全 文 ：究,可能是通过改变生物膜的理化性质和生理结构,
如脂水分配系数等。将 3 种吸收促进剂配伍, 结果
壳聚糖分别和冰片、白芷挥发油都有协同作用,冰片
和白芷挥发油无协同作用, 说明壳聚糖和白芷挥发
油的促吸收机制可能不同, 冰片和白芷挥发油的促
吸收机制可能相同或冰片用量较文献报道的少, 所
以作用不明显。总之, 复合吸收促进剂配伍产生协
同作用的原因有待进一步研究。
由于壳聚糖和冰片已是公认的无毒吸收促进
剂,但关于白芷挥发油作为吸收促进剂和吸收促进
剂配伍使用对肠黏膜的毒性未见报道, 所以本实验
从安全性角度出发,进一步考察复合吸收促进剂对
肠黏膜的毒性。NPA 是细胞形态的重要参数,当吸
收促进剂作用于肠黏膜时, NPA 值会不同程度的减
少,从而反映吸收促进剂对肠黏膜的毒性。V i 值通
常反映肠黏膜绒毛形态的变化, 当有毒物质接触肠
上皮黏膜时,绒毛皱缩,长度减小, V i也减小。本实
验复合吸收促进剂配伍使用与台氏液比较,对 NPA
和肠绒毛影响小, N PA 和 V i值无显著变化, 说明复
合吸收促进剂配伍对肠黏膜无毒性作用。
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没药挥发油对大鼠神经胶质瘤细胞体外增殖的抑制作用
李舍予1 ,田报春1 ,张勇刚1 ,王海龙2 , 景潞潞1 ,莫显明1*
( 11 四川大学华西临床医学院华西医院 生物治疗国家重点实验室, 四川 成都 610041;
21 四川大学化工学院, 四川 成都 610065)
摘 要:目的 探讨没药挥发油 (没药油) 对大鼠神经胶质瘤细胞 C6 增殖抑制作用。方法 应用 MTT 法检测不
同质量浓度没药油对 C6 细胞活性的作用; BrdU 掺入试验检测细胞增殖的变化; 流式细胞仪检测细胞凋亡率。结
果 没药油对 C6 细胞活性有明显的抑制作用, 其抑制率与质量浓度有关;没药油作用 24 h 后, C6 细胞 BrdU 标记
指数明显降低;而不同质量浓度没药油作用 24 h 后, C6 细胞凋亡率与对照组相比无显著改变。结论 没药油对大
鼠神经胶质瘤细胞株 C6 的增殖具有明显的抑制作用, 但诱导细胞凋亡的作用不明显。
关键词:没药; 没药油; 神经胶质瘤; 增殖; 凋亡
中图分类号: R2861 1 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2009) 07-1103-04
神经胶质瘤是常见颅内原发性肿瘤, 对一般化
学治疗均不敏感。尽管各种治疗手段不断提高, 患
者平均生存期仍不足 1年。中国传统医学在治疗胶
质瘤上有着悠久的传统, 其中没药是各种治疗方剂
中的重要组成药物之一。没药是橄榄科植物没药树
Commip hor a my rr ha Engl. 或爱伦堡没药树 Bal-
samodendr on ehr enbergianum Berg . 树皮渗出的油
胶树脂, 含有挥发油、树脂、树胶等成分, 有散血去
瘀、消肿定痛等功效[ 1] 。Shoemaker 等[ 2] 发现利用
中医传统的煎药方法制作的没药水提物对 8 种肿
#1103#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
* 收稿日期: 2008- 10-22 基金项目:四川大学大学生创新性实验计划重点项目 ( 2007055)作者简介:李舍予( 1985 ) ) ,男,满族,天津市人,八年制医学博士在读,主要从事中药肿瘤药理及多基因遗传病发病机制的研究。
E-mail: lish eyu@ gmail. com
* 通讯作者 莫显明 T el: ( 028) 85164017 Fax: ( 028) 85164047 E-m ail : xm ingmo@ scu . edu. cn
瘤细胞株中的 7 种有抑制作用,但对正常体细胞没
有影响。另有报道, 同属印度穆库尔没药 Commi-
phor a mukul ( Hook. ex Stocks) Eng l. 提取物孕
甾酮 ( guggulster one) 及麦加没药树 Commtp hor a
opobalsamum Eng l. 树脂和倍半萜类提取物可通过
特异性诱导凋亡, 抑制前列腺癌细胞活性[ 3, 4] 。研
究曾报道用没药饲养白化小鼠, 对其 Ehr lich 腹水
癌有一定的治疗作用。没药的挥发油成分没药油具
有抗菌、抗炎、抗氧化、抗血吸虫等作用,但其抗肿瘤
作用研究较少。仅有研究报道没药油对齿龈成纤维
细胞和齿龈上皮细胞有一定的细胞毒性 [ 5]。而其中
一种呋喃倍半萜成分对乳腺癌细胞株 MCF-7 有抑
制作用[ 6]。本研究以大鼠神经胶质瘤细胞株 C6 为
细胞模型,观察没药油对神经胶质瘤细胞的体外抑
制作用,并初步探讨其机制。
1 材料与方法
11 1 细胞株、药品、主要试剂和仪器:大鼠神经胶质
瘤 C6 细胞本室自行保存。没药油为按照文献方法
操作后得到 (总质量分数> 98% ) [ 7]。胰蛋白酶
(美国 HyClone 公司)、RPM I1640 培养基 (美国
Gibco 公司)、小牛血清 (兰州民海生物工程有限公
司)、MT T (美国 Sigma 公司)、Dapi (美国 Invit ro-
gen 公司)、5-溴脱氧尿嘧啶 ( BrdU ,美国 Sigma 公
司)、二抗 (鼠抗兔,美国 Invit rog en 公司)。A nnex-
in V-FIT C 细胞凋亡检测试剂盒 (南京凯基生物科
技发展有限公司) , 多谱酶标仪 (美国 Thermo 公
司) , 流式细胞仪 (美国 BD 公司) , 荧光显微镜 (日
本 Olympus 公司)。
11 2 药物稀释: 将 1 LL 没药油与无水乙醇 1 B 1
混合后, 分别溶于 98 LL 超纯水中, 混合均匀, 备
用。同时配置 1% 乙醇溶液。使用时取备用液用
超纯水按照 1 B10、1B 100、1B1 000稀释。
11 3 细胞培养:大鼠神经胶质瘤细胞 C6 于 RPMI
1640 培养基 (含 10% 小牛血清) , 37 e 、5% CO2及
饱和湿度培养箱内培养, 细胞于培养皿中贴壁生长,
每 2~ 3 天传代 1次。
11 4 细胞活性测定 ( M T T 法) : 分别将细胞用胰酶
消化后,以每孔 11 5 @ 104个接种于 48 孔板,按质量
浓度梯度分别加入没药油稀释液,终质量浓度分别
为 01 16、01 8、11 6、8、16、80 Lg/ mL ( 24 h) 和 01 24、
11 2、21 4、12、24、120 Lg/ mL ( 72 h) , 对照组及低质
量浓度组加入相应乙醇溶液补足 (使各孔乙醇终体
积分数相同)。分别于作用 24 h 和 72 h 后每孔加
入 5 mg/ mL MTT 20 LL, 37 e 继续孵育 4 h 后,
弃去上清,每孔加入 500 LL DMSO, 震荡使沉淀完
全溶解后用酶标仪 570 nm 波长处测定各孔吸光
度,并计算细胞存活率。实验重复 2次,两次分别设
复孔 5、6 个。
11 5 Br dU 掺入试验: 分别将细胞用胰酶消化后,
以每孔 3 @ 104个接种于 24 孔板,按质量浓度梯度
分别加入没药油稀释液,终质量浓度分别为 01 8、8、
80 Lg/ mL,对照组及低质量浓度组加入相应体积分
数的乙醇溶液补足。于 20 h 后加入 BrdU 使终浓
度为 10 Lmol/ L。37 e 孵育 4 h 后用 4% 多聚甲
醛 4 e 固定 30 min, 1% T riton-PBS 孵育 30 min,
5% 羊血清封闭 10 min, 避光加入 BrdU 抗体室温
孵育 2 h, 加入二抗室温孵育 1 h, Dapi染色,并于荧
光显微镜下随机选取 10 个非重叠视野 ( @ 100) 观
察、摄影, 计数 BrdU 阳性细胞数占总细胞数的比
例,即 Br dU 标记指数 ( labeled index, LI)。实验
设复孔 4 个。
11 6 细胞凋亡检测: 将培养于 21 5 mm 培养皿中的
没药油处理组 (质量浓度分别为 01 8、8、80 Lg/ mL)
与对照组 (无水乙醇补足) 细胞分别消化收集, 按
照试剂盒说明书用 A nnexin V-FITC/ PI 双标记后
进行流式细胞双色分析。
11 7 统计学处理: 结果用 x ? s 表示, 多组比较采
用方差分析,组间两两比较采用 LSD 检验,数据分
析、做图均采用 SPSS 131 0 统计软件。
2 结果
21 1 没药油抑制 C6 细胞活性作用: M TT 法提示,
没药油对 C6 细胞的抑制作用呈质量浓度依赖性,
在 8、12 Lg/ mL 时作用最显著, 而 72 h 时没药油抑
制作用较 24 h 时下降 (见图 1、2)。没药油处理 24
h 和 72 h 后,当药物质量浓度分别为 8 和 12 Lg/
mL 时,其细胞存活率分别下降到 ( 67 ? 7) % ( P<
01 01) 和 ( 78 ? 6) % ( P< 01 01)。但当药物质量浓
度超过此水平后, 药物在两个时间点肿瘤细胞活性
又有回升趋势。
21 2 没药油抑制 C6细胞的增殖作用: Dapi染色显
示,用 8 Lg / mL 没药油处理 24 h 后细胞分裂指数
(分裂相细胞占总细胞数的比例) 较对照有显著降
低 [对照组 ( 21 8 ? 11 0) % ; 8 Lg/ mL 没药油 ( 11 6 ?
01 7) % , P< 01 05]。Br dU 掺入实验表明没药油处
理 24 h 可以使 C6细胞 Br dU 标记指数明显低于对
照 ( P< 01 05, 见图 3) , 而在 8 Lg/ mL 时没药油的
作用最为显著 ( P< 01 01)。但当没药油质量浓度达
到 80 Lg/ mL 时 C6 细胞的 BrdU 标记指数却有所
#1104# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
回升,并接近 01 8 Lg / mL 没药油处理时的水平。提
示 8 Lg / mL 为没药油抑制 C6 细胞增殖的最适作
用质量浓度。结果与 MTT 法一致。
21 3 没药油诱导 C6 细胞的凋亡作用: 为了进一步
探讨没药油对 C6 细胞抑制作用的机制, 通过流式
细胞仪对经没药油处理后的细胞凋亡情况进行了检
测,不同质量浓度没药油处理 24 h 后与对照组相比,
凋亡程度未发现显著性差异 ( P> 01 05) ,见表 1。
表 1 没药油对 C6 细胞凋亡的影响 ( x? s, n= 2)
Table 1 Effect of MO on apoptsis of C6 cells (x ? s, n= 2)
组别
剂量/
( Lg # mL- 1)
坏死细胞/
%
凋亡晚期
细胞/ %
完整活细胞/
%
凋亡早期
细胞/ %
对照 - 01 10 ? 01 00 11 80 ? 01 28 951 95 ? 01 64 21 15 ? 01 35
没药油 80 01 20 ? 01 00 31 30 ? 11 98 931 30 ? 21 97 31 25 ? 01 92
8 01 15 ? 01 07 21 60 ? 01 71 931 90 ? 01 71 31 40 ? 01 00
01 8 01 15 ? 01 07 41 00 ? 01 99 911 65 ? 01 78 41 20 ? 01 28
3 讨论
没药油是没药的挥发油成分, 主要成分为倍半
萜类物质, 包括呋喃桉叶素-1, 3-二烯( 341 0% )、香
樟烯 ( 121 9% )、莪术烯 ( 81 5%) 等[ 8]。其中, Zhu
等[ 6 ]在没药的树脂成分中分离得到了 6 种单体成
分,并证明其中的一种呋喃倍半萜类物质 [ rel-1S,
2S-epoxy-4R- fur anogermacr-10 ( 15 )- en-6-one ] 对
乳腺癌细胞株 MCF-7 有抑制活性。本实验采用
MTT 法和 BrdU 掺入实验证实没药油对 C6 细胞
有明显的抑制增殖作用, 而并不引起 C6 细胞明显
凋亡。当没药油质量浓度为 8 Lg/ mL 时平均抑制
率最大,可达 331 8%。而文献报道没药油在 80 Lg/
mL 时才对齿龈上皮细胞和成纤维细胞的生长有明
显的抑制作用,而 8 Lg/ mL 没药油对正常细胞无明
显抑制作用[ 1] 。提示胶质瘤细胞比正常细胞对没药
油更为敏感。本实验中, 多种检测方法均提示当质
量浓度达到 80 Lg/ mL 时, 没药油对 C6 的抑制作
用有所下降,提示没药油作用于肿瘤细胞存在最佳
剂量。没药油抗肿瘤作用仍有待进一步研究。
致谢:四川大学生命科学院医学细胞生物学教
研室胡火珍教授、杨春蕾副教授、张彤彤、马刚在实
验设计和进展中给予的无私的指导和帮助;四川大
学华西临床医学院/华西医院/生物治疗国家重点实
验室干细胞生物学研究室黄巧容、苟继龙、周立、陈
乙兰、张胜良、尹超然在实验中给予的无私的帮助。
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枇杷花提取物止咳作用研究
王静波1 ,杨必坤1 ,张 宏1, 2* ,李 琪1 , 张晓喻1 ,刘 刚1
( 11 四川师范大学生命科学学院, 四川 成都 610068; 21 四川师范大学植物资源应用与开发研究所,四川 成都 610068)
摘 要:目的 研究枇杷花 95%、75%、50% 乙醇提取物, 水提取物和混合提取物的止咳作用。方法 分别采用小
鼠氨水引咳法和枸橼酸豚鼠引咳法观察枇杷花各提取物的止咳作用。结果 与对照组比较, 枇杷花 95% 乙醇提
取物 ,混合提取物高、中剂量组及 50% 乙醇提取物,水提取物高剂量组对小鼠和豚鼠均有明显的止咳作用,并与阳
性对照组相当。75% 乙醇提取物高、中剂量组和各提取物低剂量组均无明显止咳作用。结论 枇杷花 95% 乙醇
提取物和混合提取物具有明显止咳作用, 50% 乙醇提取物和水提取物具有一定止咳效果, 75% 乙醇提取物无明显
止咳效果。各提取物中三萜化合物可能具有明显止咳作用, 总黄酮具有一定止咳作用。
关键词:枇杷花; 止咳; 总黄酮
中图分类号: R2851 5 文献标识码: A 文章编号: 0253-2670( 2009) 07-1106-04
枇杷花为枇杷 Er iobot rya j aponica ( Thunb. )
Lindl. 的干燥花蕾及花序, 气味香醇独特, 性温, 可
入肺散寒,化痰止咳,治疗伤风感冒[ 1, 2]。枇杷花主
要的化学成分是三萜类化合物[ 3] 和黄酮类化合物。
文献报道枇杷叶中三萜类和黄酮类化合物均具有较
好的抗炎和镇咳作用 [ 4, 5] , 在临床上多用于治疗急、
慢性呼吸道疾病 [ 6]。而枇杷花的相关研究较少。本
实验采用分光光度法和 HPLC 法测定枇杷花中的
总黄酮、齐墩果酸和熊果酸的量,用小鼠和豚鼠模型
进行枇杷花不同溶剂提取物的止咳药效实验, 探讨
枇杷花不同溶剂提取物的止咳效果,以及止咳物质
基础,为枇杷花资源的开发利用提供科学的依据。
1 材料
11 1 药材:枇杷花, 2006年 10月采于四川蒲江, 经
本校生命科学学院植物教研室鉴定为枇杷 Er iobo-
tr ya j aponica ( T hunb. ) L indl. 的花, 采后置于
50 e 下烘干备用。
11 2 药物与试剂: 复方磷酸可待因口服溶液 ( 41 5
mg/ mL) ,香港奥美制药厂生产,批号 20070005; 京
都念慈菴蜜炼川贝枇杷膏,京都念慈菴总厂有限公
司生产,批号 L2710061;蛇胆川贝枇杷膏, 广州潘高
寿药液股份有限公司生产, 批号 G05013; 神奇枇杷
止咳颗粒, 贵州神奇药液股份有限公司生产, 批号
20071015;急支糖浆,太极集团重庆涪陵制药厂有限
公司生产,批号 88070500028;氨水 (分析纯)、枸橼
酸 (分析纯)、羧甲基纤维素钠 ( CMC-N a) 均由成
都市科龙化工试剂厂生产。
11 3 仪器: WH ) 2000 超声波雾化器, 汕头市粤华
医疗器械厂有限公司生产; Buchi Syncor e Analy st
R ) 12 多功能平行浓缩仪; Shimadzu-UV-1700 型
紫外可见分光光度计; Dionex-Summit P680A DGP-
6 型双三元高效液相色谱仪。
11 4 动物:小鼠,昆明种,雌雄各半,体质量 ( 20 ? 2)
g,由四川省医学科学院实验动物研究所提供,动物合
#1106# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 40 卷第 7 期 2009 年 7 月
* 收稿日期: 2008- 09-25 基金项目:四川省教育厅青年基金项目 ( 2006B035) ; 四川省攀枝花市科技局重点项目 ( 2008CY-S-1)作者简介:王静波( 1982 ) ) ,女,辽宁省辽阳市人,硕士研究生,主要从事天然产物研究工作。
E-mail: wangjin gb o8299@ 163. com
* 通讯作者 张 宏 E- mai l: z han ghong651@ yah oo. com. cn