全 文 ：榄仁树(Terminalia catappa)别名枇杷树、 法国
枇杷， 为使君子科(Combretaceae)榄仁树属落叶乔
木， 高15m或更高， 5～6月开花， 9月果实成熟，
原产于马达加斯加、 印度东部和安达曼群岛及马来
榄仁内生真菌 JLR6的鉴定及
其发酵条件优化①
郭洪成 1)② 吴亚腾 1) 王春龙 2) 柳志强 1)③
(1 海南大学环境与植物保护学院 海南海口 570228
2 东营市东营区海洋与渔业局 山东东营 257000)
摘 要 榄仁是热带及亚热带地区的一种常见药用植物， 目前关于榄仁内生真菌的研究较少。 从榄仁体内分离
出一株内生真菌 JLR6， 利用对峙生长法测试 JLR6对香蕉炭疽菌及芒果炭疽菌的拮抗活性， 通过 ITS序列分析
对其进行初步鉴定， 并利用 Plackett-Burman设计结合响应面的方法对菌株 JLR6的发酵条件进行了优化。 结
果表明： 菌株 JLR6对香蕉炭疽菌及芒果炭疽菌有明显的拮抗活性， 皿内抑制率分别为 45.50%和 57.90%， 通过
ITS序列分析， 初步将 JLR6鉴定为 Diaporthesp.； 优化后菌株 JLR6的最适发酵条件为细菌学蛋白胨 10g/L、 葡
萄糖 20g/L、 酵母粉 17.82g/L、 装液量 87.59mL、 接种量 9.06%， 于 180r/min、 28℃条件下培养 7d， 生物量
达到4.79g/L。
关键词 榄仁 ； 内生真菌 ； Diaporthe sp.； 拮抗活性 ； 发酵条件优化
分类号 Q939.95Doi： 10.12008/j.issn.1009-2196.2016.01.008
Identification of an Endophytic Fungi JLR6 form Terminalia catappa
and Optimization of its Fermentation Conditions
GUO Hongcheng1) WU Yateng1) WANG Chunlong2) LIU Zhiqiang1)
(1 College of Environment and Plant Protection， Hainan University, Haikou, Hainan 570228
2 Ocean and Fisheries Bureau of Dongying District, Dongying, Shandong 257000)
Abstract Terminalia catappa is a common medicinal plant in tropical and subtropical regions, and there
is few study on its endophytic fungi so far. An endophytic fungi JLR6 was isolated from Terminalia
catappa, and its antagonistic activity to Colletotrichum musae and Colletotrichum gloeosporioides were
determined by confrontation growth method. The strain was identified by ITS sequence analysis, and the
fermentation conditions were optimized by Plackett-Burman design and response surface methodology.
The results showed strain JLR6 had obvious antagonistic activity to C. musae and C. gloeosporioides, and
the inhibition rates were 45.50% and 57.90%, respectively. Strain JLR6 was identified as Diaporthe sp.
according to ITS sequence. After optimization, the optimal fermentation conditions were 10 g/L peptone,
20 g/L glucose, 17.82 g/L yeast extract, 87.59 mL of loading volume and 9.06% of inoculum size. After 7
d culture on 28℃, 180 r/min, the biomass was up to 4.79 g/L.
Keywords Terminalia catappa ; endophytic fungi ; Diaporthe sp. ; antagonistic activity ; optimization of
fermentation condition
Vol．36, No．1
2016年1月 热 带 农 业 科 学
CHINESE JOURNAL OF TROPICAL AGRICULTURE
第36卷第1期
Jan． 2016
① 基金项目： 国家自然科学基金项目(No.31160377)。
收稿日期： 2015-09-01； 责任编辑/林海妹； 编辑部 E-mail: rdnk@163.com。
② 郭洪成(1991～)， 男， 本科， 主要研究方向为微生物学， E-mail: 762853219@qq.com。
③ 通讯作者： 柳志强(1980～)， 男， 博士， 副教授， 主要研究方向为微生物学， E-mail: liuzhiqiang80@126.com。
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2016年1月 第36卷第1期热带农业科学
表2 响应面试验设计因子水平
因素
水平
-α -1 0 1 α
A(酵母粉)/(g·L-1) 6.59 10.00 15.00 20.00 23.41
B(装液量)/mL 63.18 70.00 80.00 90.00 96.82
C(接种量)/% 7.32 8.00 9.00 10.00 10.68
半岛， 在中国海南、 广东、 广西、 台湾、 福建等地
均有分布[1]。
植物内生菌(endophyte)指那些在其生活史中
的某一段时期或全部阶段生活于健康植物各组织和
器官内部， 不引起被感染的宿主植物组织症状明显
改变的菌类， 包括那些在其生活史中的某一阶段表
面生的腐生菌、 对宿主暂时没有伤害的潜伏病原菌
和菌根菌[2]。 内生菌在植物体内能产生多种生物学
作用， 如提供植物所需要的营养物质， 参与植物的
防卫功能， 促进植物快速生长， 增强植物抗逆、 抗
病、 抗虫的能力[3]。 因此， 内生菌对植物病害的生
防作用及其开发利用引起了广泛关注。 目前有关榄
仁内生菌的研究较少， 本研究从榄仁体内分离出一
株内生真菌JLR6， 发现其对香蕉炭疽菌及芒果炭
疽菌具有较好的拮抗效果， 利用ITS序列分析对该
菌株进行了初步鉴定， 并通过响应面法对其发酵条
件进行了优化， 为今后的应用奠定一定基础。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1供试材料
榄仁茎采自海南大学儋州校区 ， 内生真菌
JLR6从榄仁茎中经组织表面消毒分离获得。 香蕉
炭疽菌(Colletotrichum musae)和芒果炭疽菌(C.
gloeosporioides Penz)由海南大学环境与植物保护学
院提供。
1.1.2培养基
PDA培养基： 马铃薯 200 g， 葡萄糖 20 g， 琼
脂20g， 蒸馏水1000mL。
CM培养基： 蛋白胨 5g， 酵母粉 5g， 葡萄糖
10g， 蒸馏水1000mL。
1.2方法
1.2.1菌株 JLR6皿内拮抗活性测定
在直径为9cm的PDA平板中央分别接种一块直
径为5mm的香蕉炭疽菌、 芒果炭疽菌的菌饼， 菌丝
面朝下， 同时在菌饼一侧接种一块JLR6菌饼， 以不
接内生真菌JLR6的平板为对照， 每处理3次重复，
于28℃培养7d， 测试菌株JLR6的皿内拮抗活性。
抑菌活性/%＝(对照组病原菌生长距离－试验
组病原菌生长距离)/对照组病原菌生长距离×100
1.2.2ITS序列分析
菌株 JLR6基因组的提取采用 CTAB法。 利用
ITS通用引物(ITS1： 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，
ITS4： 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行基因扩
增， 由上海英骏生物技术有限公司进行序列测定，
将测序结果在GenBank中进行Blast分析。
1.2.3菌株 JLR6的发酵条件优化
采用摇瓶试验进行发酵条件优化 ， 将菌株
JLR6接种于 CM培养基中， 于 28℃、 180r/min条
件下振荡培养 3d， 将种子培养液转接入发酵培养
基中， 按照如下方案进行发酵条件优化。 Plack-
ett-Burman设计： 选用 11因素、 试验次数为 12
的Plackett-Burman设计， 对5个因素进行2水平
设计(表1)， 以生物量为响应值， 利用Design-Ex-
pert 8.0进行显著性分析。
对于Plackett-Burman设计选择的3个显著因
子A、 B、 C(酵母粉、 装液量和接种量)， 根据中心组合
设计(Central Composite Design， CCD)原理， 从
5个水平(-α， -1， 0， +1， α)进行考查(表 2)， 以
生物量为响应值， 确定其最优条件。
生物量计算采用干重法， 将菌株发酵液过滤，
收集菌丝体， 用去离子水洗涤3次， 置于真空干燥
箱烘至恒重， 称量并计算生物量。
2 结果与分析
2.1菌株 JLR6的皿内拮抗活性
表1 Plackett-Burman试验因素水平
因素 编号
水平
-1 1
细菌学蛋白胨/(g·L-1) X1 10.00 15.00
酵母粉/(g·L-1) X2 10.00 15.00
葡萄糖/(g·L-1) X3 20.00 30.00
装液量/mL X4 50.00 100.00
接种量/% X5 5.00 10.00
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郭洪成 等 榄仁内生真菌 JLR6的鉴定及其发酵条件优化
表4 Plackett-Burman设计各因素的效应结果
编号 因素 效应值 F 值 p 值
X1 细菌学蛋白胨 -3.67E-03 19.36 0.1423
X2 酵母粉 -0.023 761.76 0.0231
X3 葡萄糖 0.018 475.24 0.0292
X4 装液量 0.110 16078.24 0.0050
X5 接种量 0.064 5867.56 0.0083
菌株 JLR6在 PDA平板上的菌落呈絮状或绒毛
状， 乳白色或灰黑色， 菌落边缘不规则(图1)。 利
用对峙生长法测试了菌株 JLR6对香蕉炭疽菌及芒
果炭疽菌的拮抗活性， 结果见图2。 可以看出， 菌
株JLR6对 2种病原菌均具有明显的拮抗作用， 能
够有效抑制病原菌菌丝在 PDA培养基中的扩展。
经测定， 菌株 JLR6对香蕉炭疽菌及芒果炭疽菌的
皿内抑制率分别为45.50%和57.90%。
2.2ITS序列分析
对菌株JLR6的ITS序列进行PCR扩增， 产物
经纯化后测序， 得到 605 bp的碱基序列。 将 ITS
序列进行 Blast分析， 发现其与 Diaporthe 属中多
个 菌 株 (Genbank登 录 号 分 别 为 JQ514150， JN153055，
EF423532， GQ352484)的同源性达到 99%， 因此初步将
JLR6鉴定为 Diaporthe sp.。
2.3JLR6发酵条件的优化
为获得菌株 JLR6的最适发酵条件， 首先通过
Plackett-Burman试验考察细菌学蛋白胨 、 酵母
粉、 葡萄糖、 接种量、 装液量5个因素对菌体干重
的影响， 结果见表 3， 各因素效应结果见表 4。 表
4中 p 值表示各因子对菌体发酵影响的显著性， 若
p 值小于 0.05， 说明该因素对 JLR6发酵过程的影
响显著。
从表4可以得出， 酵母粉、 葡萄糖、 装液量和
接种量4个因子的影响是显著的； F 值表征因子对
JLR6生物量的影响程度， F 值越大， 表明该因子
对生物量的影响程度越大。 在 JLR6发酵过程中，
装液量对其生物量的影响最大， 其次是接种量和酵
母粉， 葡萄糖影响相对较小， 而细菌学蛋白胨对生
物量的影响不显著。 经过 Plackett-Burman试验，
将酵母粉、 装液量和接种量3个显著因子做进一步
优化， 以确定最适水平。
针对Plackett-Burman试验确定的3个显著因
图1 菌株JLR6的菌落图(A)及菌丝显微图(B)
A B
表3 Plackett-Burman试验结果
试验 X1 X2 X3 X4 X5
生物量
/(g·L-1)
1 1 1 -1 1 1 3.90
2 -1 1 1 1 1 4.19
3 1 -1 1 -1 1 3.91
4 -1 1 -1 1 -1 4.00
5 -1 -1 1 1 1 4.00
6 -1 -1 -1 -1 1 3.88
7 1 -1 -1 1 -1 3.82
8 1 1 -1 -1 1 3.86
9 1 1 1 -1 -1 3.75
10 -1 1 1 -1 -1 3.53
11 1 -1 1 1 -1 4.09
12 -1 -1 -1 -1 -1 3.79
图2 菌株JLR6对香蕉炭疽菌(A)及
芒果炭疽菌(B)的皿内拮抗作用
B
A
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2016年1月 第36卷第1期热带农业科学
子(酵母粉、 装液量和接种量)进行响应面分析， 试验设
计及结果见表 5， 方差分析结果见表 6。 借助 De-
sign expert 8.0软件对试验数据进行二次多元回
归拟合， 得到二次回归方程为：
Y＝4.49＋0.5A＋0.13B＋0.11C－0.041AB＋
0.016AC＋0.071BC－0.28A2－0.13B2－0.17C2
其中， Y表示JLR6生物量。 从表6可以看出，
该模型的 p 值＜0.01， R2＝97.6%， 说明该模型能
够较好地模拟JLR6的发酵过程。
依据回归方程做响应面图， 结果见图 3、 4。
图3表示接种量为9.06%时， 酵母粉浓度和装液量
对JLR6生物量的交互影响， 可以看出酵母粉浓度
和装液量分别在 16～20 g/L和 80～90 mL时， 生
物量较大。 图 4表示酵母粉浓度为 17.82 g/L时，
装液量和接种量对 JLR6生物量的交互影响， 当装
液量和接种量分别在 80～90 mL和 9%～10%时 ，
菌株 JLR6生物量较大 。 通过软件进一步分析计
算， 得到预测最大生物量为 4.678g/L， 此时酵母
粉浓度为 17.82g/L， 装液量为 87.59mL， 接种量
为9.06%。
为了验证模型的准确性和有效性， 按照优化后的
最适发酵条件(细菌学蛋白胨10g/L， 葡萄糖20g/L， 酵母粉
17.82g/L， 装液量87.59mL， 接种量 9.06%)， 于180r/min、
28℃条件下培养 7d， 测得生物量为 4.79g/L， 与
预测值 4.69g/L相接近， 说明试验设计与响应面
分析方法能够较好地模拟 JLR6的发酵过程， 结果
表5 响应面试验设计及结果(n＝20)
试验 A B C 生物量/(g·L-1)
1 10.00 70.00 8.00 3.45
2 20.00 70.00 8.00 4.16
3 10.00 90.00 8.00 3.37
4 20.00 90.00 8.00 4.26
5 10.00 70.00 10.00 3.34
6 20.00 70.00 10.00 4.46
7 10.00 90.00 10.00 3.89
8 20.00 90.00 10.00 4.70
9 6.59 80.00 9.00 2.73
10 23.41 80.00 9.00 4.62
11 15.00 63.18 9.00 3.86
12 15.00 96.82 9.00 4.35
13 15.00 80.00 7.32 3.96
14 15.00 80.00 10.68 4.05
15 15.00 80.00 9.00 4.46
16 15.00 80.00 9.00 4.55
17 15.00 80.00 9.00 4.42
18 15.00 80.00 9.00 4.59
19 15.00 80.00 9.00 4.51
20 15.00 80.00 9.00 4.45
表6 回归模型的显著性检验
项目 平方和 自由度 均方 F 值 p值
模型 5.49 9 0.61 45.20 ＜0.0001
A 3.47 1 3.47 257.02 ＜0.0001
B 0.25 1 0.25 18.24 0.0016
C 0.17 1 0.17 12.32 0.0056
AB 0.014 1 0.014 1.00 0.3403
AC 0.0021 1 0.0021 0.16 0.7017
BC 0.041 1 0.041 3.03 0.1124
A2 1.15 1 1.15 85.62 ＜0.0001
B2 0.24 1 0.24 18.15 0.0017
C2 0.4 1 0.4 29.66 0.0003
说明： R2＝97.6%； AdjR2＝95.44%； PredR2＝83.91%。
图3 酵母粉浓度和装液量对生物量影响的响应面
4.8
4.6
4.4
4.2
4.0
3.8
3.6
3.4
90.00
85.00
80.00
75.00
70.00
20.00
18.00
16.00
14.00
12.00
1 .00
A： 酵母粉B： 装液量
Y
：
生
物
量
图4 装液量和接种量对生物量影响的响应面
4.8
.6
4.4
4.2
4.0
3.8
3.6
3.4
90.00
85.00
80.00
75.00
70.00
1 .00
B： 装液量C： 接种量
9.50
9.00
8.50
8.00
Y
：
生
物
量
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郭洪成 等 榄仁内生真菌 JLR6的鉴定及其发酵条件优化
可靠。
4 讨论与结论
榄仁是热带及亚热带地区的一种常见药用植
物， 民间常用于防治肝炎、 肝腹水、 肝癌等各种肝
病， 功效显著[4]。 目前关于榄仁的研究多集中于其
药用活性及药理机制方面， 如一些研究者发现， 榄
仁叶提取物对急慢性肝损伤具有一定的防护作用，
其机理可能与其对抗脂质过氧化、 保护线粒体及肝
细胞有关[4-5]。 但目前关于榄仁内生真菌的研究报道
很少 ， 本研究从榄仁体内分离出一株内生真菌
JLR6， 发现其对香蕉炭疽菌及芒果炭疽菌均有较好
的拮抗活性 ， 其皿内拮抗活性分别为 45.50%和
57.90%， 通过 ITS序列分析初步将其鉴定为 Dia-
porthe sp.。
近年来， 国内外已筛选到多株可用于香蕉炭疽
病的生防菌株， 涉及细菌、 放线菌、 酵母、 丝状真
菌等， 例如 Streptomyces aureofaciens[6]、 Trichoder-
ma harzianum[7]、 Pichia anomala[8]、 Candida oleophila
[8]、 Pseudomonas syringae[9]、 Burkholderia spinosa[10]、
Bacillus amyloliquefaciens[11]、 Pantoea agglomerans[12]、
Bacillus subtilis[13]和 Pseudomonas fluorescens[14]等 ；
在芒果炭疽病生防菌的筛选方面也取得了不少进
展， 研究发现 Bacillus subtilis[15]、 Bacillus amyloliq-
uefaciens[16]、 绿色木霉菌[17]、 季也蒙毕赤酵母[18]、
Meyerozyma caribbica[19]和 Cryptococcus laurentii[20]
等对芒果炭疽病具有较好的防治效果。 然而， 目前
还未见有关 Diaporthe sp.用于香蕉炭疽菌及芒果炭
疽菌防治的报道。
传统的发酵条件优化方法如单因素优化法， 存
在数据利用率不高、 试验次数多及试验结果不准确
等问题[21]。 Plackett-Burman设计是一种 2水平的
试验设计方法， 它可以利用较少的实验次数， 从众
多的考察因素中快速有效地筛选出主要的影响因
子， 被广泛应用于因子主效应的估计[22]。 响应面法
是一种优化生物过程的综合技术， 采用该法可以建
立连续变量曲面模型， 对影响生物产量的因子水平
及其交互作用进行优化与评价[23]， 响应面法已经被
成功应用于许多发酵过程的优化当中[24-26]。 本研究
利用 Plackett-Burman设计对 JLR6的发酵条件进
行了筛选， 获得了3个主要的显著因子， 即酵母粉
浓度、 装液量和接种量。 利用响应面法对3个显著
因子进行优化， 建立了二次多项方程模型， 获得了
最适的发酵条件， 在验证试验中得到的实测值与预
测值接近， 模拟结果较好。
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