全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 22 期 2013 年 11 月

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HPLC-MS/MS 法测定不同采收期连翘叶中 9 种成分
支旭然，苑 霖，生 宁，张志勇，张晓旭，贾佩佩，张兰桐*
河北医科大学药学院 药物分析教研室，河北 石家庄 050017
摘 要：目的 建立 HPLC-MS/MS 法同时测定连翘叶中连翘苷、连翘脂素、连翘酯苷 A、连翘酯苷 F、芦丁、槲皮素、异槲
皮苷、绿原酸、(＋)-表松脂素-4′-O-葡萄糖苷的量。方法 采用 Dikma Diamonsil C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱温
30 ℃，以甲醇-0.02%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，体积流量 0.8 mL/min，进样量 10 μL；采用电喷雾离子源进行负离子
模式监测，多反应监测模式（MRM）用于定量分析，源喷射电压为−4 500 V，离子源温度为 650 ℃。结果 9 种化学成分的峰
面积和浓度在测定浓度范围内均具有良好的线性关系，加样回收率为 97.20%～101.2%，精密度 RSD 为 0.54%～1.24%。结论 本
法简便快速、灵敏度高、专属性好，可用于连翘叶中 9 种活性成分的测定。通过对结果进行分析，连翘叶以 5 月份采收最佳。
关键词：连翘叶；HPLC-MS；连翘苷；连翘酯苷；连翘脂素
中图分类号：R286.02 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)22 - 3231 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.22.024
Determination of nine components in Forsythia Folium collected in different periods
ZHI Xu-ran, YUAN Lin, SHENG Ning, ZHANG Zhi-yong, ZHANG Xiao-xu, JIA Pei-pei, ZHANG Lan-tong
Department of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmacy, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China
Abstract: Objective To develop an HPLC-MS method for the determination of phillyrin, phillygenin, forsythiaside A, forsythiaside
F, rutin, quercetin, isoquercitrin, chlorogenic acid, and (+)-epipinoresinol-4′-O-glucoside in Forsythia Folium. Methods The samples
were separated on a Dikma Diamonsil C18 column (150 mm × 4.6 mm, 5 μm), eluted with methanol and water containing 0.02% formic
acid in a gradient elution at a flow rate of 0.8 mL/min, and the injection volume was 10 μL. The column temperature was set at 30 . ℃
The multiple-reaction monitoring scanning was employed for the quantification with switching electrospray ion source polarity in
negative mode. The ion spray voltage was set at −4 500 V and the turbo spray temperature was maintained at 650 ℃. Results The
regression equations showing linear relationships between peak areas and contents of each compound were obtained. The average
recoveries of the compounds ranged from 97.20% to 101.2% and the precision in terms of RSD was in the range of 0.54%—1.24%.
Conclusion The method is sensitive and suitable for the determination of the nine components in Forsythia Folium. As a result, the
suitable harvesting time for Forsythia Folium is May.
Key words: Forsythia Folium; HPLC-MS; phillyrin; forsythiaside; phillygenin

连翘为木犀科 Oleaceae 连翘属 Forsythia Vahl 植
物连翘 Forsythia suspense (Thunb.) Vahl 的干燥果实，
具有清热解毒，散结消肿的功效[1]，主要有挥发油类，
连翘酯苷 A、连翘酯苷 F 等苯乙醇苷类、连翘苷、连
翘脂素、(＋)-表松脂素-4′-O-葡萄糖苷等木脂素类，
芦丁、槲皮素、异槲皮苷等黄酮类和绿原酸等成分
[2-6]。连翘多为野生，资源有限，连翘叶 Forsythia
Folium 是连翘植物的干燥叶，具有与连翘基本相同的
化学成分[5]，连翘叶资源丰富，在我国河南、河北、
山西、陕西等地，认为其具有良好的医用保健价值，
民间常用连翘嫩叶经加工制成保健茶饮用。现代药理
研究证实，连翘叶具有保肝、保护心脏、抗菌、抗氧
化及抗衰老的作用[6-12]。为了确定连翘叶合适的采收
期，本实验首次采用 HPLC-MS/MS 技术对 14 个不同
采收期的连翘叶中 9 个主要成分进行测定，期望对连
翘叶资源的开发利用提供一定的科学依据。

收稿日期：2013-05-23
基金项目：河北省自然科学基金-石药集团医药联合研究基金（优先资助项目）（H2012206079）
作者简介：支旭然（1988—），女，硕士研究生，从事中药质量控制与药代动力学研究。Tel: 15533930409 E-mail: zhixuran@163.com
*通信作者 张兰桐 Tel: (0311)86266419 E-mail: zhanglantong@263.net
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 22 期 2013 年 11 月

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1 仪器与试药
Agilent1200 高效液相色谱仪，配有在线脱气
机，四元泵，自动进样器（美国 Agilent 公司）；3200Q
TRAP 型三重四级杆线性离子阱质谱仪，配有 ESI
离子源（美国 AB 公司）；Analyst 1.5.2 software 数
据系统（美国 AB 公司）；SCQ—200 超声波清洗器
（100 W，25 kH）（上海声谱超声波设备厂）；BP211D
型十万分之一天平（德国 Sartorius 公司）。
对照品连翘苷（批号 0821-200104）、槲皮素（批
号 100081-200406）、芦丁（批号 100080-200707）
均购自中国食品药品检定研究院；连翘脂素（批号
20120925）、连翘酯苷 A（批号 20120518）、绿原酸
（批号 20121117）均购自上海源叶生物科技有限公
司，质量分数大于 98% ；异槲皮苷（批号
ZL54745YHP）购买于南京泽朗植提有限公司；连
翘酯苷 F、(＋)-表松脂素-4′-O-葡萄糖苷均由北京大
学生药学教研室提供，质量分数大于 98%。甲醇为
色谱纯（美国 J. T. Baker 公司）；水为纯净水（杭州
娃哈哈集团有限公司）；其他试剂均为分析纯；2011
年 5 月～11 月的连翘 Forsythia suspense (Thunb.)
Vahl 叶均采自河北省井陉县洞阳坡，由河北医科大
学药学院生药学教研室李连怀副教授鉴定。
2 方法与结果
2.1 色谱-质谱条件
2.1.1 色谱条件 色谱柱 DiamonsilTM C18 柱（150
mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇（A）-水（B）
（含有 0.02%的甲酸），梯度洗脱（0～4 min，25%～
65% A；4～8 min，65%～95% A；8～10 min，95%
A），进样前用流动相初始条件平衡 6 min；体积流
量 0.8 mL/min；柱温 30 ℃；进样量 10 μL。对照品
和样品色谱图见图 1。
2.1.2 质谱条件 离子源为电喷雾离子化源
（ESI）；采用多反应离子监测（MRM）进行负离子
检测；源喷射电压（IS）为−4 500 V；雾化温度为
650 ℃；雾化气（GS1，N2）压力为 275.8 KPa；
辅助气（GS2，N2）压力为 344.75 KPa；气帘气（N2）
压力为 172.375 KPa。接口加热，全程通入氮气，
MRM 模式定量。监测离子对，解簇电压（DP）和
碰撞能量（CE）见表 1。
2.2 样品溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 分别称取对照品连翘
苷、连翘脂素、连翘酯苷 A、连翘酯苷 F、芦丁、
槲皮素、异槲皮苷、绿原酸、(＋)-表松脂素-4′-O-
葡萄糖苷适量，精密称定，加甲醇制成对照品溶液。
分别取各对照品溶液适量，摇匀，即得连翘苷、连翘
脂素、连翘酯苷 A、连翘酯苷 F、芦丁、槲皮素、异
槲皮苷、绿原酸、(＋)-表松脂素-4′-O-葡萄糖苷的混
合对照品溶液，质量浓度分别为398.70、48.00、367.50、
5.67、324.00、1.25、20.40、52.00、56.96 μg/mL。
2.2.2 供试品溶液的制备 将不同采收期的连翘叶
自然晾干，研细，各精密称取 0.5 g，置 50 mL 具塞
三角瓶中，精密加入 80%甲醇 25 mL，称质量，超
声提取 45 min，放冷，再称定质量，用 80%甲醇补
足失质量，用 0.45 μm 滤膜滤过，取续滤液作为供
试品溶液。
2.3 方法学考察
2.3.1 线性关系、定量限和检测限 精密量取混合
对照品溶液 300 μL，加甲醇稀释至 1 mL。依次逐
级稀释 2 倍，定容，制得 6 个不同浓度梯度的系列
对照品溶液，按“2.1”项下色谱和质谱条件进行分
析，记录峰面积。以对照品浓度（X）为横坐标，
峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性
回归，得标准曲线方程（表 2），将混合对照品溶液
逐步稀释，分别以信噪比 S/N＝10 和 S/N＝3 时各
对照品的量作为定量限（LOQ）和检测限（LOD），
结果见表 2。
2.3.2 精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液
各 10 μL，连续进样 6 次，记录色谱峰的峰面积。
结果连翘苷、连翘脂素、连翘酯苷 A、连翘酯苷 F、
芦丁、槲皮素、异槲皮苷、绿原酸、(＋)-表松脂素
-4′-O-葡萄糖苷的RSD分别为 0.87%、1.02%、0.82%、
0.69%、0.82%、0.54%、0.98%、1.24% 和 0.77%。
2.3.3 重复性试验 取同一采收期的连翘叶，制
备供试品溶液 6 份，分别测定，连翘苷、连翘脂
素、连翘酯苷 A、连翘酯苷 F、芦丁、槲皮素、
异槲皮苷、绿原酸、(＋)-表松脂素-4′-O-葡萄糖苷 6
次测定结果的 RSD 值分别为 1.14%、1.07%、
0.96%、2.06%、1.78%、0.82%、1.34%、1.28%和
0.91%，均符合规定，表明本方法重复性良好。
2.3.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别在室
温下放置 0、4、8、12、18 和 24 h 时进行测定，记录
峰面积。结果连翘苷、连翘脂素、连翘酯苷 A、连翘
酯苷 F、芦丁、槲皮素、异槲皮苷、绿原酸、(＋)-表
松脂素-4′-O-葡萄糖苷的 RSD 分别为 0.95%、1.21%、
1.09%、1.10%、0.73%、0.60%、1.33%、1.20%和 0.88%，
表明供试品溶液室温条件下放置 24 h 稳定性良好。
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图 1 对照品 (A)、连翘叶 (B) 的多重反应监测色谱图和对照品二级质谱图(C)
Fig. 1 Multiple-reaction monitoring chromatograms of reference substances (A) and Forsythia Folium (B)
and second mass spectrum of reference substances (C)















2 4 6 8 10 2 4 6 8 10 200 400 600 800
7.99
9.46
7.87 579.3
9.43 121.0
356.1
371
2 4 6 8 10 2 4 6 8 10 200 400 600 800
2 4 6 8 10 2 4 6 8 10 200 400 600 800
2 4 6 8 10 2 4 6 8 10 200 400 600 800
2 4 6 8 10 2 4 6 8 10 200 400 600 800
2 4 6 8 10 2 4 6 8 10 200 400
2 4 6 8 10 2 4 6 8 10 200 400 600
2 4 6 8 10 2 4 6 8 10 200 400
2 4 6 8 10 2 4 6 8 10 200 400 600 800
6.61 6.61 160.7
179.0
623
6.30 6.29 160.8
593.3 754.9
7.70 7.70 300.2
609.2
9.30
9.29
150.9
178.9
300.9
7.83 7.83
271.2
299.8
462.9
5.82 5.82 190.9
352.9
6.91 6.92 357.1
519.2
连翘苷






连翘脂素







连翘酯苷 A






连翘酯苷 F






芦丁







槲皮素







异槲皮苷






绿原酸







(＋)-表松脂素-
4′-O-葡萄糖苷
m/z t / mint / min
A B C
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表 1 9 种成分的质谱数据
Table 1 HPLC-ESI-MSn data of nine components
成分 保留时间 / min MS1 / (m/z) MS2 / (m/z) DP / V CE / eV
连翘苷 7.99 579.3 379.1 −38 −30
连翘脂素 9.46 371.3 356.2 −58 −30
连翘酯苷 A 6.61 623.3 161.0 −92 −54
连翘酯苷 F 6.30 755.3 160.8 −85 −60
芦丁 7.72 609.3 271.0 −71 −77
槲皮素 9.30 300.9 150.7 −55 −32
异槲皮苷 7.83 463.2 300.0 −72 −34
绿原酸 5.82 352.8 190.9 −31 −26
(＋)-表松脂素-4′-O-葡萄糖苷 6.91 519.2 357.0 −59 −22

表 2 9 种成分的回归方程、相关系数和线性范围、定量限和检测限
Table 2 Regression equations, correlation coefficients, linear ranges, LOQs, and LODs of nine compounds
成分 标准曲线方程 r 线性范围 / (μg·mL−1) LOQ / (ng·mL−1) LOD / (ng·mL−1)
连翘苷 Y＝124.48 X＋112 7.7 0.999 6 3.788～119.6 7.576 3.788
连翘脂素 Y＝3 752.8 X－153 9.3 0.999 8 0.456～14.40 4.560 1.824
连翘酯苷 A Y＝112 092 X＋375 253 0.999 4 3.490～110.2 0.873 0.291
连翘酯苷 F Y＝79 506 X－206 7.6 0.999 5 0.054～1.701 1.080 0.432
芦丁 Y＝36 299 X＋356 632 0.999 6 3.078～97.20 0.770 0.257
槲皮素 Y＝313 174 X－253.62 0.999 9 0.012～0.375 1.200 0.429
异槲皮苷 Y＝81 683 X＋169 78 0.999 8 0.194～6.120 0.969 0.323
绿原酸 Y＝35 852 X＋612 4.2 0.999 6 0.494～15.60 0.988 0.395
(＋)-表松脂素-4′-O-葡萄糖苷 Y＝462.79 X＋465.74 0.999 6 1.082～17.09 1.800 0.720

2.3.5 加样回收率试验 精密称取已测定的连翘叶
供试品 0.25 g，分别精密加入高、中、低 3 个水平
的对照品，每个水平 3 份，共 9 份，按“2.2.2”项
下方法操作，制备供试品溶液，测定 9 种化合物的
峰面积，计算回收率。连翘苷、连翘脂素、连翘酯
苷 A、连翘酯苷 F、芦丁、槲皮素、异槲皮苷、绿
原酸、(＋)-表松脂素-4′-O-葡萄糖苷的平均加样回收
率分别为 99.48%、99.26%、99.01%、98.98%、
98.85%、99.81%、98.96%、98.47%、99.21%；RSD
分别为 1.20%、1.44%、1.44%、1.16%、1.24%、1.14%、
0.84%、1.31%、0.97%。
2.4 样品测定
取各个采收期的连翘叶，按“2.2.2”项下的方
法制备供试品溶液，按照“2.1”项下的条件进行测
定，记录色谱峰面积，每个采收期样品测定 3 份，
将 9 个待测成分的峰面积代入相应的标准曲线方程
中，并计算其质量分数，结果见表 3。
3 讨论
连翘叶的采集时间区间为 2011 年 5 月 1 日至
2011 年 11 月 15 日，从连翘叶测定结果可以看出，
连翘苷、连翘酯苷 A 和芦丁在连翘叶中质量分数均
较高，连翘脂素、绿原酸和(＋)-表松脂素-4′-O-葡萄
糖苷质量分数相对较低，这 6 种成分在连翘叶中的
量随时间变化波动较大，但基本符合 5 月份质量分
数最高，6、7 月份量有所下降，在 8、9、10 月份
最低，11 月份又有所回升。其他成分连翘酯苷 F、
异槲皮苷和槲皮素的量较低，其质量分数随时间变
化不大，异槲皮素在 5 月的量较其他月份高，连翘
酯苷 F 和槲皮素 5 月份的量为中等水平。连翘花期
在 3～5 月份，每年 4～5 月份萌发生长新枝叶，连
翘叶中主要成分在这段时间量最高，且符合叶类药
材的一般采收规律；果期 7～8 月份，在 9～10 月份
采摘的近成熟果实为“青翘”，10 月份打落的成熟
果实为“老翘”，连翘叶中的有效成分较低。因此，
本实验测定结果与连翘的生长周期一致。综上所述，
连翘叶的最佳采收期以 5 月份最佳，这也说明民间
采集连翘叶嫩芽作为保健茶是有一定的科学依据。
另外，为避免较早采收叶子可能对果实造成的不利
影响，建议在采收连翘果实之后再采收连翘叶，可
以在 11 月份活性成分开始回升时采收连翘叶，以
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 22 期 2013 年 11 月

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表 3 不同采收期连翘叶中 9 种成分的质量分数
Table 3 Contents of nine compounds in Forsythia Folium collected in different periods
质量分数 / %
采收时间
连翘苷 连翘脂素 连翘酯苷 A 连翘酯苷 F 芦丁 槲皮素 异槲皮苷 绿原酸
(＋)-表松脂素-
4′-O-葡萄糖苷
05-01 2.110 6 0.062 1 2.252 5 0.003 0 1.743 7 0.000 4 0.030 2 0.173 1 0.162 0
05-15 1.949 5 0.033 3 2.092 1 0.003 1 1.253 2 0.000 2 0.011 1 0.137 0 0.140 5
06-01 1.397 3 0.027 6 2.079 3 0.001 8 1.162 7 0.000 2 0.009 9 0.084 7 0.126 6
06-15 1.228 5 0.050 1 2.186 0 0.003 2 1.355 4 0.000 3 0.017 4 0.091 4 0.113 3
07-01 0.999 5 0.036 8 2.116 2 0.003 0 1.220 3 0.000 4 0.010 3 0.077 3 0.119 0
07-15 1.301 9 0.041 5 2.180 1 0.003 2 1.194 0 0.000 4 0.010 2 0.088 6 0.139 1
08-01 0.728 6 0.055 7 1.451 9 0.002 4 1.124 0 0.000 3 0.007 3 0.069 6 0.111 2
08-15 0.440 8 0.028 4 1.823 7 0.002 3 0.869 3 0.000 3 0.003 5 0.054 9 0.035 7
09-01 0.715 7 0.028 0 1.443 7 0.001 6 0.816 9 0.000 9 0.008 9 0.045 6 0.066 6
09-15 0.282 1 0.000 0 1.582 0 0.003 7 0.933 7 0.000 3 0.006 5 0.066 6 0.051 1
10-01 0.162 6 0.000 0 1.463 6 0.003 7 1.062 9 0.000 3 0.009 2 0.030 1 0.103 9
10-15 0.323 0 0.000 0 1.594 4 0.003 9 0.955 9 0.000 3 0.020 7 0.015 7 0.072 5
11-01 0.447 7 0.000 0 1.634 0 0.002 3 1.240 3 0.000 5 0.025 3 0.041 3 0.112 5
11-15 0.907 5 0.024 8 1.792 8 0.002 8 1.291 1 0.000 5 0.025 3 0.086 6 0.123 8

充分利用药用资源。本实验的连翘叶材料均选用
2011 年样品，并且来自同一植株，生长地点、环境
相同，避免了由于来源不同而导致的测定误差，可
以较好的保证结果的可信性。
分别考察了流动相中加入 3 种不同的电解质甲
酸、乙酸以及醋酸铵对化合物响应值的影响，发现
加入甲酸后响应值和峰形优于乙酸和醋酸铵。对甲
酸的比例进一步考察，发现 0.02%甲酸能够达到最
佳的分离效果和稳定的响应值，故以甲醇和 0.02%
甲酸水作为流动相梯度洗脱，9 种被分析物在 10
min 内全部出峰。
本研究采用 HPLC-MS/MS 方法对连翘叶的 9
个主要成分进行同时测定，方法快速、准确，并对
结果进行了分析，为连翘叶最佳采收期的确定提供
了科学依据和新的分析方法。
参考文献
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