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(kg) ，投料含水率为 A(%)满足线性关系，则有:y = a × x ×
A + b。试验初步计算堆肥渗滤液产生量与堆肥投料质量线
性关系，后期试验中将对该关系函数进行验证，并加以修正。
通过 2 次堆肥试验，得出在含水率为 55%条件下，
(x1，y1)=(15． 13，73． 67) ;(x2，y2)=(16． 92，74． 5)。
可以得出 a = 0． 843，b = 67． 485，则 y = 0． 843 × x × A +
67． 485(图 7)。
3 结论与讨论
本研究表明，2 次堆肥启动后 24 d 已基本腐熟。堆肥过
程中，2 次堆肥温度均可超过 55 ℃。其中堆肥高温在 50 ℃
以上持续了 5 ～ 7 d，pH值最终稳定在 7． 0 ～ 8． 0，满足了堆肥
高温无害化卫生标准。堆肥过程中渗滤液排放表现为:初期
排放量较大，之后逐渐降低。2 组试验中堆肥渗滤液排放总
量在 75 mL左右，初步得出堆肥渗滤液产生量与堆肥投料质
量线性方程为 y = 0． 843 × x × A + 67． 485。
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doi:10． 15889 / j． issn． 1002 － 1302． 2015． 03． 103
华木莲叶中内生真菌的群落结构
刘紫英，冷桂华，周秀玲
(宜春学院化学与生物工程学院 /江西省天然药物活性成分重点实验室，江西宜春 336000)
摘要:为了解我国特有珍稀植物华木莲叶片的内生真菌菌群结构特征，以华木莲叶片为材料，采用组织分离法分
离华木莲的内生真菌。结果表明，PDA改良培养基(PDA培养基内加 20 g /L华木莲叶汁液、30 mg /L 链霉素)的分离
效果最好。从华木莲的叶中共分离得到 87 株内生真菌，经显微形态鉴定，鉴定菌株 74 株，为 4 目 5 科 10 属，分别为
青霉属、木霉属、曲霉属、小孢霉属、交链孢属、枝孢属、长蠕孢属、镰孢霉属、拟茎点霉属、丝核菌属，结果显示叶中内生
真菌菌群多样性较丰富，优势属为无性丝孢类菌群中青霉属、木霉属、交链孢属和无性腔孢类拟茎点霉属;分离率分别
为 17． 2%、12． 6%、10． 4%和 11． 5%，对开发和利用植物内生真菌及丰富真菌的物种具有重要意义。
关键词:华木莲;内生真菌;分离;鉴定
中图分类号:S567． 23 + 9． 01 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2015)03 － 0316 － 03
收稿日期:2014 － 04 － 25
基金项目:江西省天然药物活性成分重点实验室开放基金;宜春学院
校级课题。
作者简介:刘紫英(1979—) ，女，江西万年人，硕士，副教授，从事药用
植物内生真菌活性成分研究。E － mail:yingziliu2008@163． com。
华木莲(Sinomanglietia glauca Z． X． Yu et Q． Y． Zheng) ，
别称落叶木莲，为木兰科单种属植物，是我国江西省宜春市
特有的珍稀濒危新树种，仅狭域分布于宜春市境内明月山山
地，落叶乔木，1995 年被列入国务院公布的“国家重点保护野
生植物名录”中国家 I级重点保护植物［1 － 3］，同时被英国皇家
植物园收编在册，华木莲保护工程已被列入国家重点植物 21
种极小种群的保护工程。目前，国内外对华木莲的报道主要
集中在华木莲生物学特性及繁殖技术、保护生物学、遗传多样
性及群落种间联结性等方面［4 － 6］，施建敏等对华木莲叶黄酮
类化合物抗氧化作用、多糖的提取及其抗氧化作用进行了研
究，结果显示，华木莲叶内多糖和黄酮类化合物有较好的抗氧
化性，华木莲具有潜在的利用价值［7 － 8］。
植物内生真菌是近 30 年国内外真菌资源多样性和分类
学的研究热点之一。在许多药用植物和重要价值植物体内，
内生真菌的组成和分布得到了比较深入的研究［9 － 11］，但是植
物内生真菌具有丰富的多样性，特有植物可能具有特殊的内
生真菌区系组成。现有研究表明，内生真菌能够产生与宿主
植物相同或相似的化学成分［12］。因此，开发和利用植物内生
真菌对于丰富真菌的种类、探讨真菌和宿主的相互作用和协
同进化等都具有重要意义，在保护植物种质资源、分离新的产
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物和新的活性成分等方面都具有重要的价值。到目前为止，
对华木莲内生真菌国内外还没有研究报道，因此笔者以珍稀
植物华木莲叶为试验材料，分离鉴定其内生真菌，为华木莲叶
中内生真菌种群多样性分析提供基础，同时保护珍稀植物为
江西省的植物资源开发开辟了新途径。
1 材料和方法
1． 1 试验材料
材料为华木莲新鲜健康叶片，取于江西省宜春市明月山风
景区周边林木种植场。叶片摘取后，用自来水冲洗干净备用。
1． 2 培养基
采用改良 PDA培养基:200 g 马铃薯(煮汁)+ 20 g 葡萄
糖 + 20 g 华木莲叶(煮汁)+ 20 g 琼脂，加水定容至
1 000 mL。临用前加入 30 mg /L 氯霉素。
1． 3 内生真菌分离
选用健康植株的叶片，用自来水冲洗干净，切段;超净工
作台上，无菌水清洗 2 ～ 3 次;75%乙醇消毒 2 min，无菌水清
洗 4 次;0． 1% HgCl2 消毒，消毒时间设 1、2、2． 5、3、3． 5、4 min
等 6 个梯度，以考察其最佳消毒时间，无菌水清洗 6 次，无菌
滤纸吸干水分;用无菌刀片将叶片切成 5 mm ×5 mm的小片，
分别置于培养基中，26 ℃恒温培养 5 ～ 7 d，待组织块周围菌
丝生长旺盛时再挑取部分菌丝转接到新鲜培养基上进行纯化
培养。设无消毒对照和空白对照，将表面消毒后的叶片不作
切割处理并放置在相同条件下培养，以确定是否彻底消毒。
根据培养时间、菌落的生长速度和真菌的生长种类确定最佳
消毒时间进行扩大培养;并对菌株进行编号，华木莲的叶分离
所得内生真菌分别标记为 SL1、SL2、…、SL87。
1． 4 内生真菌的鉴定
采用点植法、胶带粘贴法、真菌学插片培养法及真菌玻片
培养法制成玻片，置于高级数码生物显微镜 SK － DM500 光
学摄像仪下摄像，观察菌丝形态、产孢结构及孢子形态，鉴定
真菌种类［13 － 14］。对在人工培养条件下较少产孢的菌株采用
菌落造伤、近紫外灯照射、冰箱短暂冷藏等方法诱导产孢。
2 结果与分析
2． 1 HgCl2 消毒时间的确定
0． 1% HgCl2 的消毒时间梯度处理结果显示，在 0． 1%
HgCl2 消毒 1 min的培养基内可以观察到部分明显的细菌菌
落，2 min以上的消毒效果较好，明显优于 1 min，而 4 min 对
鲜嫩叶的组织损害较大。2、2． 5、3 min 为比较合适的消毒时
间，综合分离菌群所得多样性和消毒效果，试验选取 0． 1%
HgCl2 处理 2． 5 min作为消毒处理时间，既能除去表面可能带
有的杂菌，又可避免因消毒时间过长而伤害组织，还能尽可能
分离更多的内生真菌群落。
2． 2 华木莲内生真菌鉴定
用改良 PDA平板培养基分离菌株，从菌落形态、菌体显
微形态 2 方面对所分离的内生真菌进行观察，对照《真菌鉴
定手册》根据菌株的菌落形态特征、颜色、质地、生长培养基
颜色变化以及菌丝体和孢子的形态特征进行鉴定，总共分离
到内生真菌 87 株，已鉴定菌株 75 株，为 4 目 5 科 10 属，均属
丝孢纲，分别为青霉属、木霉属、曲霉属、小孢霉属、交链孢属、
枝孢属、长蠕孢属、镰孢霉属、拟茎点霉属、丝核菌属(表 1)，
可见华木莲叶中内生真菌菌群多样性丰富。
2． 2 华木莲内生真菌群落结构分析
表 2显示，华木莲内生真菌均属丝孢无性型真菌和腔孢无
性型真菌。在目分类水平上，以丝孢目(Hyphomycetales)为优
势菌群，占 65． 5%。在科的分类水平上，丛梗孢科(Moniliace-
ae)、暗梗孢科(Dematiaceae)和球壳孢科(Sphaeropsidaceae)为
优势菌群，分别占总菌株数量的 44． 8%、15． 0%、11． 5%。在属
的水平上分类，丝孢无性型真菌中青霉属、交链孢属、木霉属和
腔孢类无性型真菌的拟茎点霉属分别占所分离菌株数的
17. 2%、10． 4%、16． 1%和 11． 5%，为华木莲内生真菌的优势种
群。因实验室培养条件下不产孢，有 8株菌株无法鉴定到归属
的无孢菌群。这与传统的真菌菌种鉴定主要通过菌落及显微
形态学观察而作出判断的局限性有关，因而在以后工作中将结
合分子生物学以分离的内生真菌总 DNA 为研究对象，用 ITS
序列分析法对华木莲的内生真菌进行进一步鉴定。
3 结论与讨论
内生真菌在植物体内分布不均衡，随着外界环境的改变，
在植物中内生真菌分布的种类、数量及生长状况有所不
同［15］。所以，在分离时要尽量模拟内生菌在其宿主体内自然
状态下的生活环境，以便能够最大量地分离出内生菌。本研究
对 PDA培养基进行了改良，改良 PDA培养基中添加了宿主植
物华木莲叶汁液，补充了华木莲内生真菌可能需要的特殊营
养，通过培养基筛选的前期试验发现，在这种改良 PDA培养基
上华木莲内生真菌菌群较丰富，但不能保证所有生活在组织内
的真菌全部分离出来，可能有的内生真菌不能在人工培养基上
生长，或者只能在其他选择性培养基上生长。因此，尽量选择
多种分离培养基获得多种群的内生真菌是必要的。
华木莲内生真菌菌群较丰富，分属于青霉属、木霉属、曲
霉属、小孢霉属、交链孢属、枝孢属、长蠕孢属、镰孢霉属、拟茎
点霉属、丝核菌属。其中，丝孢无性型真菌的青霉属、交链孢
属、木霉属和腔孢类无性型真菌的拟茎点霉属分别占所分离
菌株数的 17． 2%、12． 6%、11． 5%和 14． 9%，为华木莲内生真
菌的优势种群。植物内生真菌的生物多样性受多种因素影
响，同一植物在不同的地理区域或位点具有不同的内生菌类
群。华木莲仅生长于江西省宜春市明月山风景区，所以分离
华木莲叶中不存在不同地域种群的差异。
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—713—江苏农业科学 2015 年第 43 卷第 3 期
表 1 华木莲叶中内生真菌的菌落特征及分类
菌株号 形态学特征 科属
SL1、SL2、SL3、SL4、SL5、SL6、SL7、
SL8、SL9、SL10、SL11、SL12、SL13、
SL14、SL15
菌落圆形，绒毡状，绿色，背面黄绿色;分生孢子梗从菌丝上垂直生出，单
个发生或不常成束，有横隔膜，顶端生排列成帚状的间枝，分枝 1 次或多
次，顶层为小梗，分生孢子串呈不分枝的链状。
丝孢目丛梗孢科青霉属
SL16、SL17、SL18、SL19、SL20、
SL21、SL22、SL23
菌落圆形，从内到外形成绿色，黄色，白色的同心环，边缘整齐;菌丝体产
生色素，并有射线状的凹痕，背面的培养基颜色变为灰绿色或深绿色，菌
丝体表生，较短，菌丝细长;分生孢子梗多数无隔，顶端膨大成球形，分生
孢子串生于小梗顶，单个孢子球形。
丝孢目丛梗孢科曲霉属
SL24、SL25、SL26、SL27、SL28、
SL29、SL30、S31、SL32、SL33、
SL34、SL35、SL36、SL37
菌落圆形，绒毡状，军绿色，背面绿色;菌丝分枝，近直角。 丝孢目丛梗孢科木霉属
SL38、SL39 内生菌菌丝呈透明状，菌丝结构较散，只有顶端有孢子。 丝孢目丛梗孢科小孢霉属
SL40、SL41、SL42、SL43、SL44、
SL45、SL46、SL47、SL48
培养基上长势迅速，菌落初期为淡褐色，后渐变成褐色;菌丝带有褐色，
分枝，质地为絮状，直径达培养皿边缘，营养菌丝有分隔;分生孢子梗暗
褐色，通常较短，分隔，分生孢子为倒棍棒状，暗色，具有横隔和纵隔，顶
端常延长为喙状，向顶着生成分生孢子。
暗梗孢科交链孢属
SL49、SL50 菌落放射状生长，边缘整齐，初期白色，渐分泌红色色素;培养基背部可
见红色或紫红色;内生真菌菌丝密集如毡，细长，有隔;分生孢子梗长而
直立，多不分枝，分生孢子在分生孢子梗顶端单个生成，分生孢子纺锤
形，略弯，浅褐色，具横切的隔膜，光滑，基部圆形平截，具有明显的暗色
脐或瘫痕。
丝孢目暗梗孢科长蠕孢属
SL51、SL52 菌落小且形状不规则，墨绿色，绒毡状，向培养基内缢缩，在菌落表面形
成山脊样形态;分生孢子梗暗色，直立，在顶部或中部分支，成簇或单生;
分生孢子暗色，1 ～ 2 个细胞。
丛梗孢目暗梗孢科枝孢
霉属
SL53、SL54、SL55、SL56、SL57 边缘整齐，菌落棉絮状，菌落中部淡橙色，边缘白色;菌丝细长，分枝，分
隔;分生孢子无色，大型孢子多细胞，镰刀形，微弯或两端尖而弯曲显著。
丝孢目瘤座孢科镰孢霉属
SL58、SL59、SL60、SL61、SL62、
SL63、SL64、SL65、SL66、SL67
菌落初期白色，随着培养时间的延长菌体逐渐变暗，后期在培养基表面
产生许多黑色颗粒状凸起物，表面伴有黏稠状的橙黄色液滴;分生孢子
梗无色，细长或短，有隔或无隔，产孢细胞无色。
球壳孢目球壳孢科拟茎点
霉属
SL68、SL69、SL70、SL71、SL72、
SL73、SL74、SL75
菌落呈辐射状;气生菌丝黄白色，菌丝分枝成直角或锐角，在其起源处缢
缩;分枝菌丝在离其起源不远处有桶状隔膜，不产孢子。
无孢目无孢科丝核菌属
表 2 华木莲叶片内生真菌种群组成
类型 目 科 属
数量
(个)
分离率
(%)
丝孢无性型真菌 丝孢目(Hyphomycetales) 丛梗孢科(Moniliaceae) 青霉属(Penicillium) 15 17． 2
曲霉属(Aspergillus) 8 9． 2
木霉属(Trichoderma) 14 16． 1
小孢霉属(Microsporum) 2 2． 3
暗梗孢科(Dematiaceae) 交链孢属(Alternaria) 9 10． 4
枝孢属(Cladosporium) 2 2． 3
长蠕孢属(Helminthosporium) 2 2． 3
瘤座孢科(Tuberculariariaceae) 镰孢霉属(Fusarium) 5 5． 7
腔孢类无性型真菌 球壳孢目(Sphaeropsidales) 球壳孢科(Sphaeropsidaceae) 拟茎点霉属(Phoma) 10 11． 5
无孢目(Agonomycetal) 无孢科(Agonomycetaceae) 丝核菌属(Ｒhizoctonia) 8 9． 2
无孢菌群 未鉴定的内生真菌 12 13． 8
总计 87 100． 0
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