全 文 ：— 48 — 现代中药研究与实践2009年第23卷第3期Research and Practice of Chinese Medicines
山 乌 龟 Stephania erecta 为 防 己 科 千 金 藤 属 植
物，主要分布于云南的西南部及东南部，生长于湿
热河谷的石灰岩上，因块根形似乌龟而得名，又因
块根常裸露于地表而被称为 “ 地不容 ”，资源较为丰
富 [1-3]。现代研究表明，山乌龟主要含有生物碱类成
分 [4-5]，具有镇静、镇痛、抗心律失常等药理活性，
其主要成分克斑宁 (Crebanine) 在抗心律失常方面表
现了较好的活性，是提取颅痛定 ( 左旋四氢巴马汀
1-Tetrahgdropalmatine，Rotundina) 的主要原料，具有
开发应用前景 [6-7]。临床试验表明，山乌龟总生物碱
的含量与其疗效呈正比关系 [8]。本试验在综合分析比
较山乌龟的甲醇提取、氨性氯仿提取、乙醇回流提
取、超声波辅助提取 4 种方法的基础上，采用正交设
计法优选酸性乙醇提取条件，为山乌龟总生物碱制备
Study on Extraction of Total Alkaloid of Stephania erecta
LI Xing, HE Feng-fa, TIAN Tian, CHI Yuan
(College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 4000716, China)
Abstract: Objective The technology of extraction total alkaloids from Sstephania erecta was studied
and to determine the best method of extraction. Methods With extractive ratio of total alkaloids as an index,
to determine the concentration of alcohol, dissolvent proportion, ultrasonic extraction time and time to return.
Results The best method of extraction is as follows, 75 percent ethanol as solvent extraction, 12:1 of solvent-
material proportion,with extraction first ultrasound for 60 min and then returning 2 times for 1 h each times.
Conclusion The process is simple with a good possibility and has reasonable extraction rate.
Key words: Stephania erecta；total alkaloids；ultrasonic extraction；orthogonal design
工艺提供依据。
1 试验部分
1.1 材料、试剂与仪器
1.1.1 材料 山乌龟块根采自西南大学农学与生物
科技学院教学实习农场（山乌龟是在云南省云县采挖
的野生种，于 2004 年移栽至校内）。
1.1.2 试剂 无水乙醇、甲醇、95%乙醇、盐酸、氯仿、
浓氨水、浓硫酸等 ( 均为分析纯 )。所用蒸馏水为二
次双蒸水。碘化铋钾试剂、碘化钾碘试剂等。
1.1.3 仪器 ALC-11014 型电子天平 ( 北京赛多利斯
仪器系统有限公司 )，KQ-1500 超声波清洗器 ( 昆山
市超声仪器有限公司），DZ -2BC 型真空干燥箱 ( 天
津市泰斯仪器有限公司 )，101-1AB 型鼓风干燥箱 ( 天
津市泰斯仪器有限公司 )，SHB- Ⅲ型循环水式多用
真空泵 ( 郑州长城科工贸有限公司 )，FW100 型高速
万能粉碎机 ( 天津市泰斯仪器有限公司 )， RE-52A
旋转蒸发器 ( 上海亚荣生化仪器厂 )，80 目标准检验
筛 ( 浙江省上虞市砂筛厂 )。
1.2 总生物碱的提取
山乌龟总生物碱提取工艺研究
李 兴，何凤发 * ，田 恬， 池 源
( 西南大学 农学与生物科技学院 ，重庆 400716）
摘要：目的 对山乌龟总生物碱的不同提取方法进行比较，确定最佳提取工艺。 方法 采用正交设计
法，以总生物碱提取率为考察指标，通过对乙醇浓度、溶媒比、超声波提取时间、回流时间 等因素进行考察。
结果 最佳提取工艺为 75% 乙醇为提取溶剂，溶媒比（乙醇 ∶山乌龟）为 12，先超声提取 60 min，再回流
提取 1 h，共回流提取 2 次为山乌龟总生物碱提取的最佳条件。结论 本工艺简单合理，提取率高，具有良
好的可行性。
关键词： 山乌龟；总生物碱；超声波提取法；正交试验法
中图分类号：R944.6 文献标识码：A 文章编号：1673-6427(2009)03-0048-03
收稿日期： 2008-09-29
作者简介： 李 兴（1979-），男，四川西昌人，在读硕士研究生，研究方
向：药用植物生物技术。
*通讯作者：何凤发，副教授，Tel：1398320186，E-mail：Hefengfa@126.
com
DOI:10.13728/j.1673-6427.2009.03.013
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1.2.1 样品处理 将采集的山乌龟块根洗净泥沙刮
去粗皮，切片后放在室内通风处阴干，再于 60 ℃的
恒温鼓风干燥箱内干燥 4 h, 用植物粉碎机粉碎，过
80 目筛，备用。
1.2.2 总生物碱的提取
1.2.2.1 甲醇冷浸提取法 称取山乌龟粉末 40 g 放入
干燥的烧杯中，加入 250 mL 甲醇，充分搅拌，室温
下放置 24 h，移取上清液。 剩余残渣重复上述操作。
合并两次上清液，抽滤，滤液用旋转蒸发器在 60 ℃
下减压浓缩至膏状，放冷，加 3％ HCl 液溶解 , 抽滤
除去不溶物。
1.2.2.2 无水乙醇回流提取法 称取山乌龟粉末 40 g
放入干燥的 500 mL 圆底烧瓶中，加 300 mL 无水乙
醇，室温浸泡 1 h，加热回流 2 h，抽滤。剩余残渣
加入 200 mL 无水乙醇加热回流 1 h，抽滤。合并两
次滤液，滤液用旋转蒸发器减压浓缩至膏状，放冷，
加 3％ HCl 液溶解，抽滤除去不溶物。
1.2.2.3 氨性氯仿索氏回流提取法 称取山乌龟粉末
40 g，用定性滤纸包扎紧密，置于索氏提取器中，用
浓氨水润湿透，然后加入 350 mL 氯仿，置于 500 mL
干燥的圆底烧瓶中，提取 2 h，抽滤。剩余残渣加入
250 mL 氯仿回流提取 1 h，抽滤。合并两次滤液，滤
液用旋转蒸发器在 60 ℃下减压浓缩至膏状，放冷，
加 3％ HCl 液溶解，抽滤除去不溶物。
1.2.2.4 超声波辅助提取法 称取 40 g山乌龟粉末，
放入 500 mL 烧杯中，加入 300 mL 95% 乙醇，在室
温下浸泡 1 h，先超声提取 30 min （超声功率 1 500
W，频率 40 KHz）再加热回流 2 h，抽滤。剩余残渣
加入 200 mL 95% 乙醇加热回流 1 h，抽滤。合并两
次滤液，滤液用旋转蒸发器减压浓缩至膏状，放冷，
加 3％ HCl 液溶解，抽滤除去不溶物。
在以上 4 种提取液中分别加入 100 mL 氯仿，用
浓氨水调 pH 9~10，然后置于分液漏斗中萃取，共萃
取 5 次，每次均用 100 mL 氯仿萃取 1 h，合并萃取
液后用旋转蒸发器减压蒸干，回收溶剂，用少量甲醇
将容器壁上的萃取物溶解，溶液置于西林瓶中 ( 已称
重 )，放入烘箱内，待甲醇基本挥发干后，将提取物
置于真空干燥箱中干燥，待提取物烘干后称重。
1.3 总生物碱超声波辅助提取
提取条件的正交设计优化试验方法同 “1.2.2.4”
项下超声波辅助提取法，加入不同浓度的乙醇、改变
其溶媒比等参数进行正交试验。每次所用山乌龟粉末
质量为 30 g。
根据文献 [10] 和上述不同提取方法的考察结果，
本实验选择超声波辅助提取法中乙醇浓度、溶媒比、
超声波提取时间、回流时间为考虑因素。确定本次实
验采用 4 因素 3 水平 L9 (34) 正交表安排试验，因素
水平设计见表 1。
2 结果与讨论
2.1 定性检测结果
采用生物碱沉淀试剂对山乌龟粗取液进行化学
成分检识。 对山乌龟萃取液中分别加入碘化铋钾试
剂和碘化钾碘试剂，观察反应现象。 可见加入碘化
铋钾试剂生成黄褐色沉淀，而加入碘化钾碘试剂后生
成棕红色沉淀。 根据试验现象可确定萃取液中含有
生物碱。
2.2 山乌龟总生物碱提取方法的筛选
本试验对山乌龟中总生物碱的甲醇提取、无水
乙醇提取、氨性氯仿提取、超声波辅助提取四种方法
进行了比较 , 结果见表 2。
从表 2 可以看出，采用无水乙醇超声波辅助提
取法的提取率较高；氨性氯仿提取方法提取率低，且
用氯仿不利于在工业化生产中推广。 甲醇极性较大，
但对人体有害，且提取物中杂质较多。试验结果证明
无水乙醇的提取效果好 , 但效果还是次于超声波辅助
提取法。
2.3 正交试验结果与分析
以乙醇浓度、超声提取时间、溶媒比、回流时
间为考察因素，每个因素设置三个水平，按照表 3 条
件进行超声提取，每个处理重复 3 次，取平均值，结
果见表 3。
表1 正交实验影响因素水平表
Tab.1 Factors and levels
水平
1
2
3
A乙醇浓度(%)
50
75
95
B 超声提取时间(min)
30
60
90
C溶媒比(倍)
4
8
12
D回流时间(h)
1
2
3
因 素
表2 不同提取方法对山乌龟总生物碱含量的影响( n = 4)
Tab.2 Results of different extraction method( n = 4)
提取方法
总生物碱含量(mg/g)
甲醇提取法
55.372
乙醇提取法
56.521
氨性氯仿提取法
48.369
超声波辅助提取法
58.716
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表4 方差分析
Tab.4 Results of variance analysis
因素
A
B
C
D
误差e
离差平方和SS
7.3593
65.9521
19.1776
4.9506
0.6577
自由度DF
2
2
2
2
16
均方MS
3.6797
32.9761
9.5888
2.4753
0.0411
F值
89.5228
802.2759*
233.2859*
60.2214
注：F0.01(2,2)=99.0; F0.05(2,2)=19.0; F0.1(2,2)=9.0
**表示显著；*表示有一定影响；△表示不显著
对表 3 进行直观分析可知，极差大小显示各因
素的影响作用依次为 B>C>A>D，山乌龟总生物碱最
佳提取工艺为 A2 B2 C3 D2。但是考虑到 D 因素极差
值较小，这种提取方法耗时较长，浪费电力、人力，
所以选择 A2 B2 C3 D1 为最佳提取方案。对结果进行
方差分析，结果见表 4，可知 B、C 因素对山乌龟总
生物碱提取的效果影响有显著意义，而 A、D 因素对
生物碱提取无显著意义。综合直观分析与方差分析
的结果，确定山乌龟总碱的最佳提取工艺为 A2 B2 C3
D1，即加入 75% 的乙醇，超声提取 60 min 一次，溶
媒比为 12，回流时间为 1 h，回流提取 2 次。这种组
合刚好就是处理 5 的组合。
2.4 重复性试验
按照处理 5 提取工艺对山乌龟总生物碱进行提
取，平行操作 3 份。结果见表 5。
表5 重复性试验结果
Tab. 5 Results of reproducibility tests
提取次数
1
2
3
总生物碱含量(mg/g)
60.721
60.923
61.096
平均值(mg/g)
60.913
RSD( %)
1.8274
表3 正交试验结果分析
Tab.3 Analysis of the orthogonal test
实验号
NO.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K1
K2
K3
R
A 乙醇浓度
（%）
1
1
1
2
2
2
3
3
3
171.211
174.574
174.573
1.12
B 超声提取时
间(min)
1
2
3
1
2
3
1
2
3
172.387
179.640
168.331
3.77
因 素
C 溶媒比
（倍）
1
2
3
2
3
1
3
1
2
170.396
173.361
176.601
2.08
D 回流时间
(h）
1
2
3
3
1
2
2
3
1
172.015
175.120
173.223
1.02
生物碱量
(mg/g )
55.217
59.658
56.336
57.729
60.824
56.021
59.441
59.158
55.974
以上重复试验结果表明，本正交试验设计的最
优级处理方法具有良好的可重复性。
3 结 论
本试验对山乌龟中总生物碱的甲醇提取、无水
乙醇提取、氨性氯仿提取、超声波辅助提取法四种方
法进行了比较，明确了超声波辅助提取法在山乌龟总
生物碱提取分离中的优越性。本文选择超声波辅助提
取法工艺中影响总生物碱提取率的 4 个因素，以 L9
(34) 正交表安排试验，进行山乌龟总生物碱提取条件
的优化研究。 结果表明，山乌龟粉末中加入 75% 的
乙醇，超声提取 60 min 一次，溶媒比为 12，回流时
间为 1 h，总共回流提取 2 次为山乌龟总生物碱提取
的最佳条件。
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