全 文 ：·生物技术· 北方园艺２０１１（２４）：１３８～１４０
第一作者简介：纪春艳（１９６４－），女，教授，现主要从事细胞生物学
及植物细胞工程等研究工作。
基金项目：黑龙江省教育厅科技面上资助项目（１１５５１５１６）。
收稿日期：２０１１－１１－０７
圆叶椒草的组织培养与植株再生研究
纪 春 艳１，李 睿 怡２，张 彩 丽３，王 詝１
（１．牡丹江师范学院 生命科学与技术学院，黑龙江 牡丹江１５７０１２；２．东北农业大学 园艺学院，黑龙江 哈尔滨１５００３０；
３．齐齐哈尔市甘南二中，黑龙江 甘南１６２１００）
摘 要：以圆叶椒草茎段为试材，采用植物组织培养方法，研究了６－ＢＡ、ＮＡＡ、ＩＢＡ对圆叶椒
草的愈伤组织诱导、不定芽分化以及试管苗生根培养的影响，以期筛选出愈伤组织和芽分化以及
生根诱导的最佳培养基。结果表明：愈伤组织诱导、愈伤组织和不定芽分化最理想的培养基为
ＭＳ＋６－ＢＡ １．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ ０．１ｍｇ／Ｌ；试管苗生根培养最佳培养基为１／２ＭＳ＋ＮＡＡ ０．５
ｍｇ／Ｌ＋０．５％活性炭。
关键词：圆叶椒草；茎段；愈伤组织
中图分类号：Ｓ ６８２．１０３．６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１－０００９（２０１１）２４－０１３８－０３
圆叶椒草为胡椒科椒草属常绿多年生观叶性小型
草本植物，别名碧玉，原产于委内瑞拉。药用可祛风除
湿，止咳祛痰，用于风湿筋骨疼痛，哮喘；外用治跌打损
伤、骨折等。由于四季常青，有助于净化室内空气，同
时其浓绿的叶色对缓解眼疲劳具有一定功效，因而备
受人们喜爱。常规条件下，圆叶椒草属主要以扦插繁
殖为主，繁殖花叶品种时宜采用分株繁殖，但在大量扩
繁时，采用组织培养方法可以克服扦插繁殖周期长、繁
殖率低的不足。目前胡椒科椒草属荷叶椒草组培有过
报道［１］，但圆叶椒草组培尚未见报道。该试验对圆叶
椒草属诱导形成愈伤组织的快繁体系进行研究，以满
足生产之需［２］。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
圆叶椒草购于花鸟鱼市场，选取生长健壮的植株
作为试验材料。
１．２ 试验方法
１．２．１ 无菌外植体材料的获得 选取生长健壮的圆
叶椒草的茎段，自来水冲洗３０ｍｉｎ，阴干，在超净台上，
用７５％酒精浸泡３０ｓ，无菌水冲洗，用０．１％ 升汞浸没
材料，消毒６ｍｉｎ，无菌水冲洗，用灭菌吸水纸吸干材料
表面的水分，切成０．５～１．０ｃｍ小段，作为外植体［３］。
１．２．２ 愈伤组织及芽的诱导 以 ＭＳ为基本培养基，
附加蔗糖３０ｇ／Ｌ、琼脂粉７ｇ／Ｌ、６－ＢＡ、ＫＴ及 ＮＡＡ、
ＩＢＡ，ｐＨ调至５．８［４－５］ 。将外植体接种于１～１０号培
养基中，置于培养温度在（２５±１）℃，光照强度为３０～
４０μｍｏｌ·ｍ
－２·ｓ－１的培养室培养。待芽长至０．５～
１．０ｃｍ，从基部切下，进行继代培养。
１．２．３ 生根培养 取健壮试管苗，以１／２ＭＳ为基本
培养基，附加蔗糖３０ｇ／Ｌ，琼脂粉７ｇ／Ｌ，加少量活性炭
和ＮＡＡ［６］，ｐＨ调至５．８，培养条件同上。
１．２．４ 练苗移栽 当根数达３～５根，健壮时，打开瓶
口练苗２～３ｄ，之后取小苗，洗去琼脂，移栽到富含腐
殖质土质的花盆中［７］，保温保湿，避光直射。
２ 结果与分析
２．１ 不同激素对愈伤组织和分化芽的诱导
１～１０号培养基中的诱导愈伤组织形成与分化出
芽率见表１。方差分析采用ＤＰＳ Ｖ３．０１专业版软件，
结果见表２；多重比较分析采用ＬＳＤ法，结果见表３。
由表２可知，处理间差异显著，即不同浓度激素对
愈伤及芽的诱导效果有很大差异。当６－ＢＡ的浓度为
１．０ｍｇ／Ｌ时，１号培养基中培养的外植体形成愈伤组
织的效果最好。培养２０ｄ，外植体膨大开始形成愈伤
（图１），１６ｄ分化形成绿色芽点并形成芽（图２Ａ），
２０ｄ后生成芽丛（图２Ｂ）；２号培养基绝大多数形成愈
伤组织但没有出芽，３、４、５号培养基中外植体愈伤组
织形成较少且出芽率很低；当６－ＢＡ的浓度为１．５ｍｇ／
Ｌ时，７号培养基中的外植体全部形成愈伤并且出芽，
８、９号形成愈伤的外植体数较多但出芽较少，１０号愈
伤形成较少且没有出芽，６号形成愈伤及出芽率最低。
另外，由表３可知，１号与７号的诱导效果没有显著差
别，说明１号和７号都是最适浓度培养基。此外，该试
验还用ＫＴ与２种生长素的相同浓度组合做了比较，
效果均不太理想。
试验结果表明，６－ＢＡ和 ＮＡＡ组合的培养基比
６－ＢＡ和ＩＢＡ的组合更适合愈伤及芽的诱导，其中１号
６－ＢＡ １．０ ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ ０．１ ｍｇ／Ｌ 和 ７ 号 ６－ＢＡ
１．５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ ０．２ｍｇ／Ｌ的培养基效果最好。但从经
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北方园艺２０１１（２４）：１３８～１４０ ·生物技术·
表１ 不同浓度配比的激素对愈伤组织及芽的诱导效果比较
培养
基号
激素
／ｍｇ·Ｌ－１
接种外植
体的总数／个
愈伤或分化出芽
的外植体总数／个
愈伤或分化
出芽率／％
１ ６－ＢＡ １．０＋ＮＡＡ ０．１ ４０ ３７（愈伤且出芽） ９２．５
２ ６－ＢＡ １．０＋ＮＡＡ ０．２ ４０ ３３（愈伤） ８２．５
３ ６－ＢＡ １．０＋ＮＡＡ ０．５ ４０ １９（愈伤） ４７．５
４ ６－ＢＡ １．０＋ＩＢＡ ０．２ ４０ ２１（愈伤） ５２．５
５ ６－ＢＡ １．０＋ＩＢＡ ０．５ ４０ １８（愈伤） ４５
６ ６－ＢＡ １．５＋ＮＡＡ ０．１ ４０ １５（愈伤） ３７．５
７ ６－ＢＡ １．５＋ＮＡＡ ０．２ ４０ ４０（愈伤且出芽） １００
８ ６－ＢＡ １．５＋ＮＡＡ ０．５ ４０ ３１（愈伤） ７７．５
９ ６－ＢＡ １．５＋ＩＢＡ ０．２ ４０ ３０（愈伤） ７５
１０ ６－ＢＡ １．５＋ＩＢＡ ０．５ ４０ ２０（愈伤） ５０
注：培养天数为２５ｄ；光照为１２ｈ／ｄ；培养温度为（２５±１）℃。表４同。
表２ 不同培养基对愈伤组织及
芽的诱导效果方差分析
变异来源 平方和 自由度 均方 Ｆ值 显著水平
区组间 １．４４ ９ ０．１６ ０．６３７ ０．７６２６
处理间 ７４．６４ ９ ８．２９３３ ３２．９９４ ０．００００
误 差 ２０．３６ ８１ ０．２５１４
总变异 ９６．４４ ９９
济利益的角度考虑，如果大批量生产，则１号要优于
７号。
２．２ ＮＡＡ对根诱导的影响
移苗至生根培养基中培养２０ｄ后，不同浓度的
ＮＡＡ对根的诱导情况见表４。结果表明，添加活性炭
的培养基生根情况要明显好于不添加活性炭的培养
基，其中２号培养基中小苗生根情况最佳，５ｄ后根长
表３ 不同培养基间多重比较分析
处理 均值 ５％显著水平 １％极显著水平
７ ４．００ ａ Ａ
１ ３．９０ ａ Ａ
２ ３．３０ ｂ Ｂ
８ ３．１０ ｂ Ｂ
９ ３．００ ｂ Ｂ
４ ２．１０ ｃ Ｃ
１０ ２．００ ｃ ＣＤ
３ １．９０ ｃｄ ＣＤ
５ １．８０ ｃｄ ＣＤ
６ １．５０ ｄ Ｄ
可达到１ｃｍ（图３）。１、３、４号培养基的苗生根率均不
足２０％。结果表明，生根培养时以１／２ＭＳ＋ＮＡＡ
０．５ｍｇ／Ｌ＋活性炭０．５％为诱导激素效果最佳。
表４ 不同浓度的生长素对根的诱导效果比较
培养
基号
激素
／ｍｇ·Ｌ－１
无根苗数
（无活性炭）／个
生根数
（无活性炭）／个
无根苗数
（加０．５％活性炭）／个
生根数
（加０．５％活性炭）／个
１ ＮＡＡ ０．２ ２０ ２ ２０ ４
２ ＮＡＡ ０．５ ２０ １６ ２０ ２０
３ ＮＡＡ １．０ ２０ ３ ２０ ５
４ ＮＡＡ １．５ ２０ ２ ２０ ５
图１ 愈伤组织 图２ 愈伤组织形成丛芽 图３ ２周后的生根情况
３ 结论
该试验结果表明，在不同激素不同浓度的配比下，
以ＭＳ＋６－ＢＡ １．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ ０．１ｍｇ／Ｌ为培养基进
行愈伤组织及芽诱导时效果最佳，生根诱导时以
１／２ＭＳ＋ＮＡＡ ０．５ｍｇ／Ｌ＋０．５％活性炭为培养基进行
培养效果最佳。
参考文献
［１］ 蒋雄辉，陈春满．荷叶椒草的组织培养与植株再生［Ｊ］．植物生理学
通讯，２００８（３）：５１８．
［２］ 林贵美，韦华芳，李小泉，等．蛇莲的组织培养与快速繁殖［Ｊ］．植物
生理学通讯，２００７（６）：５０８．
［３］ 杨琳，徐莺，陈放．霸王鞭的组织培养与快速繁殖［Ｊ］．植物生理学
通讯，２００６（１２）：１１２５．
［４］ 李秀维．瑞香狼毒的组织培养及快速繁殖［Ｊ］．植物生理学通讯，
２００５（２）：５９．
［５］ 龚伟，胡庭兴，宫渊波，等．叶子花茎段愈伤组织的诱导及其植株
再生的研究［Ｊ］．园艺学报，２００５，３２（６）：１１２５－１１２８．
［６］ 蒋泽平，王国良，梁珍海，等．乐昌含笑的离体快速繁殖［Ｊ］．植物生
理学通讯，２００５（２）：６７．
［７］ 宋会访，葛红，周媛，等．桂花离体培养与快速繁殖技术的初步研
究［Ｊ］．园艺学报，２００５，３２（４）：７３８－７４０．
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·生物技术· 北方园艺２０１１（２４）：１４０～１４４
第一作者简介：宋长征（１９８９－），男，安徽宿州人，本科，研究方向为
葡萄与葡萄酒工程。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｃｚ１１０３＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ。
责任作者：张振文（１９６０－），男，陕西铜川人，硕士，教授，博士生导
师，现主要从事葡萄与葡萄酒研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｚｈｗ６０＠
ｎｗｓｕａｆ．ｃｎ．ｃｏｍ。
基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项资金资助项目
（ＣＡＲＳ－３０－９）。
收稿日期：２０１１－０９－１５
不同酿酒葡萄品种白藜芦醇合酶
基因的克隆和序列分析
宋 长 征，张 振 文
（西北农林科技大学 葡萄酒学院，陕西 杨凌７１２１００）
摘 要：以红葡萄品种“赤霞珠”、“品丽珠”、“黑比诺”和白葡萄品种“雷司令”为试材，采用改
良ＣＴＡＢ法提取葡萄叶片组织中的ＤＮＡ，并扩增得到４个酿酒葡萄品种的白藜芦醇合酶基因部
分片段。结果表明：红葡萄品种“赤霞珠”、“品丽珠”、“黑比诺”的扩增产物均为１ ４１９ｂｐ，白葡萄
品种“雷司令”扩增产物为１ ４１７ｂｐ。通过序列多重比较分析，所得到的４个白藜芦醇基因片段与
Ｇｅｎｂａｎｋ中河岸葡萄（ＡＦ１２８８６１）的该基因序列同源性较高（９０％以上），外显子区同源性高于内
含子；红色葡萄姊妹品种之间、红色葡萄不同品种之间、红色葡萄与白色葡萄品种之间的序列同
源性依次递减。
关键词：酿酒葡萄；白藜芦醇；合酶基因；克隆；序列分析
中图分类号：Ｓ ６６３．１；Ｑ ８１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１－０００９（２０１１）２４－０１４０－０５
白藜芦醇（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ ３，４’，５－ｔｒｉｈｙｄｏｘｙｓｔｉｌｂｅｎｅ，
简称Ｒｅｓ）是一种只在生理条件下存在的芪二酚化合
物（１，２－二苯乙烯，Ｓｔｉｌｂｅｎｅ），是植物为抵抗外界刺激而
分泌的一种植物抗毒素［１］。它是在白藜芦醇合酶的催
化作用下，以１分子４－香豆酰辅酶Ａ和３分子丙二酰
辅酶Ａ为底物合成的［１］，１９４０年首次从毛叶藜芦的根
部获得［２］。它具有许多医疗保健作用，如抗氧化、抗肿
瘤、抗血小板凝聚、抗细菌和真菌、防止人体低密度脂
蛋白氧化等［１，３］，因此，Ｒｅｓ已成为科学家们高度重视
的天 然 活 性 成 分。研 究 表 明，白 藜 芦 醇 合 酶
（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ ｓｙｎｔｈａｓｅ，简称ＲＳ）是白藜芦醇合成途径
中的关键酶，且是白藜芦醇生物合成中唯一必需的酶，
它只存在于有白藜芦醇合成的植物中，大多数作物都
缺乏白藜芦醇合酶基因［４］。不同植物或同种植物不同
组织部位中白藜芦醇含量又有明显差异［５－６］。因此，对
ＲＳ基因序列的深入研究有助于构建表达载体，培育转
基因植物、微生物，为提高植物的抗性和人类的健康水
平提供有效的途径［７－８］。该研究利用改良ＣＴＡＢ法提
取葡萄叶片组织中的 ＤＮＡ，根据文献［２］的序列
（Ｇｅｎｂａｎｋ登录号ＡＦ１２８８６１）设计引物，并采用简单易
行的ＰＣＲ方法扩增得到４个酿酒葡萄品种的白藜芦
醇合酶基因的部分片段序列，利用相关软件进行了不
同酿酒葡萄品种白藜芦醇合酶基因序列的分析
。
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｅｒｏｍｉａｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ
ＪＩ Ｃｈｕｎ－ｙａｎ１，ＬＩ Ｒｕｉ－ｙｉ ２，ＺＨＡＮＧ Ｃａｉ－ｌｉ ３，ＷＡＮＧ Ｚｈｕ１
（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｕｄａｎｊｉａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｍｕｄａｎｊｉａｎｇ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ １５７０１２；２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ，
Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ １５００３０；３．Ｑｉｑｉｈａｒ Ｇａｎｎａｎ Ｎｏ．２Ｍｉｄｄｌｅ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｇａｎｎａｎ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ １６２１００）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔａｋｉｎｇ ｔｈｅ ｒｏｕｎｄ ｌｅａｆ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｐｅｐｐｅｒ ｓｔｅｍｓ ａｓ ｔｅｓｔ ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｔｈｅ ｅｆｅｃｔ ｏｆ ６－ＢＡ，ＮＡＡ，ＩＢＡ ｏｎ ｐｅｐｐｅｒ
ｇｒａｓｓ ｃａｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｌａｎｔｌｅｔ ｒｏｏｔｉｎｇ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ，ｔｏ ｆｉｌｔｅｒ ｏｕｔ ｔｈｅ ｃａｌｕｓ ａｎｄ
ｓｈｏｏｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｒｏｏｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＭＳ＋１．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ
０．１ｍｇ／Ｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｄｕｃｔ ｏｆ ｃａｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，ｃａｌｕｓ ａｎｄ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄｓ ｏｐｔｉｍａｌ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ，１／２ＭＳ＋
ＮＡＡ ０．５ｍｇ／Ｌ＋０．５％ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｒｂｏｎ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｏｏｔｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｐｅｐｅｒｏｍｉａ ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ；ｃａｕｌｉｓ ｓｅｇｍｅｎｔ；ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ
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