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毛冬青皂苷 ilexsaponinA1的制备及其药理活性研究
周　园 ,熊天琴 ,林朝展 ,赵钟祥＊ ,秦聪怡 ,曹　媛
(广州中医药大学中药学院 ,广东 广州 510006)
　　摘要　目的:分离制备毛冬青三萜皂苷 ilexsaponinA1(IPTS-1),并探讨其药理活性 ,为阐明毛冬青的活性成分
提供实验依据。方法:综合运用色谱法和重结晶法等分离纯化方法进行化合物的制备 , 采用薄层对照及核磁波谱
分析的方法对化合物的结构进行鉴定。通过凝血时间 、出血时间 、小鼠耳廓微循环实验和大鼠 FeCl3诱导血栓实验
对 IPTS-1的抗凝 、活血 、抗血栓作用进行评估和探讨。结果:与对照组比较 , IPTS-1各剂量均能显著延长小鼠出血
时间和凝血时间(P<0.05),且作用呈剂量相关性。 IPTS-1可加速小鼠耳廓微循环血流速度 ,减少 FeCl3诱导的大
鼠腹主动脉血栓生成质量。结论:毛冬青三萜皂苷 IPTS-1具备一定的抗凝 、活血 、抗血栓作用 , 可能为毛冬青心血
管药理作用的物质基础之一。
关键词　ilexsaponinA1, 毛冬青 ,抗凝 , 抗血栓
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2011)05-0765-03
收稿日期:2010-09-08基金项目:国家自然科学基金 (30901954);广东省自然科学基金 (9451040701003203);高等学校博士学科点专项科研基金(20094425110088);广州中医药大学创新基金(09CX015)作者简介:周园(1978-),女 ,博士 ,讲师 ,主要从事心血管药理研究;E-mail:zygz@gzhtcm.edu.cn。＊通讯作者:赵钟祥 , Tel:020-39358072, E-mail:zzx37@163.com。
　　毛冬青为冬青科 (Aquifoliaceae)冬青属 (Ilex)
植物毛冬青 (IlexpubescensHook.etArn.)的根或
叶 ,具有活血通脉 、消肿止痛 、清热解毒等功效 。已
有研究表明毛冬青各类制剂对冠心病 、脑血栓 、血栓
性脉管炎等与血栓形成有密切联系的心脑血管疾病
有显著疗效 〔1, 2〕。毛冬青中主要含有三萜及其苷
类 、木脂素类 、环烯醚萜类化合物等 ,其中三萜及其
苷类是毛冬青的主要成分和特征性成分。目前人们
对毛冬青的化学成分和药理方面的研究已取得了一
些进展 ,但由于毛冬青化学成分复杂 ,毛冬青发挥临
床治疗作用的有效成分及作用机制至今尚未阐
明 〔1-3〕。本课题组的前期研究表明三萜皂苷 ilexsa-
poninA1(IPTS-1)在药材中的含量可达 0.93%,为
该植物中含量最高的三萜类化合物之一。本研究综
合运用多种分离纯化方法从毛冬青药材中分离制备
了三萜皂苷 ilexsaponinA1,采用核磁波谱分析的方
法对其结构进行了鉴定 ,并对其在抗凝 、活血 、抗血
栓方面的药理活性进行了研究。
1　材料与仪器
1.1　实验动物　清洁级昆明种小鼠 ,体质量 18 ～
22 g,雌雄各半;清洁级 SD大鼠 ,体质量 200 ～ 250
g,雌雄各半 ,均由广州中医药大学实验动物中心提
供 ,许可证号:SCXK(粤)2008-0020。
1.2　药材与试剂　毛冬青药材于 2009年购自广
州致信中药饮片有限公司 ,经广州中草药医药大学
祝晨蔯研究员鉴定为毛冬青科冬青属植物毛冬青
(IlexpubescensHook.etArn.)的干燥根 ,留样样品保
存在本实验室;柱层析硅胶和薄层层析硅胶(青岛
·765·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 34卷第 5期 2011年 5月
海洋化工厂);阿司匹林(拜耳医药保健公司 , 100
mg/片 ,批号:20090120);甲醇 、乙酸乙酯 、氯仿均为
国产分析纯(广州化学试剂厂)。
1.3　主要仪器　核磁用 BrukerAV400型核磁共
振仪(Bruker, Switzerland);电子天平(JB/T5374上
海梅特勒-托利多仪器有限公司);游标卡尺(无锡工
具量具厂);PERIMED激光多谱勒血流仪(瑞典百
灵威医疗仪器有限公司)。
2　方法与结果
2.1　毛冬青提取和制备　将 12.0 kg毛冬青干燥
根粉碎至粗粉 ,采用甲醇渗漉法进行提取 , 65 ℃减
压回收溶剂得总浸膏 1.5kg。浸膏挥去甲醇后加蒸
馏水至 4 L,充分分散后滤去约 580 g沉淀 ,滤液分
别用乙酸乙酯萃取 ,萃取液减压回收溶剂至干 ,得到
乙酸乙酯部位 350 g。取乙酸乙酯部位 300 g,用硅
胶 1 300g进行柱层析。以氯仿-甲醇(100∶1※2∶1)
进行梯度洗脱 ,洗脱液每 1 000 mL接收为 1份 ,以
TLC进行检测 、合并 ,得到 15个部分 (Fr.A1-15)。
Fr.A5通过反复硅胶柱层析 、重结晶等方法进行分
离 ,得到三萜皂苷 IPTS-1(35g)。化合物 IPTS-1:白
色针状结晶 , 10%硫酸 -乙醇 105 ℃加热显蓝色 ,
Liebermann-Burchard反应呈阳性;TLC对比分析
(CHCl3 -EtOAc-MeOH-H2O-HCOOH, 7∶55∶8∶4∶1)结
果表明 IPTS-1与 ilexsaponinA1对照品具有相同的
Rf值;1H-NMR(400 MHz, C5D5N)δ:6.28(1H, d, J=
7.8Hz, H-Glc-1), 5.60(1H, brs, H-12), 2.97(1H,
s, H-18), 3.39(1H, dd, J=9.2, 1.6 Hz, H-3), 1.74
(6H, s, 2×Me), 1.45, 1.30, 1.20(each3H, s, Me),
1.10(3H, d, J=6.8 Hz, Me-30)。以上波谱数据经
与文献 〔3, 4〕报道对照 , 该化合物鉴定为 ilexsaponin
A1。
2.2　IPTS-1对小鼠凝血时间(CT)〔5〕的影响　取
昆明种健康小鼠 50只 , 随机分为 5组:对照组
(NS)、阿司匹林(20 mg/kg)阳性对照组及 IPTS-1
高(100 mg/kg)、中(50 mg/kg)、低(25mg/kg)剂量
组 。分别按剂量灌胃给药 , 1次 /d,连续给药 5 d。
最后 1 d末次给药后 1 h,采用玻片法测定 CT。小
鼠眼球采血 ,于载玻片两端各滴 1滴血 ,血滴直径约
5 mm,立即用秒表计时 ,每隔 30 s用清洁大头针自
血液边缘向里轻轻挑动 1次 ,并观察有无血丝挑起 。
从采血开始至挑起血丝时间即为 CT, CT最长观察
30 min,超过 30 min不凝固的按 30 min计算 ,另一
滴血供最后复试 。数据采用 SPSS13.0软件进行单
因素方差分析处理 ,结果如表 1所示 ,毛冬青三萜皂
苷 IPTS-1高 (100 mg/kg)、中 (50 mg/kg)、低 (25
mg/kg)剂量组均能显著延长小鼠凝血时间 (P<
0.05),且作用呈剂量相关性 ,说明其具有抑制小鼠
凝血功能的作用。
　表 1　　　毛冬青三萜皂苷(IPTS-1)对小鼠
凝血时间的影响( x±s, n=10)
组别 剂量 /(mg/kg) CT/s
对照组 - 47±10
阿司匹林组 20 75±19＊＊
高剂量组 100 76±13＊＊
中剂量组 50 66±18＊＊
低剂量组 25 62±17＊
　　注:与对照组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01
2.3　IPTS-1对小鼠出血时间(BT)〔5〕的影响 　取
健康昆明种小鼠 50只 ,分组及给药方法同上 ,连续
给药 5 d。最后 1d末次给药后 1 h,采用断尾法测
定小鼠出血时间 BT。将小鼠固定 ,然后用手术剪将
小鼠尾尖 5 mm处横断 ,待血液自行溢出开始计时 ,
每隔 30 s用滤纸吸去血滴 1次 ,直至血流自然停止
(滤纸吸时无血)为止 ,即为出血时间 BT。 BT最长
观察 60min,超过 60 min仍出血的按 60 min计算。
数据处理方法同前 ,结果如表 2所示 ,与对照组比较
毛冬青三萜皂苷 IPTS-1各剂量均显著延长小鼠出
血时间(P<0.01)。
　表 2　　　　毛冬青三萜皂苷(IPTS-1)对小鼠
出血时间的影响( x±s, n=10)
组别 剂量 /(mg/kg) BT/s
对照组 - 131±29
阿司匹林组 20 328±159＊＊
IPTS-1高剂量组 100 469±127＊＊
IPTS-1中剂量组 50 384±140＊＊
IPTS-1低剂量组 25 198±40＊＊
　　注:与对照组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01
2.4　IPTS-1对小鼠耳廓微循环的影响　取健康昆
明种小鼠 50只 ,分组及给药方法同上 ,连续给药 5
d。最后 1 d末次给药 1 h后 ,麻醉小鼠 ,固定左耳 ,
用 PERIMED激光多谱勒血流仪记录小鼠耳廓微循
环的血流速度 。将各组的血流速度与对照组进行比
较。数据采用 SPSS13.0软件进行单因素方差分析
处理 ,结果如表 3所示 ,毛冬青三萜皂苷 IPTS-1低 、
中 、高各剂量均能显著加快小鼠耳廓微循环动脉血
流速度的作用(P<0.05),说明其具备一定的活血
效果 ,且呈剂量依赖性。
·766· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 34卷第 5期 2011年 5月
　表 3　　　毛冬青三萜皂苷(IPTS-1)对小鼠耳廓
微循环血流速度的影响( x±s, n=10)
组别 剂量 /(mg/kg) 血流速度 /(μm/s)
对照组 - 14±8
阿司匹林组 20 24±10＊
IPTS-1高剂量组 100 28±7＊＊
IPTS-1中剂量组 50 25±7＊＊
IPTS-1低剂量组 25 22±5＊＊
　　注:与对照组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01
2.5　IPTS-1对大鼠动脉血栓形成的影响　取 SD
大鼠 48只 ,随机分为假手术组(生理盐水)、模型组
(生理盐水)、阿司匹林(9 mg/kg)组及毛冬青三萜
皂苷 IPTS-1高(60 mg/kg)、中 (30 mg/kg)、低 (15
mg/kg)剂量组。分别按剂量灌胃给药 , 1次 /d,连续
给药 7d,末次给药 1h后 ,大鼠麻醉后剖腹 ,分离腹
主动脉段 ,用完全浸透 40% FeCl3的滤纸条 (长 ×
宽:2.0 cm×1.0 cm)环抱于腹主动脉段上 ,开始计
时 ,假手术组敷等量生理盐水滤纸片。连续观察 50
min后取下滤纸片。用游标卡尺在滤纸环抱处精确
截取 1.0 cm长血管段 ,吸干残留血液 ,称量质量 ,再
将血栓取出后 ,称量血管质量 ,前后两者相减即为该
1.0cm长血管段内血栓的质量〔6〕。将各组形成血
栓质量与对照组进行比较 ,数据采用 SPSS13.0软
件进行单因素方差分析处理 ,结果如表 4所示 ,假手
术组无血栓生成 ,模型组可见有闭塞性血栓形成 ,与
模型组比较 ,毛冬青三萜皂苷 IPTS-1各剂量组均能
显著降低大鼠腹主动脉血栓质量(P<0.05),说明
其具有抑制血栓形成的作用。
　表 4　　　毛冬青三萜皂苷(IPTS-1)对大鼠腹
主动脉血栓形成的影响( x±s, n=8)
组别 剂量 /(mg/kg) 血栓生成量 /mg
假手术组 - -
模型组 - 10.3±1.2
阿司匹林组 9 5.7±2.8＊＊
IPTS-1高剂量组 60 5.7±1.1＊＊
IPTS-1中剂量组 30 7.8±2.5＊
IPTS-1低剂量组 15 6.9±1.2＊＊
　　注:与对照组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01
3　讨论
化学成分研究表明三萜皂苷类成分是毛冬青的
主要成分之一。现代药理学研究表明 ,毛冬青提取
物及单体具有显著的心血管方面的活性。由于中药
中化学成分众多 ,得到单一的纯的化合物难度较大 ,
用于药理活性研究的化合物量不够是困扰中药药效
物质基础研究的主要症结之一。本研究充分结合了
色谱法和重结晶法的优点 ,通过相对简单的操作即
能得到高纯度的 IPTS-1单体化合物 。
凝血时间是指血液自离体至凝固所需要的时
间 ,出血时间是指穿破毛细血管 ,自出血到自然止血
所需要的时间。毛冬青三萜皂苷 IPTS-1使小鼠的
出血时间和凝血时间显著延长 ,提示其具有一定的
抗凝作用 ,其机理可能与影响凝血因子的含量 、功能
及血小板和毛细血管功能有关。
FeCl3可损伤血管 ,使血管内膜受损 ,从而激活
血小板和凝血系统 ,在损伤局部形成阻塞性栓塞。
Kurz等 〔7〕电镜观察其血栓由激活的血小板 、纤维蛋
白丝和红细胞组成 ,符合人类动脉血栓特征 ,之后被
广泛应用于抗血栓药理研究 。进一步研究表明 ,此
模型既存在血小板活化和凝血系统激活 ,也存在抗
凝和纤溶活性降低的血液病理变化〔8〕。本研究中 ,
毛冬青三萜皂苷 IPTS-1可显著抑制 FeCl3诱导血栓
形成 ,减轻血栓质量 ,推测其可能具有增强抗凝系统
和纤溶系统活性的作用 。
综上所述 ,毛冬青三萜皂苷 IPTS-1能明显延长
小鼠的凝血时间和出血时间 ,加速小鼠耳廓微循环
血流速度 ,抑制 FeCl3诱导血栓形成 ,可能为毛冬青
心血管方面药理作用的物质基础之一 ,在防治血栓
性疾病方面具有一定的应用前景 。
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