全 文 ：2010年 3月 内蒙古大学学报(自然科学版) Mar. 2010第 41卷第 2期 Journal of Inner Mongolia University Vol.41 No.2
　　文章编号:1000-1638(2010)02-0206-06
小花棘豆(Oxy tropis g labra DC.)11株内生真菌
的分离培养及鉴定＊
霍红雁 ,卢　萍 ,牛艳芳 ,吕桂芬 ,李　松 ,高　静 ,钱亚光
(内蒙古师范大学 生命科学与技术学院 ,内蒙古 呼和浩特 , 010022)
摘要:用小花棘豆(Oxy tropis g labra DC.)单株植物叶和茎切段做外植体 , 体外分离并培养内
生真菌 , 研究菌落和分生孢子的微生物形态特征 , 对培养出的内生真菌的 5.8SrDNA/ ITS 区
进行扩增及序列测定 ,序列输入 GenBank 并与已发表的小花棘豆内生真菌序列进行同源性比
对 , 并利用 DNASTAR软件包中 MegA lign 软件构建系统发育树 , 结合分子生物学及微生物学
研究推测内生真菌所属类群.结果显示:11 株小花棘豆内生真菌的菌落和分生孢子的微生物
形 态特征与埃里砖格孢属真菌Embellisiasp.L12特征一致;小花棘豆内生真菌间 ITS 1和
5.8SrDNA 区序列相同 , 与 Embellisia sp.L12 相比只有一个变异位点 , 位于 5.8SrDNA 区 ,在
ITS2区另有两个变异位点.推测小花棘豆内生真菌应与埃里砖格孢属亲缘关系密切 , 对其物
种种属分类地位还须深入研究.
关键词:小花棘豆;内生真菌;5.8SrDNA;ITS
中图分类号:Q948.12 +2.3　　文献标志码:A
　　小花棘豆(Oxy trop is glabra DC.)是豆科棘豆属多年生草本植物 ,生长在草原 、荒漠草原以及荒
漠区的低湿地 ,是轻度耐盐植物〔1-3〕.小花棘豆是毒草 ,有毒成分为苦马豆素 ,通过专一抑制溶酶体酸
性α-甘露糖苷酶和高尔基体甘露糖苷酶 Ⅱ的活性 ,引起细胞功能紊乱 ,使家畜采食后引起中毒症
状 ,组织学上表现为神经 、肝脏 、肾脏等组织器官的细胞空泡化〔4-6〕.小花棘豆可通过其根瘤菌固氮 ,
改善土壤营养状况 ,根系可防风固沙 ,对生态环境保护和可持续发展有积极作用.此外 ,小花棘豆是重
要的中药原料 ,有麻醉 、镇静和止痛等功效 ,用于关节炎 、牙痛 、皮肤瘙痒 、神经衰弱 、失眠及小鼠肉瘤
等疾病的治疗〔7-9〕.
内生真菌指生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官的细胞内部或细胞
间隙的真菌〔10-11〕.植物与内生真菌互惠共生 ,植物为内生真菌提供光合产物及矿物质 ,内生真菌的代
谢物能刺激植物生长发育 ,提高寄主植物对生物胁迫和非生物胁迫的抵抗力〔12-13〕.Vog l首次从黑麦
草 Lolium temulentum L.种子内分离出内生真菌〔14〕 , Strobel从短叶红豆杉的韧皮部分离出内生真
菌安德氏紫杉霉 Ta xomyces andreannae ,它与宿主植物能产生同一次生代谢产物紫杉醇 ,是重要的
肿瘤治疗药物〔15〕.Simmons以大蒜 A ll ium sativum 埃里砖格孢 E.all ii为模式种设立了埃里砖格孢
属Embell isia〔16〕.Braun等在两种棘豆(O.lamberti i 、O.sericea)和一种黄芪(A.mollisimus)中分离
出内生真菌 Embel li sia sp.L12 ,发现它能产苦马豆素 ,可使草食动物中毒 ,且内生真菌中苦马豆素的
含量水平与其宿主植物中苦马豆素含量水平高度相关〔17〕.卢萍等从小花棘豆的 6个地理种群部分单
＊ 收稿日期:2009-9-17;修回日期:2010-01-18
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30860049)
作者简介:霍红雁(1986-), 女(蒙古族),内蒙古乌兰浩特人 , 2007 级硕士研究生.
通信作者:卢　萍(1964-), 女(蒙古族),内蒙古海拉尔人 ,副教授 ,博士 ,硕士生导师.主要从事遗传与分子生
物学 、分子生态学等领域的研究.E-mail:luping@imnu.edu.cn.
株植物中检测出有内生真菌 ,并发现有内生真菌的植株同时也含苦马豆素 ,基本建立了内生真菌与苦
马豆素间的对应关系〔4〕.
核糖体 rRNA基因含高度保守的5.8SrDNA 及中度保守的 ITS ,5.8SrDNA 区高度保守 ,主要用
于种 、属及以上分类层次的系统学研究 , ITS 区中度保守 ,比较适合种间及种下关系的研究 ,因此 , 5.
8SrDNA/ ITS序列在真菌分子系统学的研究中被广泛使用〔18-19〕.本研究利用小花棘豆单株植物进行
体外内生真菌培养 ,并对培养出的内生真菌进行菌落和分生孢子的微生物学特征研究 ,同时提取内生
真菌菌丝体 DNA ,扩增其 5.8SrDNA/ ITS区 ,分析比对所得序列 ,结合微生物学研究结果 ,旨在确定
内生真菌所属类群 ,为研究其系统分类地位提供依据.
1　材料与方法
1.1　植物材料
选择卢萍等人野外采集的巴盟临河(BL1),鄂托克前旗(OEQ 2),乌审旗(OW1),伊金霍洛旗
(OY2)4个种群 60株小花棘豆健康个体 ,置 60℃烘箱 48h后用于内生真菌的分离培养.采样地概况
见表 1.
表 1　小花棘豆四个种群采样地
Table 1　Four sampling sites of Oxy tropis glabra DC.
种群 种群号 采样数 纬度(N) 经度(E) 海拔/m 生境
Population Pop ID Sample size La titude Long itude A ltitude Condition
巴盟临河 BL 1 15 40°48′ 107°28′ 1027 湖盆边盐碱低湿地
鄂托克前旗 OEQ 2 15 38°10′ 107°40′ 1351 轻度盐碱低湿地
乌审旗 OW1 15 38°58′ 109°07′ 1311 沙丘间低湿地
伊金霍洛旗 OY 2 15 39°19′ 109°48′ 1369 沙丘间低湿地
1.2　研究方法
1.2.1小花棘豆内生真菌的培养及其微生物学特性的研究
1.2.1.1小花棘豆内生真菌的培养　用烘干的小花棘豆单株的茎 、叶切段做外植体 ,在超净工作台内
用 75%乙醇浸泡 30s ,后转到 20%的次氯酸钠溶液中浸泡 3min ,取出并用无菌双蒸水清洗 30s ,置无
菌滤纸上吸干水分 ,接种到 1.5%水琼脂培养基上 , 25℃培养.长出真菌后在无菌条件下划线培养分
离单菌落 ,转接到 PDA 培养基.
1.2.1.2小花棘豆内生真菌微生物学特征的研究　观察培养皿中长出的真菌菌落形态 ,超净工作台
内用灭菌盖玻片轻压菌落 ,加生理盐水制片 ,显微镜下观察菌丝体形态并拍照;若观察到分生孢子 ,统
计分生孢子的长度和宽度.利用 SPSS16.0将统计的内生真菌分生孢子的宽度 、分别含 1-5个隔膜的
分生孢子的实际长度与卢萍等获得的内生真菌分生孢子的测量数据进行样本均数比较 ,分析两组分
生孢子测量数据均数间的差异显著性.
1.2.2内生真菌 5.8SrDNA/ I TS区序列扩增与分析
CTAB法提取真菌菌丝体 DNA ,0.7%琼脂糖凝胶电泳检测并在 Tanon GIS-2010 型凝胶成像
系统下照相.使用真菌特异性引物 P1/P2 对其 5.8SrDNA/ ITS 区进行 PCR扩增.P1 为正向引物 , P2
为反向引物.序列为:
P1:5 -GGAAGTAAAAG TCG TAACAAGG-3 22mer
P2:5 -G TCAAAAG TTGAAAA TGTGGCTTG-3 24mer
10μL PCR反应体系为:3μL 2×PCR master mix ,10ng 真菌菌丝体DNA ,引物 3μmo l/L ,用超纯
水补足10μL.扩增程序为:94℃预变性 3min;94℃变性 45s ,48℃复性1min ,72℃延伸30s ,30个循环;
72℃补平 5m in ,4℃保温.PCR产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测 , Tanon GIS-2010 型凝胶成像系
统照相并分析.
207第 2期 霍红雁等　小花棘豆(O xytropis g labra DC.)11株内生真菌的分离培养及鉴定
内生真菌的 5.8SrDN A/ ITS 区扩增产物送由上海生工工程有限公司纯化并进行序列测定 ,所得
序列与GeneBank中 5.8S rDNA/ ITS 序列进行同源性比对 ,并利用 DNASTAR软件包中 Editseq ,
得到完整的 5.8SrDNA/ ITS 区 ,再用 MegA lign软件构建系统发育树 ,设麦根腐平脐蠕孢 B ipolaris
sorokiniana BS11为外类群.
2　结果分析
2.1　小花棘豆内生真菌的培养与微生物学研究
卢萍〔4〕等在分子水平上检测出这四个种群 60株小花棘豆中感染内生真菌的有 42株 ,总体样品
的感染率达 70%,其中各种群的感染率情况存在一定差异 ,数据分别为:BL1 为 93%, OY2 为 73%,
OEQ 2 为80%,OW1为 33%.除去卢萍等分离培养出的 8株(OY2 20 , OY2 21 ,OW1 25 ,OW1 2 ,OEQ2 2 ,
O EQ 2 6 , BL1 11 ,BL 1 17),将剩下的 52株小花棘豆进行内生真菌的体外培养 ,分离出了 11株小花棘
豆内生真菌 ,分别为:OY 2 2 ,OEQ 2 1 , OEQ 2 3 ,OEQ 2 28 ,OW1 15 ,OW1 22 ,BL 1 2 , BL1 10 ,BL1 20 ,BL1
23 ,BL1 25.总体样品的分离率达 21%,各种群的分离率情况分别为:BL 1 为 38%,OY 2 为 8%,OEQ 2
为 23%,OW1 为 15%.体外培养出的内生真菌菌落呈白色 ,菌体分泌黑褐色的色素物质 ,使得白色菌
落变灰直至灰黑色.图 1中的 a 、b 、c 为内生真菌初期 、中期 、后期形态 ,拍照时间分别为转接后第 20
天 、38天 、56 天.其中 4 株内生真菌 BL12 , BL123 , OEQ 2 28 , OW122先后长出分生孢子 ,结孢率占
36%,无菌条件下制片后于 Motic BA200显微镜下拍照 ,放大倍数为 10×40倍 ,标尺 10μm.分生孢
子长椭圆形或近圆柱形 ,有宽厚且颜色较深的横隔膜 ,隔膜数为 1-5个(见图 2).用 Motic Images Ad-
vanced 3.2测量分生孢子的长宽 ,显示长度为 20.81-69.71μm ,宽度为 5.55-11.96μm.SPSS16.0 统
计分析结果显示:两组分生孢子宽度以及含有 1-5个隔膜的实际长度间差异均不显著(p>0.05)(见
表 2).菌落及分生孢子形态特征与真菌子囊菌门(Ascomycota)、腔菌纲(Leculoascomycetes)、格孢腔
菌目(P leosporales)、格孢腔菌科(P leosporaceae)的埃里砖隔孢属(Embel li sia sp.)的特征一致.
图 1　小花棘豆内生真菌菌落
Fig.1　Colonies of endophy tic fungus from O xy tropis glabra DC.
图 2　小花棘豆内生真菌分生孢子
Fig.2　Conidia of endophy tic fungus fr om Oxytrop is g labra DC.
208 内蒙古大学学报(自然科学版) 2010年
表 2　比较组与实验组分生孢子长度和宽度的均数差异显著性分析
Tabel 2　Means of difference significant analyses of conidiophores between the
comparision group and experimental group.
宽度(μm) 长度(μm)
1 个隔膜 2 个隔膜 3个隔膜 4个隔膜 5 个隔膜
比较组 8.67±1.29 24.20±4.20 37.72±5.22 47.39±7.61 53.25±13.74 60.42±7.48
实验组 8.82±1.72 25.37±3.84 39.12±6.95 45.15±7.55 57.22±6.89 62.19±5.29
P 0.755 0.47 0.515 0.385 0.524 0.694
比较组:卢萍等得到的分生孢子测量数据;实验组:本研究得到的分生孢子测量数据
2.2　内生真菌总 DNA 5.8S rDNA/ ITS 区的序列扩增与分析
　　用引物 P1/P2从 11株小花棘豆内生真菌菌丝体 DNA中均扩增出长度约 500bp的 5.8SrDNA/
ITS片段 ,见图 3.图中 M 为 1kb PlusDNAMarker;1-11为 11株内生真菌 DNA 扩增结果.
图 3　小花棘豆内生真菌 5.8S rDNA/ ITS 序列扩增结果
Fig.3　Amplification of 5.8SrDNA/ ITS sequences f rom endophy tic fungus of Oxy tropis glabra DC.
　　11株小花棘豆内生真菌 5.8SrDNA/ I TS区扩增产物经纯化进行测序 ,序列全长为 517bp.11个
序列中 ITS1及 5.8SrDNA 区的序列完全一致 ,与 Embell isia sp .L12相比有一个变异位点 ,在第 227
位碱基 ,位于 5.8S rDNA 区 ,小花棘豆内生真菌中为 T , Embel li sia sp.L12中为 A;ITS2区有 2个变
异位点 ,分别位于第 511和 517位.与卢萍等测得的10株小花棘豆内生真菌的5.8SrDNA 序列一致 ,
ITS1也相同 ,而在 ITS2区有两个变异位点 ,位于第 511和 517位.MegAlign软件构建的系统发育树
见图 4.
图 4　小花棘豆内生真菌 5.8S rDNA/ ITS 系统发育树
F ig.4　Phylogenetic tree of 5.8S rDNA/ ITS endophy tic fungus f rom Oxy tropis g labra DC.
209第 2期 霍红雁等　小花棘豆(O xytropis g labra DC.)11株内生真菌的分离培养及鉴定
3　讨论
　　传统的真菌分类学研究主要通过比较菌落形态 、菌丝体及分生孢子等特征来界定真菌的分类地
位以及不同种属之间的亲缘关系.由于生长于植物内部的内生真菌营养需求复杂 ,很难在体外模拟其
生活环境 ,大多内生真菌在人工培养基中很难生长 ,且培养出的内生真菌中极少数能产分生孢子 ,从
而给真菌的鉴定和分类带来了困难.然而生物体的核苷酸序列组成不受任何变化的环境条件的影响 ,
目前核糖体 rRNA 基因的研究是真菌 DNA序列研究的重点 ,其中 5.8SrDNA/I TS区段可在种属及
以下分类阶元上对真菌进行分子鉴定 ,可弥补传统分类学方法的不足 ,并互为佐证〔18-20〕.
Simmons等〔16〕 、陈伟群等〔21〕 、Braun等〔17〕对 Embel l isia 真菌的特征进行了描述 ,本研究分离培
养出的11株小花棘豆内生真菌的菌落及分生孢子的形态特征与上述对 Embell isia的研究结果一致.
分离到的小花棘豆内生真菌分生孢子与卢萍等分离的小花棘豆内生真菌分生孢子以及Braun等分离
的 Embell isia sp .L12的分生孢子数据非常接近.文献中未提供 Embel li sia sp.L12分生孢子的具体
数值而未做统计学分析 ,所以只对前两组分生孢子的宽度及实际长度进行均数差异显著性比较 ,结果
表明两组数据间差异不显著.
　　小花棘豆内生真菌 5.8S rDNA/ ITS 系统发育树显示 ,所有小花棘豆内生真菌都与 Embel lisia
sp .L12聚为一支 ,表明 21株小花棘豆内生真菌与 Embel li sia sp .L12亲缘关系较近 ,其中卢萍测得
的 10株小花棘豆内生真菌序列完全相同 ,与 Embel lisia sp .L12相比只在 5.8S rDNA区有一个变异
位点 ,先聚在一起;本研究所得 11株内生真菌中 OEQ228的序列与卢萍的 10株内生真菌序列相同 ,
BL1的 5株内生真菌间的 5.8S rDNA/ ITS 序列相同 ,与卢萍的 10株内生真菌序列相比在 ITS2区有
2个变异位点;其余 5株内生真菌序列相同 ,与上述 16 株内生真菌序列相比 ,仅在 ITS2区有 1个变
异位点;所有供试菌株与 Embel lisia sp.L12在 5.8S rDNA 区只有 1 个碱基的差异 ,而在 ITS2区也
仅相差 1-2个碱基 ,反映在系统发育树上没有明显分支.外类群 Bipolaris sorok iniana BS11独自聚
为一支.巴盟临河与鄂托克前旗种群的生境都为盐碱低湿地 ,在系统发育树上表现为相距较近;乌审
旗和伊金霍洛旗种群植物生境都为沙丘间低湿地 ,系统发育树中也显示相距较近 ,推测可能与不同地
理来源有关 ,今后可增加样本深入研究.结合内生真菌微生物学特性及 5.8SrDNA/ ITS 序列分析结
果 ,认为小花棘豆内生真菌与 Embel li sia亲缘关系密切 ,对其种属分类地位还需继续探讨.
另外 ,苦马豆素在医药领域有很高的应用价值 ,作为研究糖蛋白 N-寡糖合成的工具药以及颇具
潜力的抗癌药物而引起广泛关注 ,具有直接杀伤肿瘤细胞和免疫调节的双相作用〔22〕.卢萍等人在分
子水平上检测出有内生真菌的小花棘豆单株植物都测出苦马豆素 ,没有内生真菌的单株植物都未测
出苦马豆素 ,由此推测宿主植物含苦马豆素与内生真菌的存在有关〔4〕.内生真菌与苦马豆素相关性的
研究对小花棘豆的治理 、开发利用及改良可提供基础数据 ,对内蒙古草原生态环境保护 、建设与可持
续发展也有积极意义.今后可对培养出的内生真菌进行苦马豆素提取及测定 ,深入探索内生真菌与苦
马豆素的关系 ,为筛选产苦马豆素菌株及其在医药化工领域的应用奠定基础.
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(责任编委　杨　持)
Isolation ,Culture and Identification the 11 Endophy tic Fungus
f rom Oxy tropis glabra DC .
HUO Hong-yan ,LU Ping ,NIU Yan-fang , L Gui-Fen ,LI Song ,
GAO Jing ,QIAN Ya-guang
(College of L i fe Science and Technology , Inner Mongolia Normal Universi ty ,
Hohhot 010022 ,China)
　　Abstract:Leaves and stems w ere cut f rom individual plants of Oxytropis glabra DC., and used
as materials to isolate and culture the endophyt ic fungus in vit ro.The m icrobiolo gical mo rpholo gy o f
colony and the conidiopho re w ere invest igated.The 5.8SrDNA/ ITS of the in vi tro cultured endo-
phyt ic fung i w ere sequenced , and then the sequence data o f the endophy tic fungi were submitted to
GenBank and analysed by homologous blast.The phylog enetic tree w as const ructed by M egAlign o f
DNASTA R sof tw are package.The molecular biological and microbiological characters we re investi-
gated in o rder to predict the classi ficat ion of the endophy tic fungi.The resul ts indicated that the
mo rphologic characteristics of the co lony and conidiopho re o f this 11 endophy tic fungi we re the same
as that of Embell isia sp.L12.The sequences o f ITS1 and 5.8SrDNA of endophy tic fungus f rom
Oxy tropis g labra DC.were totally the same.Compared to the sequence of Embel li sia sp.L12 , there
w as only one viriation si te w hich was in the 5.8SrDNA region in each sequence.In addition , tw o
variation sites were show n in the ITS2 region.It w as presumed that the endophy tic fung i had a close
relationship to Embel li sia , but the classi ficat ion of the endophy tic fungi need further research.
　　Key words:Oxy tropis g labra DC.;Endophy tic Fungi;5.8S rDNA;ITS
211第 2期 霍红雁等　小花棘豆(O xytropis g labra DC.)11株内生真菌的分离培养及鉴定