全 文 ：第 2 2
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卷 第 2期年 4月 西北农业大学学报 A e ta Un iv .A盯 ie .B Oa e r l i一 e e id n e ta l is
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19 9 4
甘肃棘豆对山羊精子形范环咦瑞酷构的黝向“
丁伯 良 王建辰
(西北农业大学兽医系 ,陕西杨陵 · 7 1 2 1 0 0)
摘 要 对 6 只 10 月龄西农莎能奶山羊公羊按每日 10 9 / ( k g · d) 的剂量单笼饲喂甘肃
棘豆粉 , 18 d 后陆续出现中毒症状 ,精子呈现不同程度的损害 : 密度下降 (最低达 12 亿 /
m L )
, 畸形率高达 29 % , 电镜负染色法观察其超微结构 , 发现精子顶体膨胀 、 半脱或全脱 ,尾
梢松散 ; 中毒精子顶体完整率 ( 27 . 5写 )明显低于正常精子 (7 1 . 75 % ) ; 用电镜超薄切片法观察
精子的超微结构表明 , 细胞核 、 顶体及尾部中段线粒体空泡变性 ,细胞膜 、 顶体外膜及中段线
粒体鞘扩张或断裂 。
关键词 甘肃棘豆 ,精子 ,顶体 , 线粒体 ,负染色 ,超薄切片技术 ,超徽结构
中图分类号 5 8 5 9 . 8 , 5 8 5 8 . 2 6 0 . 7一7 , 5 8 5 6 . 9
甘肃棘豆 (O xy torP is K o ns ue o is B u ng e )是豆科棘豆属的一种多年生草本植物 , 他是
我国西北部牧区危害最严重的一种毒草 ,能引起羊 、 马等家畜中毒.1[ z] ,严重阻碍牧区畜牧
业的发展 。 美国学者将棘豆属 (o xy t r op is s P P . )和黄蔑属 ( A st ar g al us SP P )有毒植物统称
为 疯 草 ( L o e o w e e d ) . S h u p e , J a m e s , P a n t e r 〔 ,一 , ] 曾 报 道 了 斑 英 黄 蔑 ( A s t ar g a l u s
le 川咭认 os su )对公绵羊性欲与生育力的影响以及对生殖器官的损害 , 其中包括精子生成减
少和畸形精子的产生 。 但关于甘肃棘豆对山羊精子的影响 ,迄今国内尚未见报道 ,本研究
采集山羊甘肃棘豆中毒后的精子 ,应用精液品质的常规检查 , 电镜负染色和超薄切片技
术 ,观察西农莎能奶 山羊中毒后精子的密度 、 畸形率以及超微结构 ,并对顶体的损害情况
进行统计和分类 。
1 材料和方法
1
.
1 试验公羊的选择
由陕西省千阳县种羊场选购西农莎能奶山羊公羊 10 只 , 年龄 3 0 . 4士 4 . 13 d ,体重
30
.
1士 2 . 4 7 k g , 实验前适应饲养 40 d , 并进行临床与精液品质检查 , 视为健康后随机分
为试验组 ( , : 一 6) 和对照组 (。 一 4 ) 。
1
.
2 甘肃棘豆的采集与加工
1 9 9 1 年 9 月采 自甘肃省天祝县打柴沟乡 ,晾干后粉碎 ,备用 .
1
.
3 毒草饲喂方法
试验羊采用单笼饲养 , 甘肃棘豆粉按每 日 10 9 / k( g · d) 的剂量与 3 50 9 混合精料加
水混匀 , 自行采食完毕 ,再给予青干草 ;对照羊群养在一个羊舍内 ,每只羊每日饲喂 35 0 9
混合精料及充足的青干草 ,两组羊均 自由饮水 .
收稿日期 : 1 9 92 一 0 6一 3 0 ·
* 高等学校博士点荃 金资助项 目 .
第 2期 丁伯良等 :甘肃棘豆对山羊精子形态和超徽结构的影响 45
1
.
4采精时间与方法
采精均在配种季节 (1 1 9 9年 1 1 ~2 1月 )进行 。 试验前两组羊各采精 3次 ,试验开始头
14 d
, 每周采精 1 次 , 第 14 d 后每隔 3 d 采 1次 ,直至第 3 8 d( 因中毒严重 ,性欲减退 , 难
以采精 ) ,均采用假阴道法采精 。
1
.
5 精液品质的常规检查
1
.
5
.
1 崎形精子的检查 取少量精液 ,迅速抹片 ,经美蓝染色后 ,在 6 40 倍高倍镜下观察
精子畸形率 ,每张抹片观察精子 5 0 个 ,并计算畸形精子百分率 。
1
.
5
.
2 精子密度的检查 用血细胞计数板计算精子数 。
1
.
6 鲜精原液负染法
将采集的鲜精原液及时用 1 m L 卡介苗注射器吸取少许 ,滴 1 滴于悬空的铜网载膜
上 ,吸去多余精液 ,用 2%磷钨酸负染液 ( p H 6 . “ )重复负染 3 次 , 吸去多余负染液 ,将制好
的铜 网放入平皿内 自然干燥 , 用 H IT A C H I一 6 0 1 型透射电镜在 75 k V 下观察和照像 。
1
.
7 精子的电镜标本制作法
将采集的精液 ,用琼脂预包埋法 s[] 处理 , 电镜常规脱水 , E p on 8 12 包埋 , L K B Z o 8 8 v 型
超薄切片机切片 ,醋酸铀与柠檬酸铅双染色 , 用 J EM 一 2 0 0 0 1 型透射 电镜在 80 k v 下观察
与照像 。
2 结 果
2
.
1 精子计数
试验组精子数 自饲喂毒草起至第 14 d 处于正常范围 , 第 18 d 后逐渐下降 ,到第 38 d
降至 12 亿 /m L ,与对照组 比较差异极显著 (尸 < 0 . 01 )( 附图 ) 。
下 2 5
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已·阅一\抓串半
14 1 8 2 2 2 6
天数 d/
3 0 3 4 3 8
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14 18 2 2 2 6 3 0 3 4 3 8
天数 / d
附图 试验羊与对照羊精子数和精子畸形率分布
1
. 对照组 ; 2 . 试验组
2
.
2 精子崎形观察
试验组精子畸形率自饲喂毒草起至第 18 d 仅达 12 . 5% , 第 18 d 后逐渐上升 ,至第
38 d 高达 29 . 5% ,与对照组 比较差异极显著 (尸 < 0 . 0 1 )( 附图 ) 。
4` 西北农业大学学报 第 2卷
2
.
3精子负染后电镜观察
2
.
3
.
1正常精子 根据 02个精子的测定结果 ,西农莎能奶 山羊精子头部的长度为 7 . 75
( 7
.
7 1~ 8
.
2 9 ) 拜m , 宽度为 4 . 0 9 ( 3 . 7 1一 4 . 5 7 ) 拌m ,尾长为 6 6 . 2 8 ( 5 3 . 5 6一 8 5 . 4 4 ) 拜m ,总长
度为 7 4 . 0 3 拼m .
2
.
3
.
2 异常精子 奶 山羊甘肃棘豆中毒后产生的精子 , 其形态极为异常 , 主要表现为 :
①顶体变化 多数精子顶体表现膨胀 (图版 1 ) ,半脱落或全脱落 (图版 2 ) ,顶体外膜
一侧性或两侧对称性脸起 。
②颈部变化 有的精子头颈部完全脱离 ,颈部从植入窝脱出 ,有的头颈几乎脱离 ,仅
靠尾部中段轴丝连接 (图版 3 ) 。
③尾部变化 尾部中段线粒体螺旋圈排列紊乱 ,有的出现空泡变性 ,尾部末稍由正常
紧密的一束变为松散零乱的扫帚状 (图版 4 ) 。
2
.
3
.
3 精子顶体变化的分类 顶体从正常到中毒后发生损伤可表现多种形态 ,本研究通
过正常精子和中毒精子 (饲 喂甘肃棘豆 38 d) 各 80 个的对比观察 ,基本搞清了顶体从正
常到轻微膨胀 、 严重膨胀 、 部分脱落和全部脱落全过程 , 为定量研究精子顶体完好和损伤
的程度 ,将其形态分为 4 类 (表 1 ) 。
①正常顶体 整个精子外形正常 ,轮廓清晰 , 顶体形态正常 .
②顶体微膨 精子外形基本正常 ,顶体轻度膨胀 ,顶体层疏松 。
③顶体膨胀 顶体严重膨胀 , 表现凹凸不平 ,膜和顶体层相当疏松 。
④顶体半脱或全脱 顶体开始脱落 ,但顶体内某些部分仍和核膜连结 , 或顶体全部脱
落 , 仅存留光秃的头部 。
表 1 正常精子和中毒精子顶体类型分布
样 品 统计数 各类精子所占 比例 ( 肠 )① ② ③ ④
对照精子
中毒精子
8 0 0
吕0 0
74
。
7 5
2 7
.
5 0
1 6
.
5
3 6
.
5
6
.
3 8
2 3
。
00
2
.
3 7
1 2
。
0 0
2
.
4 精子超微结构观察
2
.
4
.
1 精子 头部超徽病变 细胞核严重空泡变性 (图版 5) ,形态极不规则 ,其外膜膨胀
或断裂 ;有的细胞核明显皱缩 ,有的胞核及核后环高度扩张 ,形成较大的空腔部位 。原生质
膜明显扩张 ,有的呈一侧性扩张 ,而多数呈两侧对称或不对称性扩张 (图版 6 ) ;顶体部分
空泡变性 ,在赤道板 以上某一部分 ,顶体外膜原有位置被一些大小不等的空泡取代 , 有的
原生质膜和顶体外膜融合形成空泡 (图版 7 ) 。
2
.
4
.
2 精子尾部超徽病变 尾部中段线粒体严重空泡变性 ,大小不等空泡几乎取代整个
线粒体 ,有的线粒体排列紊乱 , 甚至残缺不全 , 其岭部分或全部消失 , 中央微管和外周微管
模糊不清 ,外周致密纤维电子密度下降乃至消失 ,线粒体鞘膜扩张甚至消失 (图版 8 ) ; 有
的原生质膜脱离 ,剩下光秃的线粒体 。
4` 西北农业大学学报 第 2卷
2
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3精子负染后电镜观察
2
.
3
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1 正常精子 根据 0 2个精子的测定结果 ,西农莎能奶 山羊精子头部的长度为 7 . 75
( 7
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7 1~ 8
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2 9 ) 拜m , 宽度为 4 . 0 9 ( 3 . 7 1一 4 . 5 7 ) 拌m ,尾长为 6 6 . 2 8 ( 5 3 . 5 6一 8 5 . 4 4 ) 拜m ,总长
度为 7 4 . 0 3 拼m .
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2 异常精子 奶 山羊甘肃棘豆中毒后产生的精子 , 其形态极为异常 , 主要表现为 :
①顶体变化 多数精子顶体表现膨胀 (图版 1 ) ,半脱落或全脱落 (图版 2 ) ,顶体外膜
一侧性或两侧对称性脸起 。
②颈部变化 有的精子头颈部完全脱离 ,颈部从植入窝脱出 ,有的头颈几乎脱离 ,仅
靠尾部中段轴丝连接 (图版 3 ) 。
③尾部变化 尾部中段线粒体螺旋圈排列紊乱 ,有的出现空泡变性 ,尾部末稍由正常
紧密的一束变为松散零乱的扫帚状 (图版 4 ) 。
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3 精子顶体变化的分类 顶体从正常到中毒后发生损伤可表现多种形态 ,本研究通
过正常精子和中毒精子 (饲 喂甘肃棘豆 38 d) 各 80 个的对比观察 ,基本搞清了顶体从正
常到轻微膨胀 、 严重膨胀 、 部分脱落和全部脱落全过程 , 为定量研究精子顶体完好和损伤
的程度 ,将其形态分为 4 类 (表 1 ) 。
①正常顶体 整个精子外形正常 ,轮廓清晰 , 顶体形态正常 .
②顶体微膨 精子外形基本正常 ,顶体轻度膨胀 ,顶体层疏松 。
③顶体膨胀 顶体严重膨胀 , 表现凹凸不平 ,膜和顶体层相当疏松 。
④顶体半脱或全脱 顶体开始脱落 ,但顶体内某些部分仍和核膜连结 , 或顶体全部脱
落 , 仅存留光秃的头部 。
表 1 正常精子和中毒精子顶体类型分布
样 品 统计数 各类精子所占 比例 ( 肠 )① ② ③ ④
对照精子
中毒精子
8 0 0
吕0 0
74
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7 5
2 7
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5 0
1 6
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5
3 6
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3 8
2 3
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00
2
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3 7
1 2
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0 0
2
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4 精子超微结构观察
2
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4
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1 精子 头部超徽病变 细胞核严重空泡变性 (图版 5) ,形态极不规则 ,其外膜膨胀
或断裂 ;有的细胞核明显皱缩 ,有的胞核及核后环高度扩张 ,形成较大的空腔部位 。原生质
膜明显扩张 ,有的呈一侧性扩张 ,而多数呈两侧对称或不对称性扩张 (图版 6 ) ;顶体部分
空泡变性 ,在赤道板 以上某一部分 ,顶体外膜原有位置被一些大小不等的空泡取代 , 有的
原生质膜和顶体外膜融合形成空泡 (图版 7 ) 。
2
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4
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2 精子尾部超徽病变 尾部中段线粒体严重空泡变性 ,大小不等空泡几乎取代整个
线粒体 ,有的线粒体排列紊乱 , 甚至残缺不全 , 其岭部分或全部消失 , 中央微管和外周微管
模糊不清 ,外周致密纤维电子密度下降乃至消失 ,线粒体鞘膜扩张甚至消失 (图版 8 ) ; 有
的原生质膜脱离 ,剩下光秃的线粒体 。
西北农业大学学报 第 2卷
3讨 论
1 )负染色法是一项新颖而有前景的技术 ,它 已广泛应用于病毒学和微生物学研究领
域 , 并已发展成为具有分子水平的染色技术 ,在研究精子方面 , 由于该方法制备简便 ,能避
免制备过程中对顶体造成的人工损伤 ,并能迅速地把完整精子群象呈现出来 , 以便统计分
析 ,故前人 .7[ 8〕曾用负染法观察绵羊冷冻精子在不同阶段的顶体损伤 , 以顶体完整率评价
精液品质 。本研究采用此法初步确定了西农莎能奶山羊正常精子的大小 ,其头部长度与宽
度略高于绵羊精子 8[] , 但略低于公牛精子 9j[ , 并用负染法首次观察了公羊甘肃棘豆中毒后
其精子顶体受损状况及顶体完整率的统计 ,结果表明 , 甘肃棘豆能严重损害公羊精子 , 主
要表现顶体膨胀 、 半脱和全脱 ; 通过正常精子与中毒精子的对 比观察发现 , 正常精子的顶
体完整率为 74 . 75 % ,而中毒精子仅达 29 % ,两者差异极显著 (尸 < 0 . 0 1 ) 。
2) 精子顶体在受精过程中起着举足轻重的作用 ,它含有许多水解酶如顶体素 、 透明质
酸酶 ,穿冠酶等 ,这些酶通过顶体反应 , 由质膜与顶体外膜融合而产生的孔隙而释放 , 释放
出来的透 明质酸酶 , 能驱散包于新排出的卵子外围的卵丘细胞 ,而穿冠酶用于精子穿透卵
子放射冠 ,顶体素又是一种蛋 白酶 ,为精子穿过透明带消融出一条通道 。 本试验已观察到
皋丸和附皋的严重受损 (另文报道 ) ,致使精子生成减少或形成畸形精子 。 由于顶体异常 ,
使许多水解酶活性降低或完全消失 ,阻碍了精子与卵子的结合 ,这是甘肃棘豆引起公羊不
育的重要原因之一 。
3) 精子负染法有其观察完整精子之特色 , 但由于受其方法本身的限制 , 它难以观察到
精子的剖面结构 ,更不易指示精子的细微变化 。 为此 , 本研究还进行了精子超薄切片的观
察 ,结果发现 , 中毒精子头部与尾部中段严重受损 ,呈现细胞核原生质膜扩张 、 胞核变形或
空泡变性以及尾部中段线粒体空泡变性等超微病变 。 本文所描述的精子超微病变与 吕兆
启等人 〔10] 报道的有相同之处 ,但根本区别在于前人主要是研究冷冻对家畜精子的影响 ,
而本研究纯系甘肃棘豆对 山羊精子的损害 。
4 )在电镜下能观察到精子头尾分离或即将分离现象 ,这是精子结构异常较严重的一
种表现 ,常称之为断头精子缺陷 。 据报道 l1[ 〕 ,这种头尾分离不是由于头尾连接错误就是 由
于在生精的最后阶段鞭毛发育时近端中心粒位置异常造成 . 本研究已揭示甘肃棘豆对肇
丸曲细精管生精上皮和附皋管上皮的损害 (另文报道 ) , 由于精子在皋丸 内生成或在附皋
内成熟过程发生障碍 ,使硫氢基难以氧化成二硫键 , 导致鞭毛发育受阻 , 造成头尾分离现
象 。
5) 空泡变性是疯草中毒最典型的病理变化 ,前人 l[ ’ 一 ’ ` 〕都已报道了神经细胞与各实质
器官细胞空泡变性 ,本研究通过电镜首次观察到奶山羊甘肃棘豆中毒精子细胞空泡变性 ,
这种空泡变性归属于水泡变性 ,主要是由于细胞溶酶体内积聚大量低聚糖所致 ,这种低聚
糖在正常情况下是由一种溶酶体水解酶— 甘露糖昔酶所水解 , 当毒素抑制该酶活性后 ,引起低聚糖大量堆积 ,致使细胞内空泡大量形成 ,最终导致细胞功能紊乱 。
致谢 : 本研究承蒙甘肃省天祝县畜牧兽医中心王英东兽 医师 、西北农大兽医系王英珍高级实验师和西北农大配种
站张三余同志的大力帮助 , 在此一并致谢 。
第 2期 丁伯 良等 :甘肃棘豆对山羊精子形态和超徽结构的影响 4 9
参 考 文 献
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H o f f m a n K
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T h e e f f ec
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H a r t l e y W J
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E f f e e t s o f o 卿 t r oP i s K a n s u e n s i s U p o n t h e
U l t r a s t r u e t u r e o f D a i r y G o a t S P e r m
D i n g B o l i a n g
(刀已户a 雌m o n t of V `娜 i n a 即 S c￡, n c ` . N喇 h , ` s t e r 。
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1 0 9 / k g o f d r i e d a n d g r o u n d o 刁 t r oP i s K a n s u e ,: 5 15 p e r d a y . A f t e r t h e 1 8 t h d a y , t h e b i l l y
g o a t s a p P e a r e d t o h a v e t o x ie s y m p t o m s i n s u e e e s s i o n : a n d t h e i r s P e r m s s h o w e d s o m e
d a m a g e i n d i f f e r e n t d e g r e e s
.
S p e r m d e n s i t y d e e r e s a e d ( t h e m i n im u n d e n s i t y w a s 1
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T h e p e r e e n t a g e o f a b n o r m a l s p e r m s r e a e h e d a s h i g h a s 2 9 %
.
T h e e l e e t r o n m i
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e r o s e o P i c e x a m i n a t i o n o f u l t r a s t r u e t u r e o f s P e r m s w a s e a r r i e d o u t u s i n g n e g a t i v e s t a i n in g
t e e h n i q u e s h o w e d t h e e h a n g e s i n m o r p h o l o g y o f a e r o s o m e
,
b e i n g s w o l le n
,
p a r t i a l l y d e
-
t a e h e d a n d d e t a eh e d a n d l o o s e s p e r m t a il e n d
.
T h e p e r e e n t a g e o f a e r o s o m a l i n t e g r i t y o f
t o x i e s p e r m s (2 7
.
5 % ) w a s s ig n i f ie a n t l y l o w e r t h a n t h a t o f n o r m a l s p e r m s in t h e e o n t r o l
(7 1
.
7 5纬 ) . T h e e l e e t r o n m i e r o s e o p i e e x a m i n a t i o n o f u l t r a s t r u e t u r e o f s p e r m w a s e a r r i e d
o u t u s i n g u l t r a m i e r o t o m y s h o w e d t h e v a e u o l a t i o n o f e e l l n u e l e i
,
a e r o s o m e a n d m e d i u m
m i t o e h o n d r i a o f t a i l e n d
,
d i la t i o n a n d b r e a k o f e e l l m e m b r a n e
,
a e r o s o m e o u t s id e m e m
-
b r a n e a n d m e d i u m m it o e h o n d r i a s h e a t h
.
K e y w o rd s o 勺 t r op is K a n s u e n s i s , s P e r m , a e r o s o m e , m i t o e h o n d r i a , n e g a t i v e s t a in -
i雌 , u l t r a m i e r o t o m y , u l t r a s t r u e t u r e