全 文 ：收稿日期:2007-03-23;　修订日期:2007-05-20
基金项目:湖北省科技厅资助项目(No.2004AA302B15)
作者简介:沈　伟(1982-),男(汉族),山东潍坊人 ,现任湖北中医学院药
学院 2004级硕士研究生 ,硕士学位 ,主要从事中药及其制剂有效成分的
研究工作.
＊通讯作者简介:张秀桥 (1965-),女(汉族),河北新乐人 ,现任湖北中医
学院副教授 ,博士学位 ,主要从事中药资源和品质研究工作.
大叶蛇葡萄有效部位高效液相色谱指纹图谱研究
沈　伟 1 , 陈树和 2 , 张秀桥1＊ , 刘焱文 1
(1.湖北中医学院 ,湖北 武汉　430065;　2.湖北中医学院附属医院 ,湖北 武汉　430061)
摘要:目的 建立大叶蛇葡萄 AmpelopsismegalophyllaDielset.Gilg有效部位的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱 , 以便完整
地反映大叶蛇葡萄有效部位的内在化学信息 ,为科学评价及有效控制其质量提供可靠方法。方法 利用 HPLC-DAD方
法 , 梯度洗脱 ,测定了 10批大叶蛇葡萄药材有效部位的样品。色谱条件为:AgilentTCC18分析柱(250 mm×4.6 mm, 5μm),柱温为 30℃;流动相:乙腈 -0.1%磷酸水 ,梯度洗脱 , 流速为 1.0 ml/min;检测波长为:250 nm。结果 建立了大叶蛇
葡萄有效部位的 HPLC指纹图谱 ,对 10批不同采收时间的大叶蛇葡萄有效部位的样品进行了指纹图谱分析 , 标定了 10
个共有指纹峰 , 通过与对照品的保留时间及紫外光谱比较 , 1, 5, 6, 9, 10号峰分别鉴定为蛇葡萄素 、花旗松素 、槲皮苷 、槲
皮素 、杨梅素。结论 建立的 HPLC指纹图谱能科学全面地反映大叶蛇葡萄的有效部位 , 可用于大叶蛇葡萄的质量控制。
关键词:大叶蛇葡萄;　有效部位;　高效液相色谱指纹图谱;　花旗松素
中图分类号:R931.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2007)12-2933-02
AnalysisofAmpelopsismegalophyllaDielset.GilgbyHPLCFingerprint
SHENWei1 , CHENShu-he2 ,ZHANGXiu-qiao1＊ , LIUYan-wen1
(1.HubeiColegeofTraditionalChineseMedicine, Wuhan430065, China;2.AfiliatedHospitalofHubeiColege
ofTraditionalChineseMedicine, Wuhan430061, China)
Abstract:ObjectiveToestablishanHPLCfingerprintsoftheefectivepartofAmpelopsismegalophylaDielset.Gilgforreflec-
tingtheinternalchemicalinformationandevaluatingitsqualityinascientificandeffectiveway.MethodsHPLCmethodwasap-
pliedforthequalityassessmentofAmpelopsismegalophylaDielset.Gilg.Thepreparationofsample, theHPLCcolumn, mobile
phase, elutionmode(isocraticandgradient)andgradientprogramwereoptimizedinordertoobtainhighqualifiedHPLCprofile.
TheHPLCsystemconsistedofaWaters600Epumpanda2996 photodiode-arraydetector(DAD).Datawereacquiredandpro-
cessedwiththeEmpowerworkstation.HPLCanalysiswasperformedonanAgilentTCC18 column(250 mm×4.6 mm, 5 μm)withthemixtureofacetonitrileand0.1% phosphoricacidaqueoussolutionasthemobilephaseingradientmode.Thecolumn
temperaturewassetat30℃, theflowratewas1.0ml/min, andthedetectionwavelengthwasat250 nm.ResultsTheHPLCfin-
gerprintsoftheefectivepartofAmpelopsismegalophylaDielset.Gilgshowed10 commonpeaksin10batchesofsamplescollect-
edatdifferenttime.Bycomparisonoftheretentiontimeandtheon-lineUVspectraofchemicalstandards, peak1, 5, 6, 9and10
wereidentifiedasampelosin, taxifolin, quercitrin, quercetinandmyricetin, respectively.ConclusionTheHPLCfingerprintof
theefectivepartofAmpelopsis.megalophyllaDielset.Gilgwithhighspecificitycanbeusedtocontrolitsquality.
Keywords:Ampelopsismegalophyla;　Efectivepart;　HPLCfingerprint;　Taxifolin
　　大叶蛇葡萄 A.megalophylaDielset.Gilg为葡萄科蛇葡萄
属植物 , 味酸涩 ,性平 , 具有清热利湿 、活血化淤的功能 ,用于高血
压病 、痢疾 、泄泻 、小便淋痛 、头昏目胀等治疗 [ 1] 。在我国主要分
布于湖北 、陕西 、甘肃 、福建 、四川 、贵州 、云南等地 [ 2] 。 张汉萍
等 [ 3]从大叶蛇葡萄中分离出蛇葡萄素 , 并进行了初步药效学研
究 , 结果表明蛇葡萄素对脱氧皮质酮盐性等高血压模型大鼠有降
压作用。为了更好地开发大叶蛇葡萄这一具有湖北地方特色的
药材 , 本课题组对大叶蛇葡萄进行了一系列的研究工作 , 首先对
其进行提取并分别用石油醚 、醋酸乙酯萃取 , 接着通过药理筛选
实验发现醋酸乙酯部位提取物具有抗高血压的作用 ,并首次从中
分离并鉴定了一系列黄酮类成分。药理筛选实验及该类化合物
的分离鉴定将另文报道。本实验采用 RP-HPLC对大叶蛇葡萄
的有效部位进行了指纹图谱研究 ,以期为全面 、准确的评价其内
在质量 , 建立质量控制方法提供科学依据。
1　仪器与试药
1.1　仪器 Waters600E-2996型高效液相色谱仪(含在线氮气
脱气 , 低压四元梯度泵 , 进样器 , 柱温箱 , 二级管阵列检测器),
Empower色谱工作站 , 电子分析天平(西德 Sartorius), 电热恒温
水浴锅(北京科学仪器厂)。
1.2　试剂 乙腈(色谱纯 ,天津市科密欧化学试剂开发中心);水
(双蒸水并经 0.45μm水系滤膜过滤);其余试剂均为分析纯。
1.3　对照品 蛇葡萄素 、花旗松素 、槲皮苷 、槲皮素 、杨梅素均为
作者自制 ,其纯度为 96.6%, 92.1%, 91.4%, 99.7%, 99.5%。
1.4　药材 所收集药材经湖北中医学院生药教研室张秀桥副教
授鉴定为葡萄科蛇葡萄属植物大叶蛇葡萄 A.megalophyllaDiels
et.Gilg的茎叶。样品采收时间及编号:020528(1)、 020720(2)、
030318(3)、 030614(4)、 040417(5)、 040523(6)、 040611(7)、
040720(8)、040813(9)、 050709(10)。
2　方法与结果
2.1　色谱条件 色谱柱:AgilentTCC
18
(250 mm×4.6 mm, 5
μm);柱温为 30℃;流动相:乙腈 -0.1%磷酸水 ,按表 1的条件进
行梯度洗脱 ,流速为 1.0 ml/min;检测波长:250nm;进样量:5μl。
表 1　流动相梯度条件
t/min A(乙腈) B(0.1%磷酸水)
0 10 90
60 30 70
80 35 65
120 10 90
2.2　对照品溶液的制备 分别取蛇葡萄素 、花旗松素 、槲皮苷 、槲
皮素 、杨梅素对照品适量 , 置 10 ml量瓶中 , 甲醇超声溶解 , 经
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2007VOL.18NO.12 时珍国医国药 2007年第 18卷第 12期
0.45μm滤膜过滤 ,即得对照品溶液。
2.3　供试品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的大叶蛇葡萄粗
粉(过二十目筛)20.0 g,分别用 10倍量的 95%, 75%乙醇渗漉提
取 , 合并提取液 ,浓缩 , 加水分散 , 分别用石油醚 、醋酸乙酯萃取 ,
将醋酸乙酯部位溶液浓缩至干浸膏 , 甲醇超声溶解 , 转移至 100
ml量瓶并稀释至刻度 , 再从中吸取 3ml转移至 10ml量瓶 , 甲醇
稀释至刻度 , 摇匀 ,经 0.45μm滤膜过滤 ,即得供试品溶液 。
2.4　方法学考察
2.4.1　精密度实验 取同一供试品溶液连续进样 5次 , 进行测
定 , 比较各共有峰的相对保留时间和相对峰面积 , 结果表明各共
有指纹相对保留时间稳定 ,相对峰面积基本一致 , RSD<3%。符
合指纹图谱的检测要求 ,表明精密度良好。
2.4.2　稳定性实验 取同一供试品溶液 , 分别于 0, 2, 4, 8, 16, 24
h进样 , 进行测定 ,比较各共有峰的相对保留时间和相对峰面积 ,
结果表明各共有指纹相对保留时间稳定 ,相对峰面积基本一致 ,
RSD<3%。符合指纹图谱的检测要求 , 表明供试品溶液在 24 h
内基本稳定。
2.4.3　重现性实验 取 8号样品 5份 , 分别按照供试品溶液制
备方法制备成供试品溶液 ,然后分别进行测定。结果表明 , 各共
有指纹相对保留时间稳定 ,相对峰面积基本一致 , RSD<3%。符
合指纹图谱的检测要求 ,表明试验方法的重现性良好。
2.5　指纹图谱的建立
2.5.1　指纹图谱的制备方法 分别精密吸取供试品溶液 5μl注
入液相色谱仪 ,分别按上述色谱条件进行测定 , 考察 120 min供
试品溶液的分离情况 , 发现 80 min之后指纹图谱中基本没有色
谱峰出现 ,故将指纹图谱的洗脱时间初定为 80min,见图 1。
图 1　大叶蛇葡萄有效部位指纹图谱
2.5.2　共有指纹峰的标定 根据 10批大叶蛇葡萄有效部位指纹
图谱的检测结果 ,比较其色谱图。标定了共有峰 10个 ,以花旗松
素的色谱峰为参照峰(S),测定了各共有峰的相对保留时间和相
对保留面积。结果见表 2。
表 2　指纹图谱共有峰相对保留时间 /相对峰面积
样品
编号
相对保留时间 /相对峰面积
1 2 3 4 S 6 7 8 9 10
1 0.545/1.921 0.627/0.077 0.654/0.056 0.736/0.208 1.000/1.000 1.029/0.772 1.165/0.085 1.287/0.097 1.375/0.072 1.466 /0.135
2 0.545/1.910 0.626/0.076 0.654/0.056 0.736/0.208 1.000/1.000 1.029/0.769 1.164/0.084 1.287/0.096 1.374/0.071 1.466 /0.135
3 0.543/1.918 0.626/0.077 0.654/0.058 0.736/0.209 1.000/1.000 1.029/0.773 1.165/0.083 1.288/0.097 1.376/0.070 1.467 /0.135
4 0.541/1.941 0.626/0.082 0.654/0.062 0.736/0.217 1.000/1.000 1.030/0.761 1.166/0.086 1.289/0.090 1.378/0.080 1.469 /0.137
5 0.548/1.919 0.630/0.078 0.658/0.058 0.739/0.212 1.000/1.000 1.028/0.770 1.164/0.088 1.284/0.091 1.367/0.086 1.464 /0.133
6 0.548/1.937 0.629/0.078 0.658/0.056 0.736/0.207 1.000/1.000 1.028/0.775 1.164/0.084 1.284/0.090 1.367/0.068 1.465 /0.135
7 0.545/1.944 0.627/0.077 0.655/0.056 0.737/0.212 1.000/1.000 1.029/0.758 1.164/0.082 1.287/0.089 1.375/0.072 1.466 /0.136
8 0.547/1.927 0.630/0.080 0.658/0.059 0.740/0.211 1.000/1.000 1.028/0.769 1.165/0.084 1.285/0.092 1.368/0.089 1.465 /0.137
9 0.546/1.617 0.629/0.147 0.658/0.040 0.740/0.228 1.000/1.000 1.029/0.806 1.165/0.071 1.286/0.059 1.369/0.093 1.466 /0.073
10 0.547/1.953 0.630/0.080 0.657/0.061 0.739/0.205 1.000/1.000 1.028/0.770 1.165/0.088 1.286/0.092 1.370/0.087 1.466 /0.137
平均值 0.545/1.899 0.628/0.085 0.656/0.056 0.738/0.212 1.000/1.000 1.029/0.772 1.165/0.084 1.286/0.089 1.372/0.079 1.466 /0.129
2.5.3　共有指纹峰的归属 取蛇葡萄素 、花旗松素 、槲皮素 、槲皮
苷 、杨梅素等对照品溶液 ,按上述的色谱条件进行测定 ,对比其保
留时间和相应时间位置的色谱峰的紫外光谱情况 ,确定指纹图谱
中的 1号峰为蛇葡萄素 , 5号峰为花旗松素 , 6号峰为槲皮苷 , 9
号为槲皮素 , 10号为杨梅素。
2.5.4 　非共有峰面积 通过 10批大叶蛇葡萄有效部位的供试
品测定 , 统计非共有峰面积占总峰面积的百分比 ,结果均 <5%,
符合指纹图谱要求。
3　讨论
比较了多种不同的流动相进行了等度洗脱与不同比例流动
相进行梯度洗脱对大叶蛇葡萄指纹图谱的影响 ,发现等度洗脱得
到的色谱峰较少;而采用梯度洗脱 , 能较全面的反映大叶蛇葡萄
的有效部位。因此本实验建立的色谱条件采用梯度洗脱。
比较了波长在 200 ～ 400 nm所得的 HPLC图谱(DAD检测器
检测),结果表明 , 检测波长在 250 nm时 , 其 HPLC图谱中可观测
到较多的色谱峰 , 同时各色谱峰分离效果较好 , 故检测波长选择
250nm。
10批不同采收时间的大叶蛇葡萄指纹图谱中 , 其主要色谱
峰群的整体图貌基本一致 , 各成分含量的相对比值也无明显差
别。因此该指纹图谱可作为湖北地区大叶蛇葡萄有效部位的标
准指纹图谱 , 是评价药材质量和进行质量控制的一个重要依据。
但是药材的标准指纹图谱原则上是建立在足够多批次的药材样
品基础之上 , 所以在以后的鉴定过程中 , 那些经比较获得阳性结
果的药材 ,其色谱信息也纳入统计 ,从而扩大了药材样品批次 , 获
得了更全面的信息 , 不断充实和改善了大叶蛇葡萄有效部位的标
准指纹图谱 , 使大叶蛇葡萄药材的质量评价更为科学完善。
参考文献:
[ 1 ] 　中国药材公司.中国中药资源志要 [ M].北京:科学出版社 ,
1994:722.
[ 2 ] 　湖北省卫生局.湖北中草药志(第 2册)[ M] .武汉:湖北人民出版
社 , 1982:1078.
[ 3 ] 　张汉萍 ,凌志群 ,全笑雨 ,等.大叶蛇葡萄化学成分的研究 [ J].同济
医科大学学报, 1998, (8):267.
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时珍国医国药 2007年第 18卷第 12期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2007VOL.18NO.12