全 文 ： 2008, Vol. 29, No. 11 食品科学 ※工艺技术294
夏枯草叶熊果酸超临界流体萃取工艺的研究
蒋盛岩，赵良忠，余有贵，段林东，谭宝秀
(邵阳学院生物与化学工程系，湖南 邵阳 422000)
摘 要：采用超临界二氧化碳流体萃取技术，提取夏枯草叶中的熊果酸，并用高效液相色谱法测定萃取物中熊果
酸含量。通过正交试验 L9(34)对萃取条件进行优化，确定适宜的工艺参数。结果表明，夏枯草叶熊果酸超临界 CO2
萃取的各因素影响程度为：萃取温度＞萃取时间＞携带剂＞萃取压力。最佳参数为萃取温度 30℃，萃取压力
15MPa，携带剂甲醇:乙醇 =1:1，萃取时间 90min。
关键词：超临界二氧化碳萃取；夏枯草；熊果酸；高效液相色谱
Study on Optimization of Supercritical Fluid Extraction Conditions of Ursolic Acid
from Prunella vulgaris Linn. Leaves
JIANG Sheng-yan，ZHAO Liang-zhong，YU You-gui，DUAN Lin-dong，TAN Bao-xiu
(Department of Biological and Chemical Engineering, Shaoyang University, Shaoyang 422000, China)
Abstract：The supercritical carbon dioxide fluid extraction technology of ursolic acid from Prunella vulgaris Linn. leaves was
studied, and the extraction conditions were optimized by using the orthogonal test L9(34). The content of ursolic acid in Prunella
vulgaris extract were determined directly by high performance liquid chromatography (HPLC). Results showed that the order
of the factors affecting the extraction rate of ursolic acid is extraction temperature ＞extraction time ＞entrainer composition ＞
extraction pressure, and the optimal extraction conditions are as follows: extraction temperature 30 ℃, pressure 15 MPa,
methanol-ethanol 1:1 as entrainer and extraction time 90 min.
Key words：supercritical CO2 extraction；Prunella vulgaris Linn. ；ursolic acid；HPLC
中图分类号：O658.2 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2008)11-0294-04
夏枯草(Prunella vulgaris Linn.)为唇形科夏枯草属植
物，因“夏至后即枯”得名，是常用传统中药之一，
有多种药效[1-5]。近年来医药行业对夏枯草的需求越来越
大，同时夏枯草作为一种蔬菜也越来越受到人们的重
视。人们对夏枯草的成分做了一些研究，占昌友等采
用二氧化碳超临界萃取夏枯草中的成分，得到夏枯草皂
苷 A 等 14 种化合物[6] ；刘淑娟等以 90％的乙醇为提取
剂提取夏枯草中的熊果酸，得到熔点为 280～284℃的熊
果酸晶体[7] ；刘秀梅等采用 65％乙醇，以芦丁为指标，
用薄层色谱法对夏枯草中的芦丁含量进行了测定[8] ；李
晓蒙等采用薄层色谱法，对夏枯草中熊果酸的含量进行
了测定 [ 9 ]。本实验以湖南邵阳的野生夏枯草为实验材
料，采用超临界二氧化碳流体萃取技术，对影响夏枯
草叶中熊果酸提取的主要因素进行正交试验，优选提取
条 件 。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
夏枯草，采于湖南邵阳。
无水乙醇(化学纯) ；无水甲醇(色谱纯) ；熊果酸对
照品 湖南省邵阳市药品研究所。
N2000 高效液相色谱仪系统 北京温分分析仪器技
术开发有限公司；超越 2000 色谱工作站 浙江大学智
能信息研究所；超临界 CO2 萃取装置 南通市飞宇石油
科技开发有限公司；TGL-16M 高速台式离心机 长沙湘
仪离心机仪器有限公司；FSJ-114 植物标本粉碎机 牧
渔业扶沟科技仪器厂。
1.2 对照品溶液的制备
精密称取熊果酸对照品 14.40mg，置 10ml 容量瓶
收稿日期：2008-07-10
基金项目：邵阳学院资助项目(2007B20)
作者简介：蒋盛岩(1967-)，男，副教授，主要从事生物技术研究。E-mail：Jiangsyan2001@163.com
295※工艺技术 食品科学 2008, Vol. 29, No. 11
中，用甲醇定容至刻度，摇匀，得浓度为 1.440mg/ml
的对照品Ⅰ液。取对照品Ⅰ液 1.0ml 置 10ml 容量瓶中，
以甲醇定容至刻度，摇匀，得浓度为 0.144mg/ml 对照
品Ⅱ液。
1.3 标准曲线的绘制
分别精密吸取对照品Ⅱ液 2.0、5.0、10.0、15.0 、
20.0、25.0μl 进样，按下列色谱条件进样测定：色谱柱
Nucleosil-CN分析柱(4.6mm×250mm×50mm) ；流动相:
无水甲醇；流速:1.0ml/min；检测波长： 220nm；柱温:
室温。以进样量(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制
标准曲线。
1.4 精密度实验
精密吸取对照品Ⅱ液，重复进样 5 次，每次 5 μ l，
测定峰面积，进行精密度实验。
1.5 加样回收率实验
精密吸取已测知浓度的供试品溶液 500μl，精密加
入熊果酸对照品溶液(1 .44mg/ml)100μ l，混匀，进样
15μ l，按样品含量测定方法测定， 计算回收率，进行
加样回收率实验。
1.6 超临界二氧化碳流体萃取工艺流程
将夏枯草叶洗净，60℃烘烤至干，粉碎，过 60 目
筛，称取 100g 装入 500ml 的不锈钢萃取釜中，开启主
泵，达到设置条件，将夏枯草粉静态萃取 3 0 m i n，再
开启小泵动态萃取，萃取完毕后即泄压关机，得到萃
取 液 。
1.7 萃取物中熊果酸含量的测定
将所得萃取液除去溶剂干燥后即得萃取粗品，准确
称重。将萃取物粗品用甲醇定容于 50ml 容量瓶中，用
高效液相色谱外标法测定萃取粗品中熊果酸含量，测定
条件为：色谱柱：Nucleosil-CN 分析柱(4.6mm × 250mm
× 50mm) ；流动相：无水甲醇；流速：1 .0ml /min；
检测波长：2 2 0 n m；柱温：室温；进样量 2 0 μ l。
1.8 单因素试验
1.8.1 携带剂的选择
分别用相同体积(100ml)的甲醇、乙醇、甲醇和乙
醇的混合物(甲醇:乙醇 =1:1)作携带剂及不加任何携带剂，
在萃取温度 30℃、萃取压力 20MPa、萃取时间 75min 条
件下萃取，提取液用 H P L C 进行测定，计算提取率。
1.8.2 携带剂用量对熊果酸提取率的影响
在萃取温度 3 0℃、萃取压力 2 0 M P a、萃取时间
75min 条件下，分别加入携带剂(甲醇:乙 =1:1)50、100、
150、200ml，进行超临界二氧化碳流体萃取，提取液
用 H P L C 进行测定，计算提取率。
1.8.3 萃取时间对熊果酸提取率的影响
在萃取温度 30℃、萃取压力 20MPa、携带剂用量
100ml(甲醇:乙醇 =1:1)，萃取时间分别为 30、45、60、
75、90、105min，进行超临界二氧化碳流体萃取，提
取液用 H P L C 进行测定，计算提取率。
1.8.4 萃取温度对熊果酸提取率的影响
在萃取压力 20MPa、萃取时间 90min、携带剂用量
100ml(甲醇:乙醇 =1:1)，萃取温度分别为 15℃、20、25、
3 0、3 5℃，进行超临界二氧化碳流体萃取，提取液用
H P L C 进行测定，计算提取率。
1.8.5 萃取压力对熊果酸提取率的影响
在萃取温度 30℃、萃取时间 90min、携带剂用量
100ml(甲醇:乙醇 =1:1)，萃取分别为压力 10、15、20、
25、30、35MPa，进行超临界二氧化碳流体萃取，提
取液用 H P L C 进行测定，计算提取率。
1.9 最佳萃取工艺条件试验设计
在单因素试验结果的基础上，以熊果酸提取率为主
要考察指标，选定四因素三水平按 L9(34)正交表进行正
交试验设计，因素水平安排见表 1 。
表1 因素水平表
Table 1 Factors and levels of orthogonal test
A 温度(℃) B 压力(MPa) C 携带剂100ml D 时间(min)
1 20 15 甲醇:乙醇=1:1 60
2 25 20 甲醇:乙醇=2:1 75
3 30 25 甲醇:乙醇=3:1 90
因素水平
2 结果与分析
2.1 熊果酸对照品标准曲线的绘制
以熊果酸对照品进样量(X)为横坐标， 峰面积(Y)为
纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为 Y=220215.0X －
7590.60(r=0.9999)，熊果酸的进样量在 0.288～3.6μg 范围
内与峰面积呈良好的线性关系。
2.2 精密度实验结果
精密吸取对照品Ⅱ液，重复进样 5 次，每次 5μl，
进行高效液相色谱测定，测定峰面积。结果表明，相
对标准差(RSD)为 1.34%(n=5)，说明本方法的精密度
良 好 。
2.3 加样回收率实验结果
精密吸取已测知浓度( 0 . 1 6 2 μ g / μ l )的供试品溶液
500μl，精密加入熊果酸对照品溶液(1.44 mg/ml)100μl，
混匀，进样 1 5 μ l，按样品含量测定方法测定，计算回
收率。结果表明，平均回收率为 99.45%(RSD=0.81%)。
2.4 单因素试验结果
2.4.1 携带剂的选择
2008, Vol. 29, No. 11 食品科学 ※工艺技术296
超临界 CO2 萃取夏枯草熊果酸的正交试验结果见表
3。由表 3 可知，A 因素(温度)的 R 值最大，因素的极
差越大，说明该因素的变动对结果的影响越大，即 A
因素(温度)为最重要的因素。根据表中 R 值的大小，排
列出试验因素的主次顺序：A ＞ D ＞ C ＞ B。
A 因素 Kn 值中，K3 最大，说明其最优水平为 30℃，
同理 B 因素最优水平为 15MPa，C 因素最优水平为 50m
了，D 因素最优水平为 90min。从正交试验结果可以得
出：最佳组合为 A3B1C1D3，即萃取温度为 30℃，萃取
压力 15MPa，携带剂甲醇:乙醇 =1:1，萃取时间 90min。
在最佳组合条件下，对夏枯草叶的熊果酸进行萃
取，并进行 HPLC 分析，熊果酸标样的 HPLC 图和样品
溶液的 HPLC 图分别见图 1、2。比较图 1、2 可看出，
超临界 CO2 萃取夏枯草熊果酸的效果好，萃取物中的熊
果酸含量高，有利于粗提物的进一步分离与纯化。
2.6 正交试验结果方差分析
K1
K2
K3
x1 x2A温度
(℃)
B压力
(MPa)
C携带剂
(甲醇:乙醇=1:1)
D时间
(min)
1 1 1 1 1 8.23 8.16
2 1 2 2 2 3.24 3.22
3 1 3 3 3 6.15 6.11
4 2 1 2 3 4.32 4.29
5 2 2 3 1 4.26 4.25
6 2 3 1 2 3.86 3.83
7 3 1 3 2 6.78 6.75
8 3 2 1 3 8.76 8.75
9 3 3 2 1 6.38 6.36
5.85 6.42 6.93 6.27
4.14 5.41 4.64 4.61
7.3 5.45 5.72 6.4
R 3.16 1.01 2.29 1.66
提取率(mg/g)
试验号
因素
表3 正交试验结果
Table 3 Results of orthogonal test
图2 超临界萃取产物的高效液相色谱图
Fig.2 HPLC profile of ursolic acid from prunella vulgaris by
supercritical CO2 extraction
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
_10
1 2 3 4 5 6 7 8
时间(min)
m
V
1.
85
9
2.
43
8
2.
89
8
3.
42
7
3.
78
8
4.
10
6
5.
13
1
5.
86
8
6.
12
8
6.
63
8
0.
34
4
0.
59
4
4.
61
6
不同携带剂对夏枯草熊果酸超临界流体萃取效果的
影响所得结果列于表 2。从表 2 可以看出，加携带剂和
不加携带剂对萃取效果有明显的影响，加携带剂的萃取
效果较好，在携带剂的选择中以甲醇和乙醇的混合物效
果较好。
2.4.2 携带剂用量对熊果酸提取率的影响
携带剂用量为 50ml 时，萃取率较低，携带剂用量
为 100、150、200ml 时，萃取率较高且相近, 携带剂用
量选择 100ml 比较适宜。
2.4.3 萃取时间对熊果酸提取率的影响
萃取时间对萃取率有影响，萃取率随萃取时间的延
长而增大。萃取时间为 30、45、60、75min 时萃取率
较低，萃取时间为 90、105min 时，萃取率较高且相近，
萃取时间选择 90min 比较适宜。
2.4.4 萃取温度对熊果酸提取率的影响
随着温度的不断升高，熊果酸萃取率随之增加，30
℃熊果酸萃取率最高，超过 3 0℃时萃取率下降，表明
萃取温度选择 30℃比较适宜。
2.4.5 萃取压力对熊果酸提取率的影响
萃取压力对萃取率有一定影响，在萃取压力 10MPa
时，萃取率较低，萃取压力为 1 5 M P a，萃取率较高，
所以萃取压力选择 15MPa 比较适宜。
2.5 正交试验结果直观分析
表2 不同携带剂对超临界流体萃取效果的影响
Table 2 Effects of different entrainers on efficiencies of
supercritical CO2 extraction to ursolic acid
序号 投料量(g) 携带剂(100ml) 萃取物粗品质量(g)
萃取物中熊果
酸的含量(%)
1 100 甲醇 0.32 4.52
2 100 乙醇 0.35 4.68
3 100 混合物(甲醇:乙醇=1:1) 0.58 6.28
4 100 不加携带剂 0.19 0.76
变异来源 平方和(SS) 自由度(DF) 均方(MS) F值
温度(℃) 30.062 2 15.031 26525.480**
压力(MPa) 3.931 2 1.965 3468.245**
携带剂 15.842 2 7.921 13978.069**
时间(min) 11.902 2 5.951 10501.922**
总和 61.742 17
表4 正交试验方差分析
Table 4 Analysis of variance of orthogonal test
注：* * .差异性显著。
360
320
280
240
200
160
120
80
40
0_40
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1.
83
6
2.
53
3
3.
42
8
4.
14
7
8.
16
4
3.
07
2
6.
06
9
6.
57
2
7.
14
0
7.
50
2
2.
93
2
时间(min)
m
V
图1 熊果酸标样HPLC图
Fig.1 HPLC profile of ursolic acid standard
4.
63
8
297※工艺技术 食品科学 2008, Vol. 29, No. 11
展[J]. 中国野生植物资源, 2007, 26(2): 5-7.
[2] 孟歌, 张可杰, 张明智. 夏枯草的化学成分和抗癌活性研究[J].西北
药学杂志, 2007,22(4): 211-213.
[3] 叶穗文. 夏枯草的研究与应用概况[J]. 国际医药卫生导报, 2007,11
(18): 111-113.
[4] 付晓瑞, 李继昌, 张明智. 夏枯草近代研究进展概述[J]. 中医研究,
2005, l8(6): 60-62.
[5] 薛明, 冯怡, 徐德生. 夏枯草化学成分及药理作用的研究概况[J]. 江
苏中医药, 2005, 26(5): 55-57.
[6] 占昌友, 楼一层, 赵锋, 等. 夏枯草二氧化碳超临界CO2 萃取研究[J].
中华临床医药, 2004, 5(7): 13-16.
[7] 刘淑娟, 罗明标, 林海禄, 等. 夏枯草中熊果酸的提取及表征[J]. 化
学世界, 2005(10): 617-620.
[8] 刘秀梅, 刘萍, 赵云鹏. 夏枯草最佳提取工艺的试验研究[J]. 中华临
床医药, 2004, 5(l2): 106.
[9] 李晓蒙, 廖华卫. 夏枯草中熊果酸的含量测定[J]. 广东药学院学报,
2002, 18(1):31-32.
超临界 CO2 萃取夏枯草熊果酸正交试验结果方差分
析见表 4 。从表 4 可以看出，萃取温度、压力、携带
剂、时间对夏枯草叶熊果酸的萃取有显著影响，其中
萃取温度影响最大，与直观分析的结果一致。
3 结 论
采用超临界二氧化碳萃取法萃取夏枯草叶中的熊果
酸，萃取效果好，萃取物中熊果酸含量高，熊果酸提
取比较完全。超临界二氧化碳流体萃取夏枯草叶熊果酸
各因素影响程度为：萃取温度>萃取时间>携带剂>萃取
压力，最佳条件为：萃取温度 30℃，萃取压力 15MPa，
携带剂甲醇:乙醇 =1:1，萃取时间 90min。
参考文献：
[1] 顾晓洁, 钱士辉, 李友宾, 等. 夏枯草的化学成分及药理作用研究进