全 文 ：第 34卷 第 1期 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) Vol. 34 No. 1
2006年 1月 Jour. of No rthw est Sci-Tech Univ . o f Ag ri. a nd Fo r. ( Na t. Sci. Ed. ) Jan. 2006
甘肃棘豆中苦马豆素提取工艺改进初报
刘志滨 ,赵兴华 ,余永涛 ,王建华
(西北农林科技大学 动物科技学院 ,陕西杨凌 712100)
[摘 要 ] 用 40 k Hz超声波水媒处理甘肃棘豆草粉 1. 5 kg ,代替传统的索氏提取法或溶剂冷浸法 ,水提液浓
缩除杂后 ,用正丁醇萃取 ,正丁醇萃取液用稀酸水萃取 ,浓缩后的稀酸水萃取液用氨性氯仿萃取 ,浓缩氨性氯仿萃
取液成浸膏 ,此浸膏经石蜡油浴升华得到 24 mg白色晶体 ,经薄层层析检验 ,可初步鉴定为苦马豆素。 此法不用柱
层析 ,简化了苦马豆素提取的步骤 ,提取率为 16 mg /kg。
[关键词 ] 苦马豆素 ;超声波 ;甘肃棘豆
[中图分类号 ] S856. 9 [文献标识码 ] A [文章编号 ] 1671-9387( 2006) 01-0097-03
自 Colega te等 [1 ]首次报道从灰苦马豆中分离
出苦马豆素以来 ,国内外相继报道从若干种植物和
菌类材料中分离出了苦马豆素 [2-3 ]。 目前 ,从甘肃棘
豆中提取苦马豆素时 ,草粉处理大多采用索氏提取
法或溶剂冷浸法 ,其提取液再依次经酸水、碱水萃取
和硅胶柱层析纯化 ,最后对纯化物在 100℃条件下
进行减压油浴升华。该方法步骤繁琐 ,周期长 ,且需
消耗大量有机溶剂。
超声波协助提取技术与传统的索氏提取法和溶
剂冷浸法相比 ,具有能耗低、时间短、效率高等优
点 [4-5 ] ,在植物有效成分提取方面 ,有很好的应用前
景。关于超声波协助提取技术应用于甘肃棘豆中苦
马豆素提取的研究 ,尚未见报道。为此 ,本试验用 40
kHz的超声波处理甘肃棘豆草粉 ,建立了小批量提
取苦马豆素的工艺流程 ,为建立周期短、节省试剂、
提取率高的苦马豆素提取方法进行有益的探索。
1 材料与方法
1. 1 材 料
甘肃棘豆为 2002年在甘肃省采集的甘肃棘豆
(花期 )的地上部分 ,干燥并粉碎后过孔径为 0. 36
mm的筛 ,备用 ;正丁醇 ,分析纯 ,天津市登峰化学试
剂厂产品 ;三氯甲烷 ,分析纯 ,天津市化学试剂六厂
产品 ;苦马豆素标准样品 ,由西北农林科技大学动物
科技学院生物毒素与分子毒理实验室提供。
1. 2 主要实验仪器
KQ-500D型医用数控超声清洗器 ,频率 40
kHz,功率 500 W ,昆山市超声仪器有限公司生产 ;
FA1104型电子天平 ,上海民桥精密科学仪器有限
公司生产 ; LDZ5-2型低速自动平衡离心机 ,北京医
用离心机厂生产 ; WM ZK-01型温度指示控制仪 ,上
海华辰医用仪表有限公司产品 ; S HB-Ⅲ型循环水式
多用真空泵 ,郑州长城科工贸有限公司。
1. 3 方 法
1. 3. 1 简易流程 甘肃棘豆草粉→加入蒸馏水→
超声波处理→电炉加热浓缩→离心除杂→正丁醇萃
取→酸水萃取→氨性氯仿萃取→浓缩成膏→油浴升
华。
1. 3. 2 具体操作过程 取 1. 5 kg甘肃棘豆草粉 ,
加入 10 L蒸馏水中 ,在超声清洗器中浸渍 12 h ,然
后用 40 kHz超声波 50℃处理 1 h,过滤后草粉按上
述方法再处理 1次 ,共收集得 18 L水提液。 将此水
提液用电炉加热浓缩至 2 L, 1 500 r /min离心 10
min,除去固体杂质 ,然后在水浴锅上 95℃继续浓
缩至 1 L。加入适量氨水调 pH值至 8～ 10,用 1 L正
丁醇萃取此浓缩液 ,反复 5次 ; 用 300 mL 0. 2
mo l /L稀硫酸萃取正丁醇萃取液 ;稀硫酸萃取液浓
缩成膏状 ,再用 1～ 2 L氨性氯仿萃取 ;浓缩氨性氯
仿萃取液得 0. 35 g浸膏 ;最后 ,浸膏于 - 0. 09 M Pa
条件下在石蜡油浴中进行升华。
1. 4 薄层层析检查
在操作过程中 ,每步均取少量样品用于监测其
成分。常规方法制备硅胶板 ,将每步所得样品及苦马
豆素标准样品用少量甲醇溶解 ,用毛细管吸取少量
[收稿日期 ] 2005-05-13
[作者简介 ] 刘志滨 ( 1981- ) ,男 ,黑龙江泰来人 ,在读硕士 ,主要从事有毒植物成分的分离提取及其活性研究。
[通讯作者 ] 王建华 ( 1948- ) ,男 ,河南南阳人 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事家畜中毒性疾病和营养代谢性疾病研究。
DOI : 10. 13207 /j . cnki . jnwaf u. 2006. 01. 020
溶液点于硅胶板上 ,以 V氯仿∶V甲醇∶V氨水∶V蒸馏水 =
70∶ 26∶ 2∶ 2的混合液为展开剂 ,上行法展开。取
出后挥干溶剂 ,显色时先喷过氧化氢 ,置于 115℃加
热 10 min,取下放凉 ,再喷体积分数 10%醋酸酐无
水乙醇液 ,置于同样温度环境中 ,待闻不到酸味时 ,
取下放凉 ,最后喷 Eh rlichs试剂显色 10 min。 记录
各板颜色 ,计算 Rf值。
2 结果与分析
2. 1 苦马豆素的鉴定
最后所得的浸膏以薄层层析法检查 ,结果显示
紫色、桃红色、淡红色 3个斑点 , Rf值分别为 0. 45,
0. 68和 0. 78。第一个斑点显示紫色 ,其形状及 Rf值
与苦马豆素标准样品相符 ;正丁醇萃取液和酸水萃
取液薄层层析检查所示与上述结果相似 ,但颜色淡 ,
脱尾较严重 ;而水提液显色极不明显。
将升华所得白色结晶和苦马豆素标准样品用 3
种不同的展开剂在相同条件下展开 ,二者的斑点形
状和颜色相同 , Rf值相近 ,可初步断定此白色结晶
为苦马豆素 ,详细结果见表 1。
2. 2 苦马豆素的提取率
将 1. 5 kg甘肃棘豆草粉按上述流程提取 ,结果
得白色结晶 24 mg ,提取率为 16 mg /kg。
表 1 白色结晶与苦马豆素标准品在展开系统中的展开结果
Table 1 Comparison betw een th e white c rystal and th e c rite rion sw ainsonine
展开系统
Sp reading sys tem
标准样品 S tandard 白色结晶 Sample
Rf 颜色 Color Rf 颜色 Color
V氯仿∶V甲醇∶V氨水∶ V蒸馏水 = 70∶ 26∶ 2∶ 2
Vchloro fo rm∶V methanol∶Vammonia∶Vdist i lled w ater= 70∶ 26∶ 2∶ 2 0. 45
紫色
Pu rple
0. 46
紫色
Purple
V甲醇∶丙酮∶蒸馏水∶氨水 = 1∶ 6∶ 1∶ 1
Vme thano l∶ Vace tone∶V disti lled w a te r∶Vammonia= 1∶ 6∶ 1∶ 1 0. 50
紫色
Pu rple
0. 49
紫色
Purple
V甲醇∶V乙酸乙酯 = 1∶ 4,加少量氨水
Vme thano l∶ Vethyl a ctate= 1∶ 4, wi th li t tl e ammonia 0. 53
紫色
Pu rple
0. 55
紫色
Purple
3 讨 论
3. 1 苦马豆素的性质与作用
苦马豆素 ( SW)从化学结构上分析属于多羟基
吲哚里西啶生物碱 [ 6] ,为白色针状结晶 ,熔点 144～
145℃ ,分子式为 C8 H15NO3 ,相对分子质量为 173,
易溶于水和乙醇、乙醚、丙酮、氨性氯仿等有机溶剂 ,
酸离解常数 ( Pka)为 7. 4。
苦马豆素是疯草 (豆科黄芪属和棘豆属的有毒
植物 )的主要毒性成分 ,家畜采食疯草后 ,可导致低
聚糖在溶酶体内蓄积 ,引起中毒、死亡、流产等 ,给畜
牧业造成很大损失。疯草生命力顽强 ,不断蔓延 ,使
草地结构劣变 ,生态恶性演替 [7 ]。目前对疯草的治理
主要采取机械防除和化学防除 2种方法 ,但效果均
不佳。童德文等 [8-9 ]通过化学合成法将 SW与牛血清
蛋白 ( BSA)结合为 SW-BSA,作为疫苗免疫接种动
物 ,获得初步成功。
近年来 ,苦马豆素作为一种新的抗癌药物受到
极大关注 ,有关苦马豆素抗肿瘤的实验国内外已多
次报道。苦马豆素可抑制溶酶体内α-甘露糖甙酶Ⅰ
和高尔基体内 α-甘露糖甙酶Ⅱ的活性 ,其作用特点
是既具有杀伤癌细胞作用 ,又具有免疫调节作
用 [10 ]。
苦马豆素可制成疫苗 ,预防疯草中毒病的发生 ,
同时又具有极大的开发为抗肿瘤药物的潜力 ,其市
场应用前景广阔。但无论是人工合成还是从植物及
真菌中提取苦马豆素 ,其步骤均较繁琐 ,且需要消耗
大量的人力、物力 [11-12 ] ,从而使价格非常昂贵 ,限制
了对其的深入研究。本试验所建立的提取方法 ,提高
了苦马豆素的生产效率 ,降低了产品成本 ,对深入研
究动物疯草中毒病或苦马豆素的开发利用均有重要
意义。
3. 2 苦马豆素的超声波协助提取
超声波是指频率为 0. 02～ 50 M Hz的弹性波 ,
不能引起人的听觉 ,其在介质中主要产生 2种形式
的振荡 ,即横向振荡 (横波 )和纵向振荡 (纵波 )。横波
只能在固体中产生 ,纵波可在固体、液体、气体中产
生。 超声波协助提取植物有效成分的基本原理是超
声波的空化作用、热作用和机械作用。超声波的空化
作用能使液体内部产生无数个小气泡 ,小气泡内部
可达几千度的高温和几千个大气压的高压 ,可使植
物细胞壁破裂。 超声波的机械作用可在液体中形成
98 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) 第 34卷
有效的搅动 ,加速细胞内的物质溶解于介质 ,这种作
用是低频机械搅动无法比拟的 [ 13-14 ]。
超声波协助提取植物有效成分的影响因素包括
超声波频率、强度、作用时间、预浸渍时间、温度、料
液比、溶剂浓度以及处理次数等。通常认为超声波最
佳作用条件为频率 20 kHz,温度 40～ 60℃ ,预浸渍
10 h以上。
本试验在相同条件下将升华所得白色结晶与苦
马豆素标准样品在 3种不同的展开系统中展开 ,
Ehrlichs试剂显色 ,结果显示二者斑点的颜色、形
状相同 , Rf值相近 ,可初步确定为苦马豆素。至于超
声波处理甘肃棘豆草粉的最佳工艺 ,还有待进一步
研究。
3. 3 苦马豆素的提取率
甘肃棘豆的采集时间、地点和年份均会对其苦
马豆素的含量造成影响 ,提取过程中的萃取时间、次
数和升华时间等均会影响苦马豆素的提取率。童德
文等 [15 ]报道 ,用传统方法从甘肃棘豆中提取苦马豆
素的提取率为 14 mg /kg。 本试验应用 40 kHz的超
声波处理甘肃棘豆草粉代替传统的索氏提取法或溶
剂冷浸法 ,提取率为 16 mg /kg。 本方法虽可提高提
取率 ,节约有机溶剂 ,但其水提液与甲醇或者乙醇提
取液相比 ,沸点高 ,不易浓缩 ,试验中采用电炉加热
的方法浓缩水提液 ,费时、费电。另外 ,加热温度是否
会对苦马豆素的提取率造成影响仍待探讨。
与传统方法相比 ,不需经过柱层析是本提取方
法的最大优点。 柱层析技术对于甘肃棘豆化学成分
的系统分析效果虽然较好 ,但是要消耗大量的试剂 ,
步骤繁琐 ,技术要求较高 ,不适于批量提取苦马豆
素。本提取方法省掉了柱层析过程 ,明显提高了苦马
豆素的提取效率 ,为苦马豆素批量提取工艺流程的
设计做好了铺垫。
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Cloning and sequencing analysis o f Chinese yakβ-globin gene
YUAN Qing-yan1 , ZHANG Qing-bo1 ,HUANG Zhi-guo1 ,XIE Zhuang1 ,
YIN Pu-lu2 , ZHAO Yong-hua3
( 1 College of Animal Science and Technology ,Nanjing Agricult ural Univ ersity ,N anjing 210095,China;
2 Hongsongwa Breeder Farm ,Chengde , Hebei 310034,China;
3 Longri Breeder Farm , Hongyuan, Sichuan 624400,China)
Abstract: Yak β-g lobin is amplified by primers designed from cat tleβ -g lobin gene. The cloning and se-
quencing resul ts indicate tha t they have very high homology wi th ca t tleβ -g lobin gene with a value of above
97% . Tw o alleles,β73Asn andβ135Asn , w ere detected at β-g lobin locus in Chinese yak. The sample 67 has these
tw o alleles, while individual 64 has alleleβ135Asn and individual 1078 has alleleβ73Asn . The alleleβ135Asn is the
cha racteristic of Chinese yak af ter residue blasting. It i s suggested that theβ 135 Asn o f this allele could re-
duce the oxygen affini ty of yak hemog lobin.
Key words: yak;β -g lobin gene; al lele; ox ygen affinity
(上接第 99页 )
Abstract ID: 1671-9387( 2006) 01-0097-EA
Preliminary study on improving th e ex traction techno logy
of the Swainsonine from Oxytropis kansuensis
LIU Zhi-bin, ZHAO Xing-hua, YU Yong-tao, WANG Jian-hua
(College of Animal Sci-Tec,N orthwest A & F University , Yangling, Shaanx i 712100,China )
Abstract: 1. 5 kg Oxy tropis kansuensis powder w as disposed wi th 40 kHz ult rasound in w ater to substi-
tute the tradi tional so xhlet ex traction technolog y o r the ex t raction in cold so lv ent. Af ter concentration and
removal o f the impuri ty , n-butanol ex tracted by sparse acid was emplo yed. The concentrated acid liquid w as
ex t racted w ith ammoniated chlorofo rm , w hich w as then concentrated to residue. The residue was sublimed
in 100℃ o lefin and 24 mg white crystal, w hich was preliminary determined as swainsonine was collected.
This method simplified the ex t raction and the ex t raction rate reached 16 mg /kg.
Key words: swainsonine; ult rasound;Oxytropis kansuensis
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