全 文 ：濒危植物巴东木莲 ISSR分子标记技术体系的建立
李晓玲 , 温国莉 , 陈发菊 , 梁宏伟 , 何正权
(三峡大学生物技术研究中心 /天然产物研究与利用湖北省重点实验室 ,湖北宜昌 443002)
　　摘要:利用正交设计建立和优化适合于濒危植物巴东木莲的 ISSR-PCR分子标记技术体系。对影响 ISSR
-PCR反应的多个因素 , 包括引物和 DNA模板浓度 、Taq酶用量 、Mg2+和 dNTPs浓度以及 PCR扩增的退火温度 、
退火时间及循环次数等进行了优化。结果表明 , 适于巴东木莲 ISSR-PCR反应的分子标记技术体系为:反应总
体积 20 μl, 含 2 μl10×bufer、1μl20 mmol/LMgCl2、4 μl2 μmol/L引物 、0.4 μl10mmol/LdNTPs、0.8μl5U/μl
Taq酶及 40ng模板 DNA;PCR扩增程序为:94 ℃预变性 5 min, 94 ℃变性 30 s, 54 ℃复性 45 s, 72 ℃延伸 1.5
min, 35个循环 ,最后 72 ℃延伸 7 min。本研究建立的 ISSR分子标记技术体系稳定性强 , 重复性高。
　　关键词:巴东木莲;ISSR;分子标记;正交设计;优化
　　中图分类号:Q943.2　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2008)04-0070-04
收稿日期:2008-02-18
基金项目:国家自然科学基金(编号:30670202);湖北省自然科学基
金(编号:2006ABA201)。
作者简介:李晓玲(1973—),女 ,贵州锦屏人 ,博士 , 从事植物遗传资
源的保存及利用研究。
通讯作者:陈发菊。 Tel:(0717)6397188;E-mail:chenfj616@ 163.
com。
　　巴东木莲(ManglietiapatungensisHu)为木兰科
(Magnoliaceae)木莲属植物 ,常绿乔木 ,是木莲属植
物分布的最北缘植物 [ 1] 。木莲属是现存木兰科植
物中的最原始的类群 ,也是研究木兰科植物系统发
育 、分类及演化的关键类群 。我国南部和西南部地
区是该属植物的现代分布中心 。巴东木莲仅零星分
布在湖北巴东和利川 、湖南桑植和大庸等地 。现有
种群和个体的数量少 ,加之在自然状态下种子的繁
殖能力差 ,林下幼苗极其罕见 ,处于濒危状态 ,被列
为国家二级重点保护植物 [ 2] 。何敬胜等[ 3-4]采用等
位酶对巴东木莲 7个野生居群的遗传多样性进行了
分析 ,而关于巴东木莲 DNA分子水平上的遗传多样
性和遗传结构分析研究国内外未见报道。
简单序列重复区间扩增多态性 (inter-simple
sequencerepeat, ISSR)是由 Zietkiewics等提出的一
种锚定 SSR的新策略 ,是建立在 PCR反应基础上的
一种新型分子标记技术[ 5] 。其原理是根据真核生
物基因组中广泛存在的简单重复序列 (simplese-
quencerepeat, SSR)设计单一引物 ,引物通常为 15
～ 24个碱基序列 ,由 1 ～ 4个碱基为基序的串联重
复和几个非重复的锚定碱基组成 ,从而保证引物与
靶基因组中 SSR的 5′或 3′末端结合 ,对相距较近 、
方向相反的 SSR序列之间的 DNA片段进行扩
增[ 5-6] 。 ISSR比 RAPD揭示更高的多态性 [ 7] 。由
于较 RAPD使用更高的退火温度和使用更长的引物
序列 ,因此 ISSR较 RAPD更可靠 、更稳定 [ 8-9] 。此
外 , ISSR能够揭示物种间更多的遗传变异 ,能区分
亲缘关系很近的品种(系)[ 10] 。因此 ISSR被认为是
检测居群遗传多样性 、鉴定亲缘关系较近的物种及
研究系统进化等方面较为有效的一种分子标记
技术 。
本研究采用正交试验设计 ,对影响 ISSR-PCR
的多个因素 ,包括引物浓度 、TaqDNA聚合酶用量 、
Mg2+和 dNTP浓度 、PCR扩增程序中的退火温度及
循环次数进行了优化 ,同时对 DNA模板浓度进行筛
选 ,为 ISSR分子标记技术在巴东木莲遗传多样性及
起源进化研究上的应用提供技术支持。
1　材料与方法
1.1　材料
巴东木莲采自湖北省巴东县 ,采集时带枝条 ,保
存在冰盒中带回实验室后转移到 -70 ℃超低温冰箱
中 ,用于提取基因组 DNA;Taq酶 、dNTPs、10×PCR
bufer及 MgCl2等购自上海捷瑞生物工程有限公司;
UBC808、UBC809、UBC810ISSR引物购自上海生物工
程公司。引物序列分别为 3′-AGAGAGAGAGAGA-
GAGC0-3′、5′-AGAGAGAGAGAGAGAGG-3′、5′-
AGAGAGAGAGAGAGAGT-3′。
—70— 江苏农业科学　2008年第 4期DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2008.04.014
1.2　基因组 DNA的提取
参照 Doyle等 [ 11] 的 CTAB法方法 ,稍作改进 。
用紫外分光光度计检测其质量和浓度 ,并稀释至 40
ng/μl,备用 。
1.3　PCR扩增
PCR扩增反应在美国 MJResearch公司生产的
PTC-220型仪上进行 。扩增程序为:预变性 94 ℃
5 min,变性 94℃ 30 s,复性 55 ℃ 45 s,延伸 72 ℃
90 s,循环 35次 ,最后延伸 72 ℃ 5 min, 4 ℃保存 。
扩增产物在含 0.5 μg/mlEB、浓度为 1.5%的琼脂
糖凝胶上恒压电泳 ,电泳电压为 4 V/cm,待 Loading
bufer指示剂到达距凝胶边缘 3 cm处停止电泳 ,将
胶取出在凝胶成像仪中照相。
1.4　PCR反应条件优化的正交试验
采用 L9(34)正交试验设计 ,首先对 dNTPs、引
物 、Mg2 +及 Taq酶浓度进行 4因素 3水平的筛选 ,方
案如表 1和表 2。根据方案分别制备反应总体积为
20 μl的 9个反应体系 ,除表中变化因素外 ,每个反
应体系中含 1×PCRbufer和 40 ng模板 DNA,选用
UBC808号引物 ,每个体系设置 2个重复。
表 1　ISSR-PCR反应体系因素及水平
水平
因　素
dNTPs
(mmol/L)
引物
(μmol/L)
Mg2+
(mmol/L)
Taq酶
(U)
1 0.10 0.2 1.0 0.5
2 0.15 0.4 1.5 1.0
3 0.20 0.6 2.0 2.0
表 2　ISSR-PCR反应条件优化正交试验设计 [ L9(34)]
处理号
因　素
dNTPs
(mmol/L)
引物
(μmol/L)
Mg2+
(mmol/L)
Taq酶
(U)
1 0.10 0.2 1.0 0.5
2 0.10 0.4 1.5 1.0
3 0.10 0.6 2.0 2.0
4 0.15 0.2 1.5 2.0
5 0.15 0.4 2.0 0.5
6 0.15 0.6 1.0 1.0
7 0.20 0.2 2.0 1.0
8 0.20 0.4 1.0 2.0
9 0.20 0.6 1.5 0.5
1.5　模板 DNA浓度的筛选
找出最佳的 PCR反应体系后对模板 DNA浓度
进行筛选 , 20 μl反应体积中模板 DNA浓度分别为
10、20、40、60、80及 100ng,共 6个梯度 ,每个梯度 2
个重复 。
1.6　PCR扩增程序的筛选
在试验确定的最佳 PCR反应体系的基础上 ,采
用 L4(23)正交试验设计对扩增程序中退火温度 、时
间 、循环次数进行优化 ,共 4个处理 ,各处理组合见
表 3。
表 3　PCR扩增程序正交优化
处理号 退火温度(℃)循环次数(次) 退火时间(s)
1 50 30 30
2 50 35 45
3 54 30 45
4 54 35 30
1.7　数据的处理和分析
PCR扩增某一 DNA片段在凝胶上的亮度反映
了该片段被扩增的数量大小 ,它和扩增条带数量同
时反映出扩增结果的好坏。根据遗传多样性的分析
要求统计不同处理的平均条带数量 ,条带亮度是对
同一片段大小水平比较进行打分 ,最亮的为 5分 ,其
次是 4分 ,再弱一点的是 3分 ,暗的 2分 ,最暗的为 1
分。同时采用软件 SPSS10.0对数据进行方差分析
和 t测验 。
2　结果与分析
2.1　PCR正交试验设计反应体系的分析
2.1.1　PCR正交试验设计反应体系的直观分析　
从正交试验设计 ISSR-PCR扩增结果(图 1)可以
直观看出 ,在 9个处理组合中由于 dNTPs、引物浓
度 、Mg2+浓度及 Taq酶浓度四大影响因素浓度组合
的不同 ,扩增效果存在着明显的差异 。处理 6和处
理 8扩增效果较好 ,不仅条带多态性好 、谱带清晰 ,
而且扩增效果稳定。处理 1扩增效果次之 。处理
2、处理 3和处理 4扩增效果较差 ,谱带弱且多态性
差 ,尤其处理 3几乎扩增不出条带 ,可能是 dNTPs浓
度过低所致。处理 5、处理 7和处理 9扩增的谱带
较强 ,但条带多态性差 ,且背景有些弥散 ,这可能是
Mg2+、dNTPs或 Taq酶浓度偏高或其中 2种因素的
浓度偏高所致 。
—71—李晓玲等:濒危植物巴东木莲 ISSR分子标记技术体系的建立
2.1.2　最佳 PCR反应体系的确定
2.1.2.1　最佳处理体系的确定　为进一步客观分
析 PCR扩增结果 ,根据谱带的数量强弱对 PCR扩
增结果进行统计分析(表 4),结果表明 ,处理 6和处
理 8在扩增的片段数 、亮度及综合扩增的片段数和
亮度之和均较其他处理差异显著 ,虽然两者无明显
差异 ,但综合扩增片段有效数及扩增片段亮度分析 ,
处理 8应是最佳处理体系 ,即 1.0 mmol/LMg2+ ,
0.4μmol/L引物 , 0.2mmol/LdNTPs, 2UTaq酶 ,体
系总体积 20 μl。
表 4　ISSR-PCR正交设计试验处理统计结果(平均值 ±标准误)
处理号 条带数(条) 条带亮度 综合
1 4.0cd 4.7±0.4a 8.7±0.4bc
2 4.0cd 3.0c 7.0cd
3 0g 0d 0e
4 2.5±0.5ef 2.5±0.5c 5.0±1.0d
5 5.0±1.0bc 4.7±0.4a 9.7±1.4ab
6 6.0ab 4.3±0.3ab 10.3±0.3ab
7 3.5±0.5de 3.3±0.8bc 6.8±1.3cd
8 6.5±0.5a 4.8±0.3a 11.3±0.8a
9 2.0f 4.8±0.3a 6.8±0.3cd
　　注:表中同列含相同小写字母表示经 Duncan s检验分析差异不
显著(P>0.05),表 5同。
2.1.2.2　最佳水平组合体系的确定　正交试验是
根据各组合不同水平对扩增片段数量 、亮度以及对
扩增片段数量和亮度相加得到的综合值的影响来确
定最优水平组合 。从表 5可知 , 4种组合各水平间
对扩增片段数 、亮度及综合值的影响差异显著。
dNTPs浓度过高会导致聚合酶错误地掺入 ,浓度过
低又会影响合成效率 ,甚至会因 dNTPs过早消耗而
使产物单链化 , 影响扩增效果 。 dNTPs的水平 2
(0.15mmol/L)和水平 3(0.20 mmol/L)与水平 1
(0.10 mmol/L)有显著差异 ,但水平 2和水平 3差
异不显著 , 从节约成本的角度分析 , 选择水平 2
(0.15mmol/L)为体系中 dNTPs的适宜浓度。采用
类似方法分析了 Mg2+、引物及 Taq酶 ,确定了最佳
水平组合 20 μl的体系中含 Mg2+浓度为 1.0
mmol/L, dNTPS浓度为 0.15 mmol/L,引物浓度为
0.4 μmol/L, Taq酶为 0.5 U。
2.1.2.3　最佳处理体系与最佳水平组合的比较　
分别以引物 808、809、810,采用最佳水平组合和最
佳处理体系进行 ISSR-PCR扩增 ,结果如图 2。可
以直观看出采用最佳处理体系较最佳水平组合体系
扩增的谱带明亮 ,多态性高。进一步统计条带数 ,并
对主条带的亮度进行打分 ,统计结果见表 6。对两
者进行 t测验 , df=5, t=-4.110, Sig.(2-tailed)=
0.009,最佳处理体系较最佳水平组合体系差异极显
著 ,且条带清晰 、稳定性强 、重复性高 ,则最佳处理体
系为优化的反应体系 ,即在 20 μl的反应体系中含
1.0 mmol/LMg2+、0.4 μmol/L引物 、0.2 mmol/L
dNTPs、2 UTaq酶 、1×bufer及 40 ng模板 DNA。
表 5　PCR扩增主要条件参数各组合不同水平对扩增片段数量及条带亮度的影响(平均值 ±标准误)
因素
水平
Mg2+
平均条带
数(条)
平均条
带亮度 综合
dNTPs
平均条带
数(条)
平均条
带亮度 综合
引　物
平均条带
数(条)
平均条
带亮度 综合
Taq酶
平均条带
数(条)
平均条
带亮度 综合
1 5.5±0.2a 4.6±0.1a 10.1±0.3a 2.7b 2.6±0.1b 5.2±0.1b 3.5±0.2b 3.5±0.3ab 7.0±0.5b 3.7±0.3ab4.5±0.3a8.2±0.6a
2 2.8±0.2b 3.4±0.1b 6.3±0.3b 4.5±0.5a 3.8±0.4a 8.3±0.9a 5.2±0.2a 4.1±0.0a 9.3±0.0a 4.5±0.2a3.5±0.3ab8.0±0.5a
3 2.8±0.5b 2.6±0.4b 5.5±0.9b 4.0a 4.3±0.1a 8.3±0.1a 2.7±0.0c 3.0±0.0b 5.7±0.0b 3.0±0.0b2.4±0.1b5.4±0.1b
2.2　DNA模板浓度的确定
从图 3可以看出 ,在 20 μlISSR-PCR反应体
系中 , DNA模板浓度由 10ng到 100 ng均能扩增出
明亮的条带。从 40 ng开始 ,扩增条带的亮度不再
增加 。结果表明 DNA模板浓度对 PCR扩增没有明
显的影响 ,以 40 ng模板 DNA为宜。
2.3　PCR扩增程序的筛选
采用正交设计 L4(23)对扩增程序中的退火温
度 、退火时间 、循环次数进行筛选。从图 4可以看
出 ,扩增程序 1和程序 2只有 2条带 ,程序 3有 5条
带 ,程序 4有 4条带。从程序 1、程序 2、程序 3、程序
4扩增结果比较中得出 ,随着退火温度的增加 ,扩增
的带数增多;程序 1与程序 2、程序 3与程序 4的比
—72— 江苏农业科学　2008年第 4期
较中得出 ,随着循环次数和退火时间的增加 ,扩增带
数并没有增加 ,因此退火温度是影响扩增的主要因
素 ,程序 3应是一个较好的 PCR扩增程序 ,即以 54
℃退火温度 、30个循环 、退火时间 45 s为宜 。
表 6　最佳处理体系和最佳水平组合的 PCR扩增统计结果
体　系 条带数(条) 条带亮度 综　合
1a 5 2.5 7.50
1a 5 2.5 7.50
1b 5 2.0 7.00
1b 5 2.0 7.00
1c 5 1.0 6.00
1c 5 1.0 6.00
2a 7 5.0 12.0
2a 7 5.0 12.0
2b 5 3.5 8.50
2b 5 3.0 8.00
2c 9 4.0 13.0
2c 9 3.5 12.5
　　注:1a-1c为最佳处理体系的代号 , 2a-2c为最佳水平处理体
系的代号 , 1a和 2a使用引物 808, 1b和 2b使用引物 809, 1c和 2c使
用引物 810。
3　讨论
ISSR分子标记技术基于 PCR反应 ,其扩增谱带
虽较 RAPD标记稳定 ,但同样受反应条件和物种不
同的影响。本试验结果也证明采用不同的体系其扩
增结果差异很大 。因此 ,进行 ISSR分子标记的 PCR
扩增时 ,首先对其反应条件进行优化显得必不可少 。
反应条件一旦确定后 ,在整个试验过程中就应保持
不变 ,同时还应注意尽可能的使用统一厂家统一批
次的药剂和同一专用的 PCR仪器等设备 ,才能保证
ISSR分析结果的重复性和可靠性 。
目前建立 PCR反应体系使用较多的为单因素
筛选法 ,对于 PCR反应体系中的几种主要条件参数
进行逐一筛选 ,最后组合成最佳反应体系。正交设
计既能考察各条件参数的交互作用得出正交表中的
最佳处理 ,也可分析每一因素不同水平对扩增结果
产生的影响 ,得到最优的水平组合 。本研究采用正
交试验设计 ,考察了 Mg2 +、引物 、dNTPs及 Taq酶 4
种 PSR扩增反应的主要条件因素及 PCR扩增程序中
的退火温度及循环次数对扩增结果的影响 ,同时对
DNA模板浓度进行筛选 ,通过直观和量化分析较快
地筛选出稳定性好 、重复性高的最佳反应条件参数。
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