溶液、
甲醇 -0.1%磷酸溶液体系进行对比实验，选择了以甲醇 -
0.4%冰醋酸溶液作为流动相，通过调整比例和流速，最
终选择甲醇 -0.4%冰醋酸溶液(93:7，V/V)作为流动相，
流速 0.4mL/min，使齐墩果酸和熊果酸达到基线分离。
另外，课题组也曾对连翘果实中齐墩果酸和熊果酸
的含量进行过研究，结果发现连翘果实中齐墩果酸和熊
果酸的含量与叶中正好相反，在连翘叶中熊果酸的含量
高于齐墩果酸的含量，而连翘果实中齐墩果酸的含量则
高于熊果酸的含量。引起这种差异原因可能是由于药用
部位的不同，也可能是由于实验样品采集的并非同一株
植物上而造成的，其真正的原因还有待进一步研究。齐
墩果酸保肝作用较显著，而熊果酸抗癌活性较强，研
究连翘果实和叶中齐墩果酸和熊果酸含量的差别，可能
为解释各自的药理作用，为临床用药提供科学的依据。
参 考 文 献 ：
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