全 文 ：2010年第 1卷第 2期
黑 龙 江 科 学
HEILONGJIANG SCIENCE
收稿日期：2010- 03- 03 基金项目：黑龙江省青年科学技术基金项目(编号：QCQ07C51)和东北农业大学创新项目(编号：CX2004- 2)
作者简介：徐婷（1983-），女，硕士研究生，研究专业：园林植物分子育种。
**通讯作者:Email: wangjingang99@yahoo.com.cn；Tel：13703603618
·1·
紫叶酢浆草遗传转化体系优化 *
Genetic Transformation System Optimization of
Oxalis Triangularis A.St.-Hil.‘Purpurea’
徐 婷， 吴 多， 杨 雪， 付慧娟， 王金刚 **
(东北农业大学 园艺学院，黑龙江哈尔滨 150030 )
XU Ting, WU Duo, YANG Xue, FU Hui-juan and WANG Jin-gang
（College of Horticulture,Northeast Agricultural University, Harbin 150030,China）
紫 叶 酢 浆 草 （Oxalis triangularis A.St.- Hil.
‘Purpurea’），又称紫蝴蝶，是酢浆草科酢浆草属多年
生草本植物。因其叶片紫红色、花淡雅清香、管理粗
放、园林应用广泛而深受人们喜爱。为了满足人们对
花卉求新求异的需要，且紫叶酢浆草本身具有的诸多
优良特性，对紫叶酢浆草进行转基因分子育种，培育
更多优良的酢浆草品种具有重要的现实意义。
目前紫叶酢浆草的研究多集中于栽培管理和组
织快繁等方面 [1,2]，对于转基因方面的研究还未见报
道。本试验以紫叶酢浆草叶片为外植体，利用根癌农
杆菌(Agrobacterium )介导法将查儿酮合成酶基因 RNA
干扰载体转入紫叶酢浆草中。根据已报道的紫花苜
蓿[3]、百合[4]、月季[5]、洋桔梗[6]、马铃薯[7]等植物遗传转化
的研究情况，对紫叶酢浆草遗传转化的主要影响因素
卡那抗性、除菌剂种类及浓度和侵染时间等影响因素
进行研究，旨在建立紫叶酢浆草高效遗传转化体系，
摘要：以紫叶酢浆草叶片为实验材料，通过农杆菌介导法将查尔酮合成酶基因 RNAi载体转入紫叶酢浆草中，同时对影响的卡那
筛选压力、除菌剂种类及浓度、侵染时间等因素进行了分析，确定了 Km筛选压力 30mg/L，除菌剂为阿莫西林 100mg/L，侵染时间为
7min。首次建立了紫叶酢浆草遗传转化体系，为紫叶酢浆草的分子育种打下基础。
关键字：紫叶酢浆草；遗传转化；除菌剂；卡那抗性
中图分类号：S 68Z.3 文献标识码：A 文章编号：1674- 8646（2010）02- 0001- 03
Abstract: In this experiment, purple leaves of oxalis are selected as raw materials, and CHS RNAi vector is loaded into the oxalis triangularis A.St.-
Hil.Purpurea by agrobacterium-mediated method, and the factors which have effects on the transformation are analyzed, such as Km selection pressure,
degerming agent species, concentration and time of infection, etc. The factors are confirmed as follows: Km selection pressure is 30mg/L, degerming agent
amoxicillin is 100mg/L, time of infection is 7min. The genetic transformation system of the oxalis triangularis A.St.-Hil.Purpurea is established for the first
time, and lays the foundation for molecular breeding of oxalis triangularis A.St.-Hil.Purpurea.
Key words: Oxalis triangularis A.St.-Hil.Purpurea; genetic transformation; degerming agent; Km resistance
为其转基因分子育种寻求一条快速有效的途径。
1 材料与方法
1.1 材料
紫叶酢浆草无菌苗，农杆菌 EHA105、查尔酮合成
酶 RNA干扰表达载体均由东北农业大学园林育种实
验室保存。Taq酶、DL2000购于 TaKaRa公司，卡那霉
素、头孢唑啉那、阿莫西林克拉维酸钾等均为国产针
剂，其它试剂均为分析纯。
M1培养基: MS+ NAA0.5mg/L+6- BA1.5mg/L
M2培养基:
MS+NAA0.5mg/L+6- BA1.5mg/Lkm30mg/L+Amo100mg/L
1.2 实验方法
1.2.1 卡那霉素筛选压力的确定
首先设定 0，25，50，75，100 mg/L 6个梯度，结果
表明除 0mg/L外分化率均为 0。此基础上，将 Km浓度
﹡
Vol． 1． No． 2，2010徐 婷等，紫叶酢浆草遗传转化体系优化·2·
重新设置为 0、5、10、15、20、25、30mg/L 7个梯度。具
体过程：将紫叶酢浆草叶盘分别接种在含 Km浓度为
0、5、10、15、20、25 mg/L的M1分化培养基上，光下培
养，每 15d继代一次，3周后统计分化结果。
1.2.2 除菌剂种类及浓度的确定
根据所查阅文献，选用 2种除菌剂，比较其除菌
效果及其对紫叶酢浆草叶盘分化的影响。分别是头孢
唑啉那 0、100、200、300、400、500、600 mg/L 7个梯度；
阿莫西林克拉维酸钾 0、25、50、75、100、125、150 mg/L
7个梯度。
并在此实验基础上设置 Amo0，75，100，125，
150mg/L 5个梯度，将紫叶酢浆草叶盘接种于含有不
同浓度 AmoM1培养基上，筛选不抑制植物生长的最
大除菌剂浓度。
1.2.3 农杆菌最佳侵染时间的确定
采用 OD600＝0.6~0.8的农杆菌菌液侵染预培养 3d
的无菌苗叶片，设计的侵染时间分别为 2，5，7，10，15，20
min，侵染结束后，将其接种到M2培养基上，培养一段时
间后，观察其外植体和农杆菌的长势并记录结果。
1.2.4 农杆菌对外植体的侵染
根据《植物基因工程》[8]根瘤农杆菌叶盘法转化，
将查尔酮合成酶RNA干扰表达载体转入到紫叶酢浆草。
1.2.5 转基因植株 PCR 检测
用 PBI- CHSi 中的 GUS- 1 和 CHSF- A为的引物
进行 PCR 检测。具体反应条件如下：94℃预变性
7min；94℃变性 30s；65℃退火 30s；30个循环；72℃延
伸 1.5min；72℃延伸 10min；4℃终止反应。电泳分析
结果。
2 结果与分析
2.1 卡那霉素筛选压力的确定
将 Km 浓度重新设置为 0、5、10、15、20、25 、
30mg/L 7个梯度。结果见表 1和图 1。
表 1卡那霉素浓度梯度试验
Table 1 The gradient experiment of kanamycin concentration
Km浓度 / mg·L-1 接种外植体数 外植体分化数 分化率 /%
0 30 30 100
5 50 50 100
10 50 44 88
15 50 37 74
20 55 17 30.9
25 70 4 5.7
30 60 0 0
注：本试验为三次重复的结果。基本培养基为MS+6- BA1mg/L+NAA 0.1mg/L。
图 1卡那霉素筛选压力的确定
Fig. 1The experiment of Km selection pressure
由表 1 和图 1 可知，第一次接种 Km 浓度为
25mg/L时紫叶酢浆草叶盘分化率为 0，第二次接种
Km浓度为 25mg/L时紫叶酢浆草叶盘分化率为 5.
7%。说明具有个体差异性。因此为了提高筛选效果，减
少因个体差异而出现的未转化目的基因的抗性植株，
将 Km浓度确定为 30mg/L。
2.2 除菌剂浓度的测定
含有 CHS基因 RNAi表达载体的农杆菌加入到
含有不同浓度除菌剂的 YEP培养基中 200r/min，28℃
培养 48 h，用紫外分光光度计检测浓度。结果见图 2。
图 2 除菌剂及浓度筛选
Fig. 2 Selection of degerming agent and concentration
当 Amo100~150mg/L能有效抑制农杆菌的生长；
当 Cef 300~500mg/L时能有效抑制农杆菌的生长。同
时设置 Amo0，75，100，125，150mg/L5个梯度接种紫叶
酢浆草叶盘，筛选不抑制植物生长的最大除菌剂浓
度。结果见表 2。
表 2除菌剂浓度梯度实验
Table 2 The gradient experiment of degerming agent concentration
Amo浓度 / mg·L-1 接种外植体数 外植体分化数 分化率 /%
0 60 60 100
75 60 46 76.67
100 60 43 71.67
125 60 36 60
150 60 31 51.67
在 Amo浓度为 100mg/L时，外植体的分化率为
71.67%与 Amo浓度为 76.67%时差距不大，而当 Amo
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表 3农杆菌侵染时间确定
Table 3 The time of infection of agrobacterium
侵染时间 /min 侵染数量 分化数 分化率 /% 外植体形态
2 60 5 8.33 分化率低，长势较弱。
5 60 11 18.33 长势较好，褐化率较低
7 60 19 31.67 分化率较高，长势良好。
10 60 9 15 长势较好，褐化率较低
15 60 2 3.3
20 60 0 0 分化率很低，褐化率高，且除菌困难
浓度为 125mg/L时，外植体分化率仅为 60%。且当
Amo100~150mg/L均能有效抑制农杆菌的生长，本着
筛选不抑制植物生长的最大除菌剂浓度的原则，确定
紫叶酢浆草转化除菌剂浓度为 Amo100mg/L。
·3·
2.3 农杆菌最佳侵染时间的确定
实验证明不同的侵染时间对外植体的转化有较
大的影响。对不同侵染时间的外植体分化进行了统计
和观察，结果见表 3。
从表 3中可以看出，侵染时间为 2 min时，转化率
稍低，植株长势弱；侵染时间为 15~20 min时，转化几
乎不成功；且褐化率高，除菌困难；侵染时间 5~10 min
时分化率较高，褐化率低，除菌较容易，其中侵染时间
为 7 min时，植株长势最好，确定侵染时间为 7 min。
2.4 农杆菌对外植体的侵染
经试验确定农杆菌对紫叶酢浆草侵染转化的具
体条件为：
预培养培养基:MS+ NAA0.5 mg/L+6- BA1.5 mg/L；
预培养时间为 3 d；侵染时间为 7 min；共培养时间为
2~3d；筛选培养基 :MS+NAA0 . 5mg/L+6- BA1 . 5mg/L
+km30mg/L+Amo100mg/；25℃光照培养，15~20d 继代
一次。大约 25~30d分化出不定芽，当芽长至 3cm时进
行生根培养，然后进行驯化培养。图 3为转基因植株
再生过程。
图 3 紫叶酢浆草植株再生
Fig. 3 Plant regeneration of oxalis triangularis A.St.-Hil.‘Purpurea’
2.5 转基因植株的 PCR检测
以转 pBI- CHSi质粒抗性植株的总 DNA为模板，
以质粒 pBI- CHSi为阳性对照，分别以未转化植株的
总 DNA和水为阴性对照和负对照，以 CHSi基因序列
特异引物进行 PCR扩增。阳性对照和部分转基因植株
扩增出约 509p的目的片段，而阴性对照无扩增带（见
图 4）。用得到的 23个转基因植株进行检测，结果表明
其中有 9株为阳性植株，阳性率为 37.5 %。
M：DL200marker；1～10：抗性植株；＋：阳性对照；－：阴性对照和负对照
M：DL2000 marker；1～10：Regeneration plants；
＋：Positive control；－：Negative control
图 4 转 pBI-CHSi质粒抗性植株的 PCR检测
Fig. 4 PCR analysis of regeneration plants
3 结 论
本实验在实验室已有的研究基础上，确定了紫叶
酢浆草利用农杆菌叶盘法转化的最佳遗传转化体系：
预培养培养基 M1：MS+ NAA0.5mg/L+6- BA1.5mg/L；
预培养时间为 3d；侵染时间为 7min；共培养时间为
2~3 d；筛选培养基:MS+NAA 0.5 mg/L+6- BA 1.5 mg/L
km 30 mg/L+Amo 100 mg/L；卡纳筛选浓度为 30 mg/L,
除菌剂为 Amo 100 mg/L，25℃光照培养。
在此条件下，观察到转基因植株生长势较弱，生
分化率很低，植株长势弱，褐化率高，
且除菌困难
（下转第 11页）
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3.1 对石油化工装置建模
在熟悉流程的基础上，按照建模的基本流程与步
骤，首先进行关键变量的选取，同时列写出对关键变
量有影响的参数依照上述步骤建立 SDG模型后，经过
反复简化以及与现场工艺人员校验，最终得到关于整
个流程的 SDG- HAZOP模型。
3.2 安全评价软件具备的功能
（1）全流程图形化 SDG- HAZOP建模与组态；
（2）异常工况在线咨询；
（3）基于深度优先的推理引擎，推理深度与效率高；
（4）面向多种接口的数据采集。
3.3 现场实施
将异常工况在线咨询系统软件与现场实际装置
相连，从现有 DCS系统上采集数据。通过长周期在线
运行，检测系统诊断软件的稳定性和对工况的适应能
力，对工艺单元进行了 HAZOP安全评价，并开发完成
石油化工装置异常工况在线咨询系统。
4 结论及展望
通过对石油化工装置进行全面、深入地计算机自
动安全评价，深度挖掘生产装置中潜在的安全隐患。
在评价结论的基础上所开发石油化工装置异常工况
在线咨询系统，在非正常工况发生时能够实时地对危
险原因进行诊断定位和不利后果的提前预测，从而提
高操作人员对紧急情况的处理能力。对出现的问题及
时进行处理，使生产运行状态保持平稳。通过对影响
原材料用量的过程以及对水、电、蒸汽等用量的监测
和分析，可以及时发现问题，特别对生产调度来说，可
以及时平衡物料供应，减少单耗，提高经济效益；可以
使成本控制发生在生产过程中，而不是在生产过程完
成后，以达到降低成本的目的。同时还能大大提高企
业生产的安全可靠性，对提高企业的经济效益和社会
效益有着深远的意义。
参考文献：
[1] 吴重光 .过程系统仿真技术 [M].中国石化工业出版社 ,1998.
[2] Kletz, T. A. (1999). HAZOP and HAZAN. In Loss prevention. (4thed).
Rugby, UK: Institution of Chemical Engineers.
[3] Ramesh Vaidhyanatha, Venkat Venkatasubramanian. Experience with a
Expert System for Hazop Analysis [J]. Computers Chem, 1996, 20:
1589- 1594.
[4] V. Venkatasubramanian, J. Zhao, and S. Viswanathan. Intelligent System
for HAZOP Analysis of Complex Process Plants [J]. Computers Chem.
Engng. 2000, 24:2291- 2302
[5] 顾祥柏.石油化工安全分析方法及应用[M].北京：化学工业出版
社，2001
[6] Rajagopalan Srinivasan and Venkat Venkatasubramanian, Automating
HAZOP analysis of batch chemical plants: Part I the knowledge repre
sentation framework, Computers Chem, Engng [J], 1998,Vol.22, No.9.
pp. 1345- 1355
[7] Rajagopalan Srinivasan and Venkat Venkatasubramanian, Automating
HAZOP analysis of batch chemical plants: Part II Algorithm and applica-
tion, Computers Chem, Engng [J] , 1998, Vol.22, No.9. pp.
[8] Suh J C, Lee S, Yoon E S. NewStrategy for Automated Hazard Analysis
of Chemical Plants. Part 2: Reasoning Algorithm and Case Study [J].
Journal of Loss Prevention in the Process Industries, 1997,10 (2):
127- 134.
[9] Dimitradis V D, Shah N, Pantelides C C. Modeling and Safety Verifica-
tion of Discrete/Continuous Chemical Processing Systems [J]. American
Institute of Chemical Engineering Journal, 1997,43 (4): 1041- 1059.
1357- 1370
[10] 杨帆，萧德云，SDG建模及其应用的进展 [J].控制理论与应用 ,
2005，22（5）：768
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
长缓慢，比正常植株生长要迟缓半个月左右。经分析
认为由于转入的是查儿酮合成酶 RNAi，查儿酮合成
酶基因是色素形成的关键基因，对其基因的干扰不仅
在花色形成上产生影响，对其光合作用也可能产生影
响，如果实验顺利，我们对其功能的变化进行进一步
研究。本研究紫叶酢浆草转化率为 31.67%，转化率偏
低，且有褐化现象。今后将对于农杆菌侵染时间及如
何提高紫叶酢浆草的转化率，降低褐化进行进一步的
探讨及实验。
参考文献：
付慧娟，徐婷.紫叶酢浆草体细胞无性系建立的研究[A].中国观赏园
艺研究进展［C］.北京:中国林业出版，2008：241- 244.
胡国富，李凤兰，胡宝忠，等.三角紫叶酢浆草的组织培养[J],北方园
艺，2008(6) :176- 178.
曲静，王丕，杨金慧.农杆菌介导紫花苜蓿子叶遗传转化的影响因素
研究[J]，安徽农业科学，2009, 37 (22) : 10421- 10423.
王凯,车代弟,王金刚,等.百合遗传转化体系的建立[J].东北农业大
学学报，2008,39(5): 39- 43.
高莉萍，包满珠.优化农杆菌介导的月季遗传转化系统的研究[J].北
京林业大学学报，2005,27(4):60- 64.
郑阳霞,黄彬城.农杆菌介导的洋桔梗遗传转化体系的建立[J].核农
学报，2009 ,23 (4) :597- 60.
卢翠华，邸宏.马铃薯微型薯外植体遗传转化体系的优化[J].作物杂
志，2009(1):31- 34.
王关林,方宏筠.植物基因工程[M].北京：科学出版社，2009：479- 481.
（上接第 3页）
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