全 文 ：1998年　 12月
第 22卷　第 4期
河北师范大学学报 (自然科学版 )
Journa l o f Hebei No rma l Univ ersity( Na tural Science )
Dec. 1998
Vo l. 22 No. 4
白芷细胞外 CaM结合位点
的扫描电镜定位研究
宋春凤1)　孙大业 2)　刘贵生1)　李向印 1)　郭　毅2)　王朝辉 2)
( 1)河北医科大学电镜实验中心 , 050017,石家庄 ; 2)河北师范大学生物系 , 050016,
石家庄 ;第一作者 35岁 ,女 ,在读博士 )
摘　要　利用胶体金标记的具有生物活性的钙调素 ( Ca lmodulin, CaM ) ,对白芷愈伤组
织培养细胞胞外钙调素结合位点进行了扫描电镜定位 ,发现白芷愈伤组织培养细胞表面有不
同密度的金颗粒 ,证明其细胞表面存在着 CaM结合位点 .
关键词　白芷 ; 细胞外 CaM ; 胶体金 ; 扫描电镜
分类号　 Q73
CaM是 Ca2+ 的多功能受体 ,传统上认为它是存在于胞内参与调节细胞的各种生理活
动 . 1984年 MacNeil等 [ 1, 2]在动物细胞 , Bi ro与孙大业等 [ 3]在植物细胞 ,同时报道了胞外
CaM的存在 .随后李红兵等又证明其具有某种特定的功能 [ 4, 5] .最近唐军等又在白芷细胞
壁检出 ,纯化了一种 21kd的 CaM BPs[6 ] .本文以白芷愈伤组织培养细胞为材料 ,对其细胞
外 CaM结合位点进行了扫描电镜定位 ,试图为胞外 CaM的作用机理研究提供进一步的
线索 .
1　材料和方法
1. 1　实验材料
1. 1. 1　白芷愈伤组织培养细胞由山东大学植物生理组提供 .基本培养基为 MS固体培养
基 ,补加蔗糖 30g /L, 2, 4 D 1mg /L, 6 BA 0. 5mg /L,琼脂 5. 5g /L,起始 pH5. 8,分装灭
菌 ,转接白芷愈伤组织于 LRH 250 G型光照培养箱中 26± 1℃暗培养 ,每 7～ 10d转接 1
次 ,取培养第 9天生长旺盛进入对数生长期的材料进行样品制备 .
1. 1. 2　牛血清白蛋白 ( BSA) , N-2-hydroxyethy l piperazine-N -2-ethanesulfonic acide
( HEPES) , t rif luoperazine( T EP)为 Sigma产品 , calmodulin( CaM )为本室自制 .
1. 2　植物金标 CaM的制备
1. 2. 1　按 Frens( 1973) [7 ]的方法制备 40nm的胶体金
1. 2. 2　参照 Fujimo to等人 ( 1989) [8 ]对动物 CaM标记的方法 ,用提纯的花椰菜 CaM进
行胶体金标记 ,并用醋酸纤维素斑点免疫金银染色法对其进行检测 ,证明它能特异性地与
CaM的靶酶 PDE结合 ,具有很高的的特异性和敏感性 .另外对 PDE的激活实验还表明
PDE的活性与加入的金标 CaM呈剂量关系 ,说明标记后的 CaM依然保持着其原有的生
河北省自然科学基金资助项目
收稿日期: 1998 03 14;修回日期: 1998 04 23
DOI : 10. 13763 /j . cnki . jhebnu. nse. 1998. 04. 032
物活性 .
1. 3　白芷愈伤组织培养细胞外 CaM BPs的扫描电镜胶体金标记
取生长旺盛的白芷愈伤组织培养细胞 ,用含 1mmol EGT A的 20mmo l /L的 HEPES
buffer pH7. 2离心洗涤 2次 ,然后取约 0. 1m l的细胞沉淀物加入 0. 1ml含有植物金标 CaM
( 1 20稀释 )和 1mmol /L Ca2+ 的胶体金试剂 ,充分混匀 ,室温孵育 1h,每 10min摇动 1次 ,然
后用含 1mmo l /L Ca2+的 20mmol /L HEPES buf fer洗涤 3次 (每次 10min) , 2. 5%的戊二醛
HEPES buf fer固定过夜 ( 4℃ ) , 20mmo l /L HEPES buffer洗涤 3次 (每次 10min ) , 1%
OsO4室温固定 1h, 50%～ 100%酒精系列梯度脱水 (每次 10min) ,醋酸异戊酯置换 2次 (每
次 30min) ,置换后的细胞 ,滴于 IB 3离子镀膜机进行离子蚀刻的载玻片上 ,使细胞吸附
于载玻片上迅速进行临界点干燥 , IB 3离子镀膜机镀金 , S 520扫描电镜观察 .
对照组为: ( 1)细胞沉淀物用含 1mmol /L EGTA的金标 CaM孵育 1h,以检测金标
CaM与细胞表面 CaM结合位点的结合是否为 Ca2+ 所依赖的 ; ( 2)用含 100μmol /L T FP
的金标 CaM孵育 1h,以检测结合的专一性 .
2　结　果
用颗粒为 40nm的花椰菜金标 CaM对白芷愈伤组织培养细胞进行的胞外 CaM结合
位点的胶体金标记结果显示 ,愈伤组织培养细胞成团 ,见图 1;单个细胞完整 ,图 2;在 Ca2+
存在的情况下 ,白芷培养细胞壁表面有不同密度的金颗粒分布 ,见图 3,图 5;在 EGTA、
T FP存在下 ,细胞壁表面几乎见不到金颗粒 ,见图 4,图 6.进一步证明了 TEM上的研究结
果 .另外 ,在 SEM图象上我们还看到在 Ca2+ 存在的情况下 ,一个细胞团中大部分细胞都
有金颗粒标记 ,但有一些细胞却没有金颗粒 ,甚至在一个细胞表面可以看到标有金颗粒 ,
而相邻的细胞却完全看不到金颗粒 ,见图 3.而且在同一个细胞中金颗粒的分布也不同 ,有
的地方较多 ,有的地方稀少 ,或几乎完全不存在任何金颗粒 .
3　讨　论
利用扫描电镜观察不同的细胞以及同一细胞的不同部位的表面立体形态 ,及其相关
成分的分布 ,具有 TEM无法比拟的优越性 .利用扫描电镜胶体金定位 ,发现植物金标
CaM在白芷培养细胞表面呈不同的分布 ,有的部位较密集 ,有的部位较稀疏 ,甚至缺失 ,
加上 T EM观察 ,对照组中加过量 CaM可使金标 CaM与细胞壁表面结合位点的结合逆
转 (另文报道 ) .因此这些 CaM的结合位点可能具有受体的某些特性 ,目前 ,已有一些工作
表明细胞外侧空间存在着植物激素的受体 ,如 Jones( 1993) [9 ]和 Aderson等 ( 1994) [10 ]分
别报道了生长素和 ABA可能分布在几个亚细胞位点 ,其中就包括质膜外侧空间 .最近
Wyat t等还报道 ,在植物细胞中存在着细胞壁 (细胞外基质 ) 细胞骨架连续体 ,认为植物
细胞可以通过这一连续体接受和转导外界刺激 ,调节植物的生长发育等各种生理活动 .结
合本研究及与之相关的胞外 CaM的工作 ,我们认为胞外 CaM有可能通过细胞壁上的结
合位点 ,将外界信号通过跨膜或跨壁的蛋白传入胞内与之相连的细胞骨架系统 ,进而参与
细胞功能的调控 ,但要证实这一点尚需进一步的工作 .
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图 1　一个白芷愈伤组织细胞团 ,示多个完整细胞　　　　图 2　一个完整的白芷愈伤组织培养细胞
图 3、 5　白芷愈伤组织培养细胞壁表面 CaM BPs的扫描电镜定位 ,在 Ca2+ 存在下 ,细胞壁表面有金颗
粒分布 ,并且在相邻的两个细胞有不同的分布
图 4、 6　对照组未见金颗粒分布 .图 4为 EGT A对照组 ,图 6为 TFP对照组
545第 4期　　　　　　　宋春凤等: 白芷细胞外 CaM结合位点的扫描电镜定位研究　　　　　　　　
参 考 文 献
1　 MacNeil S, Walber S W , Senior H J, et al. Effect of ex tracellular ca lmodulin anto gonist on B16
Melanoma cell g r ow th. J Invest Derma tol, 1984, 83: 15～ 19
2　 MacNeil S, Daw son R A, Crocker G. Ex tr acellula r Ca lmodulin and it a ssociation w ith epiderma l
g row th fac to r in no rma l human body fluids. J Endocr , 1988, 118: 501～ 509
3　 Biro R L , Sun D Y. Cha racterization o f Oa t calmodulin and radioimmunoassay o f its subcellular dis-
tribution. Plant Ph ysio l, 1984, 75: 382
4　 Sun D Y, Li H B, Cheng G. Ex tr acellular ca lmodulin acceler ates the pro liferation o f suspension cul-
tur ed cells o f Angelica dahurica. Plant Science, 1994, 99: 1～ 8
5　 Sun D Y, Bian Y Q , Zhao B H, et a l. The effects of ex tracellular calmodulin on cell w all r eg anera tion
of pro toplasts and cell div ision. Plant Cell Physio l, 1995, 36: 133～ 138
6　 Tang J, Wu S P, Bai J, et al. Ex tracellular calmodulin-binding pr oteins in plants: purification o f a 21
kda calmodulin-binding pr o tein. Planta, 1996, 198: 510～ 516
7　 Frens G. Cont ro lled nuclea tion for the r egulation of the pa r ticle size in monodisper se go ld suspen-
sion. Na ture: Phys Sci, 1973, 241: 20
8　 Fujimo to K, Araki N , Ogaw a K S, et al. U lt racy to chemistr y o f calmodulim binding site in myoca ria l
cells by staining of fro zen thin sections with colloidal g old-labeled ca lmodulin. J Histochem Cy-
tochem, 1989, 3: 249～ 256
9　 Jones A M , Herman E M . KDEL-containing aux in-binding pro tein is secr eted to the plasma mem-
brane and cell wa ll. Plant Physio l, 1993, 101: 595～ 606
10　 Ander son B E, Ward J M , Schroeder J L. Ev idence fo r an ex tr acellula r reception site fo r abscisic
acid in Commelina gua rd cells. Plant Phy siol, 1994, 104: 1177～ 1184
11　Wyatt S E, Ca rpita N C. The plant cy toskele ton-cell-wall continum. Trends Cell Bio l, 1993, 3: 413～
417
Studies of Extracellular Calmodulin Binding Sites on
Culture Cells of Anglica Dahurica with Colloidal
Gold-Labelled Calmodulin by Scanning Electron Microscopy
Song Chunfeng
1)　 Sun Daye2)　 Liu Guisheng1)
Li Xiangyin
1)　 Guo Yi2)　 Wang Chaohui2)
( 1) Elect ron Micros copy Lab oratory, Heb ei Medical University, 050017, Shi jiazhuang, PRC;
2) Departm en t of Biology, Hebei Normal Universi ty, 050016, Shijiazh uang , PRC)
Abstract　 A biolog ically active probe o f plant ca lmodulin( CaM ) has been prepai red
w ith co lloidal gold-labelled tech nique, and has made a method to localize ex t racellula r
calmodulin binding si tes on cul ture cells of Angella dahurica callus by scanning elect ron
microscopy. The resul ts show tha t there w ere di fferent denty go ld par ticles dist ributing
on the surface o f the cell w all. It w as indicated that there w ere CaM binding si tes on the
cell w all.
Key words　 Angelica dahurica; ex tracellular calmodulin; co lloidal g old; scanning
electron micro scopy (责任编辑　柴　键 )
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