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Effects of vinblastine nanoparticles on growth and apoptosis of glioma cell line C6

长春碱纳米粒对C6神经胶质瘤细胞生长和凋亡的影响



全 文 :长春碱纳米粒对 C6神经胶质瘤细胞生长和
凋亡的影响
刘玉梅1,2,欧阳五庆1,张自强2,杨雪峰3,马淑燕1
(1.西北农林科技大学 动物医学院,陕西 杨凌 712100;
2.河南科技大学 动物科技学院,河南 洛阳 471003;
3.河南科技学院 动物科技学院,河南 新乡 453003)
[摘要] 目的:比较长春碱(vinblastine,VLB)纳米粒(nanoparticles,NPS)和 VLB生理盐水溶液对神经胶质瘤细胞 C6生
长和凋亡的影响。方法:体外培养的神经胶质瘤细胞C6分别用500μg·L-1的VLBNPS和VLB生理盐水溶液孵育,通过测
定7d内的细胞数量和2周后细胞的克隆形成能力,比较VLBNPS和VLB生理盐水溶液对神经胶质瘤细胞C6生长的抑制作
用;在药物孵育48h后,通过普通倒置显微镜和倒置荧光显微镜观察VLBNPS和VLB生理盐水溶液对神经胶质瘤细胞C6形
态的影响,比较二者诱导神经胶质瘤细胞C6凋亡的能力。结果:VLBNPS与相同剂量的VLB生理盐水溶液相比,2~7d时细
胞数量显著下降;VLB生理盐水溶液组细胞的克隆形成率是 VLBNPS溶液组的13倍,差异显著(P<005);形态学观察表
明,VLBNPS溶液组的凋亡细胞数量明显多于VLB生理盐水溶液组,大部分细胞处于凋亡中、末期,失去结构完整性。结论:
VLBNPS比相同剂量下的VLB生理盐水溶液抑制神经胶质瘤细胞C6生长和 诱导其凋亡的能力更显著。
[关键词] 长春碱;纳米粒;神经胶质瘤
[收稿日期] 20090115
[通信作者] 欧阳五庆,教授,博士生导师,主要从事纳米药物与
纳米生物学研究。Email:oywq506@sina.com
[作者简介] 刘玉梅,讲师,在读博士,主要从事药物开发及细胞生
理方面的研究。Email:lymzq@126.com
  长春碱(vinblastine,VLB)是从夹竹桃科植物
长春花中提取的一种具有明显抗肿瘤活性的二聚吲
哚类生物碱[1]。它能封闭形成微管蛋白二聚体的
区域,阻止微管蛋白聚合,干扰微管的正常功能,从
而诱导多种实体肿瘤细胞凋亡[2]。VLB的硫酸盐
溶液已广泛应用于临床30余年,迄今仍是主要的治
疗肿瘤用药之一。然而,VLB口服吸收差,静脉注
射后迅速分布全身,血液中初始浓度高,但此高浓度
维持时间短,在治疗肿瘤的同时引起了严重的毒副
作用。治疗剂量的 VLB可使多种实验动物白细胞
减少,骨髓损耗、恶心,也可引起脱发、腹泻、便秘、手
脚麻痹、头疼等[3],对动物和人的生殖系统也有毒
性,可引起精子形成障碍[4]。此外,研究证实[5],
VLB是耐药蛋白的作用底物之一,易使肿瘤细胞产
生多药耐药性,致使肿瘤细胞内药物浓度过低,难以
维持药效。研究表明[6],抗肿瘤药物的纳米粒(nan
oparticles,NPS)制剂可延长药物半衰期,提高对肿
瘤组织的靶向性,逆转肿瘤细胞的多药耐药性。本
研究在前期工作的基础上[7],进一步考察了本实验
室研制的VLB聚氰基丙烯酸正丁酯(polybuty1cya
noacrylate,PBCA)纳米粒(VLBPBCANP)对大鼠
C6神经胶质瘤细胞生长和凋亡的影响,以期证实
VLB的抗肿瘤效果,降低使用剂量,减少毒副作用。
1 材料
1.1 细胞株
神经胶质瘤细胞 C6购自第四军医大学实验动
物中心。
1.2 药物
VLB购自广州环叶制药厂,批号 060403,
纯度>98%;VLBPBCANP,西北农林科技大学细
胞生物学实验室自制[7]。
1.3 试剂
氰基丙烯酸正丁酯(瞬康医用胶有限公司,批
号061103);DMEM(高糖)培养基(GIBCO公司);胎
牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);胰蛋
白酶消化液(碧云天生物技术研究所);双苯并咪唑
染料(Hoechst33342)(Sigma公司)。
1.4 仪器
CKX41倒置显微镜,倒置荧光显微镜(日本
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Olympus公司);MCO15ACCO2培养箱(日本 Sanyo
公司)。
2 方法
2.1 C6胶质瘤细胞的培养
神经胶质瘤细胞 C6用含 10%胎牛血清的
DMEM培养基在 37℃,5%CO2条件下常规培养。
当细胞长到70%~80%融合时,用025%胰蛋白酶
1∶2消化传代。
2.2 VLBPBCANP对神经胶质瘤细胞 C6增殖活
力的影响
2.2.1 VLBPBCANP对神经胶质瘤细胞 C6生长
曲线的影响 取生长状态良好、处于对数生长期的
C6胶质瘤细胞制成细胞悬液,调整细胞密度为1×
104个/mL,接种于 24孔培养板中,每孔接种加入
200μL单细胞悬液,并向24孔板内分别加入终浓
度500μg·L-1的VLB生理盐水溶液和VLBPBCA
NP溶液,37℃,5%的 CO2条件下培养,同时设立正
常对照组(同样条件下孵育的未加药物处理的细
胞),每组设3个复孔,每隔24h用血细胞技术板计
数每组3个复孔内的细胞数量。未计数的细胞在培
养箱内继续孵育,连续测7d,每2d换1次培养液。
取其平均值绘制细胞的生长曲线。
2.2.2 VLBPBCANP对神经胶质瘤细胞 C6克隆
形成能力的影响 取生长状态良好、处于对数生长
期的 C6胶质瘤细胞制成细胞悬液,将细胞悬液作
梯度倍数稀释,按每孔200个细胞密度接种于6孔
培养板中,分别加入终浓度为500μg·L-1的 VLB
生理盐水溶液和 VLBPBCANP溶液作用细胞。同
时设立正常对照组(同样条件下孵育的未加药物处
理的细胞)。然后以十字方向轻轻晃动培养板,使
细胞分散均匀。在37℃,5%CO2及饱和湿度下,隔
天更换培养液1次。培养2周后,弃去培养液,用
PBS小心浸洗2次。加甲醇5mL固定15min。弃
去固定液,加适量姬姆萨应用液染色10~30min,然
后流水缓慢洗去染色液,空气干燥。显微镜下直接
计数大于50个细胞的克隆数,按下列公式计算克隆
形成率:
克隆形成率= 克隆数接种细胞数×100%
2.3 VLBPBCANP对神经胶质瘤细胞 C6凋亡的
影响
2.3.1 细胞整体形态的变化 取生长状态良好,处
于对数生长期的神经胶质瘤细胞C6接种到6孔板,
当细胞的融合度达到70%~80%时,分别以500μg
·L-1的VLB生理盐水溶液和 VLBPBCANP溶液
作用于神经胶质瘤细胞C6,48h后倒置显微镜下观
察细胞形态变化并拍照。
2.3.2 细胞核形态的变化 取生长状态良好,处于
对数生长期的神经胶质瘤细胞C6接种到6孔板中,
待细胞长满培养板底壁70% ~80%时,分别以500
μg·L-1的VLB生理盐水溶液和 VLBPBCANP溶
液作用于神经胶质瘤细胞C6,48h后用10mg·L-1
的Hoechst33342孵育10min(避光),弃上清液,以
PBS液洗涤1次,倒置荧光显微镜下观察并拍照。
2.4 统计学方法
采用SPSS130进行统计学分析,所有数据均
以珋x±s表示,各组间方差齐性用t检验,方差不齐用
t′检验,统计学显著性设定P<005。
3 结果
3.1 对胶质瘤细胞C6生长曲线的影响
正常对照组细胞的生长曲线接近于“S”型,1~
3d细胞增殖缓慢,从第4天开始细胞进入对数生长
期,迅速增殖,第6天开始细胞数量逐渐减少,这是
由于营养物质的消耗和生长空间相对减小造成的。
VLB生理盐水溶液组和 VLBPBCANP组的细胞数
量在第1天时,与正常对照组无显著差异;第2~5
天细胞缓慢增长,没有出现对数生长期,与正常对照
组相比差异显著(P<005);5~7d细胞数量逐渐
下降,与正常对照组相比差异显著(P<005)。与
VLB生理盐水溶液组相比,VLBPBCANP组细胞数
量在第1天差异不显著,2~7d时细胞数量显著下
降(P<005)。由此可以初步推断,VLBPBCANP
抑制神经胶质瘤细胞C6生长的能力优于VLB生理
盐水溶液(图1)。
3.2 对胶质瘤细胞C6克隆形成能力的影响
正常对照组的克隆形成率为9087%,VLB生
理盐水溶液组和 VLBPBCANP组的克隆形成率分
别比正常对照组降低了 7306%和 7931%。VLB
生理盐水溶液组的克隆形成能力是 VLBPBCANP
组的130倍,二者差异显著(P<005)(表1)。
3.3 对胶质瘤细胞C6整体形态的影响
正常神经胶质瘤细胞 C6呈纤维样生长,细胞
突起明显,多为长梭型,也有各别细胞呈星形,形态
饱满,细胞之间界限清晰,生长旺盛(图 2)。VLB
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图1 VLBPBCANP对神经胶质瘤细胞C6生长
曲线的影响
生理盐水溶液组和 VLBPBCANP组细胞皱缩,细
  
表1 VLBPBCANP对C6神经胶质瘤细胞
克隆形成的影响(珋x±s,n=3)
组别
平均克隆数
/个
克隆形成率
/%
正常组 18174±336 9087
VLB生理盐水溶液 4895±3781) 2448
VLBPBCANP 3759±1071,2) 1880
  注:细胞数均为200个;与正常组比较1)P<005;与 VLB生理
盐水溶液组比较2)P<005。
胞之间界限不清楚,大部分突起消失,变圆(图2)。
与VLB生理盐水溶液组相比,VLBPBCANP组细
胞数量减少,大部分漂浮于培养液中,接近于正常形
态的细胞数量明显减少,大部分细胞处于典型的凋
亡形态。
A.正常对照组;B.VLB生理盐水溶液组;C.VLBPBCANP组。
图2 VLBPBCANP对胶质瘤细胞C6整体形态的影响(×200)
3.4 对胶质瘤细胞C6细胞核形态的影响
正常对照组的神经胶质瘤细胞 C6呈均匀淡蓝
色荧光,细胞数量较多,几乎未发生凋亡,VLB生理
盐水溶液组和 VLBPBCANP组细胞出现染色质固
缩,荧光显微镜下大部分细胞呈明显亮蓝色荧光,属
明显凋亡阳性细胞特征。与 VLB生理盐水溶液组
相比,VLBPBCANP组神经胶质瘤细胞 C6细胞数
量显著减少,多数脱落漂浮于培养液中,且胞核凝聚
现象显著,呈现亮蓝色荧光的细胞数量明显增多
(图3)。
A.正常对照组;B.VLB生理盐水溶液组;C.VLBPBCANP组;箭头代表凋亡细胞。
图3 VLBPBCANP对胶质瘤细胞C6细胞核形态的影响(×100)
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4 讨论
前期工作中[7],本研究通过形态和粒径分析对
VLBPBCANP进行了质量评价,测得其平均粒径为
744nm,粒子大小均匀,分散性好,粒径分布较窄;
通过紫外分光光度计测定其包封率为7847%、载
药量为3924%。在此基础上,本研究进一步考察
了VLBPBCANP对大鼠 C6神经胶质瘤细胞生长
和凋亡的影响。
本研究通过对细胞生长曲线和克隆形成实验这
2个指标的考察,证实了500μg·L-1的VLBPBCA
NP与相同浓度的 VLB生理盐水组相比,对大鼠 C6
神经胶质瘤细胞群体的生长抑制作用和单个细胞的
生长抑制作用显著增强,大鼠C6神经胶质瘤细胞凋
亡的能力比相同浓度的VLB生理盐水组显著提高。
推测其机制,可能在于以下几个方面:①纳米粒子的
粒径小,比表面积大,表面原子配位不足,有较强的吸
附性。且纳米粒载体材料一般都有较强的生物黏附
性,易于被细胞膜黏附,因而比游离形式易于吸收。
文献报道[8],Caco2细胞系对粒径约100nm的粒子
摄取能力比1μm的粒子大25倍左右,比10μm的
粒子大6倍;②文献报道[9],肿瘤细胞通过胞饮或吞
噬作用摄取纳米粒子,而抗肿瘤药物的游离形式则是
以被动转运的方式进入细胞,载药纳米粒避免了细胞
膜对药物转运的限制。VLB在纳米粒载体的协助下
跨过细胞膜,并在肿瘤细胞内富集,提高了其抗肿瘤
活性;③以往研究证实,纳米粒载药系统是逆转肿瘤
细胞多药耐药性(multidrugresistance,MDR)的最有
效策略之一[10]。Cuvier等研究了5种耐药细胞,用载
有阿霉素的纳米粒处理后,其杀伤耐药细胞的半数抑
制浓度较游离阿霉素降低了30~200倍,显示出了载
药纳米粒逆转肿瘤细胞的多药耐药性的能力[11];Bar
raud等报道装载阿霉素的PBCANP能克服肿瘤细胞
的耐药现象,并推测纳米粒是通过内吞途径进入肿瘤
细胞,绕过了耐药蛋白的识别,导致了细胞内药物浓
度的增加[12];Soma等人证实[13],阿霉素和环孢素 A
共同包裹于聚氰基丙烯酸烷基酯纳米粒中可提高环
孢素A逆转MDR的活性。由此可知,采用纳米级载
体系统包裹化疗药物,逆转肿瘤细胞MDR现象的研
究报道较多,但是对于逆转机制仍存在较多争议[14]。
Lamprecht等人报道,神经胶质瘤细胞系C6和F98细
胞膜上有明显的耐药蛋白(Pgp)的高表达[15],且本
研究在预试验中发现,VLBPBCANP对小鼠成纤维
细胞L929的细胞毒性与相同浓度的 VLB生理盐水
溶液无显著差异,因此,VLBPBCANP很有可能通过
逆转神经胶质瘤细胞C6的多药耐药性来提高疗效,
详细机制有待进一步研究。
[参考文献]
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Efectsofvinblastinenanoparticlesongrowthandapoptosisof
gliomacellineC6
LIUYumei1,2,OUYANGWuqing1,ZHANGZiqiang2,YANGXuefeng3,MAShuyan1
(1.ColegeofVeterinaryMedicine,NorthwestAgricultureandForestryUniversity,Yangling712100,China;
2.ColegeofAnimalScienceandTechnology,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471003,China;
3.ColegeofAnimalScience,HenanInstituteofScienceandTechnology,Xinxiang453003,China)
[Abstract] Objective:Tocompareefectsofvinblastine(VLB)nanoparticles(NPS)andVLBphysiologicsalinesolutionon
inhibitinggliomacellinesC6growthandinductingitsapoptosis.Method:GliomacellinesC6wererespectivelytreatedwith500
μg·L-1VLBNPSandVLBphysiologicsalinesolutionfor7days.Amountofcelswerecountedbybloodcelcountingchamber.Gli
omaC6growthcurvewasdrawaccordingtocelsamount.CloneformationrateofgliomaC6wasdetectedafter500μg·L-1VLBNPS
andVLBphysiologicsalinesolutionincubationfor2weeks.Inaddition,thewholemorphologyofgliomaC6wereobservedbyinverted
microscopeandinvertedfluorescencemicroscopeafter500μg·L-1VLBNPSandVLBphysiologicsalinesolutionincubationfor48h.
Result:EntrapmentofVLBinNPSmaysignificantlyinhibitgliomacelsC6growthfrom2to7dayscomparedwithVLBphysiologicsa
linesolutioninthesamedose(P<005).CloneformationrateofgliomaC6inVLBphysiologicsalinesolutiongroupis13timesbet
terthanVLBNPS.ThediferencebetweenVLBNPSandVLBphysiologicsalinesolutionissignificant(P<005).Resultsofmor
phologychangeindicatedgliomacelsC6withtheVLBNPStreatmentwereintermediateorendstage,missedstructureintegrality.
Amountofcelswasdistinctlydecreased,andapoptosiscelsnumberwasapparentlyincreasedcomparedwithVLBphysiologicsaline
solutiongroup.Conclusion:VLBNPShavestrongercytotoxicitytogliomacelslineC6comparedwithVLBphysiologicsalinesolution
inthesamedose.NPSmaybeefectiveaspromisingcarierforthetransportofVLBintothegliomacels.
[Keywords] vinblastine;nanoparticle;glioma
[责任编辑 古云侠]
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