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湖南农业大学学报(自然科学版) 2015 年 2月 第 41卷 第 1期
Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences), Feb. 2015, 41(1):047–052
DOI:10.13331/j.cnki.jhau.2015.01.009
投稿网址:http://xb.hunau.edu.cn
东亚砂藓类萌发素蛋白基因 RjGLP 的克隆及表达分析
张梅娟 1,沙伟 1,2*,刘博 2,徐红红 2
(1.东北林业大学生命科学学院,黑龙江 哈尔滨 150040;2.齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,黑龙江 齐齐哈尔
161006)
摘 要:以东亚砂藓转录组测序获得的类萌发素蛋白基因序列为基础,采用 PCR 技术克隆得到该基因的 cDNA
全长序列,命名为 RjbZIP。该序列全长为 726 bp,包含 669 bp的开放阅读框,编码 222个氨基酸的蛋白质。生
物信息学分析显示,该蛋白的相对分子质量为 23 397.9,等电点(pI )为 6.82,不稳定系数为 14.41,为稳定蛋白。
序列预测分析表明,该蛋白疏水性强,具有信号肽序列,是一种胞外基质分泌蛋白。多序列比对分析结果显示,
该基因编码的蛋白具有 GLPs家族的典型特征。实时荧光定量 PCR研究表明,在干旱胁迫处理过程中,东亚砂藓
RjGLP基因的表达量高于正常生长的材料(CK),被诱导表达,推测该基因可能参与对干旱胁迫的应答。
关 键 词:东亚砂藓;类萌发素蛋白;RjGLP基因;基因克隆;表达分析
中图分类号:Q785 文献标志码:A 文章编号:1007−1032(2015)01−0047−06
Cloning and expression analysis on RjGLP, a germin-like protein gene
from Racomitrium japonicum
Zhang Meijuan1, Sha Wei1,2*, Liu Bo2, Xu Honghong2
(1. College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang, 150040, China; 2. College of Life
Science and Agriculture and Forestry, Qiqihar University, Qiqihar,Heilongjiang 161006, China )
Abstract: A full length cDNA sequence of germin-like protein was cloned from Racomitrium japonicum using RT–PCR,
and was named as RjGLP, which was 726 bp in length, contained an open reading frame (ORF) of 669 bp, and encoded
with 222 amino acids. The results of bioinformatics demonstrated that the protein belonged to stable protein with
molecular weight of 23 397.9 and wtih pI of 6.82. The sequence prediction showed that the protein, located in cytoplasm,
was a transmembrane protein and had signal peptide. Multiple sequence alignment of GLP proteins revealed that the
protein had typical characteristics of plant germin-like proteins. The RT–qPCR results showed that RjGLP gene could
express in the process of quick dehydration, and the expression was higher than that of CK. Therefore, the RjGLP gene
was speculated to participate in the stress reaction, and the results would lay the foundations for further study of
desiccation-tolerant mechanism.
Keywords: Racomitrium japonicum; germin-like protein; RjGLP gene; gene cloning; expression analysis
收稿日期:2014–08–09 修回日期:2014–09–29
基金项目:国家自然科学基金项目(31070180;31270254);黑龙江省自然科学基金重点项目(ZD201408)
作者简介:张梅娟(1982—),女,山东海阳人,博士研究生,主要从事苔藓植物分子生物学方面的研究,zhangmeijuan_002@163.com;
*通信作者,沙伟,博士,教授,主要从事苔藓植物遗传学及分子生物学研究,shw1129@263.net
萌发素(germin)是由 Thompson 等[1]于 1980 年
研究小麦胚萌芽特定蛋白时发现的一种蛋白质。随
着研究的不断深入,越来越多的与小麦 germin结构
非常相似的蛋白质被发现,人们将此类蛋白命名为
类萌发素蛋白(germin-like proteins,GLPs)。GLPs
几乎分布于所有植物中,且含有众多家族成员,如
水稻(Oryza sativa)有 42个成员,拟南芥(Arabidopsis
thaliana)有 32个成员,大麦(Hordeum vulgare)有 21
个成员[2–3],小立碗藓(Physcomitrella patens)有 77个
成员[4],扭口藓(Barbula unguiculata)有 2个成员[5–6],
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地钱(Marchantia polymorpha)有 1 个成员[7]。研
究发现,GLPs 是一类位于细胞外基质的由多基因
编码的糖蛋白[8–11]。GLPs家族成员的氨基酸序列相
似性不高,一般只有 30%~70%,但都具有共同的
结构特征,如含有 Box A、Box B和 Box C 3个高
度保守的结构框,蛋白质糖基化位点(NXS/T),成
熟的 GLPs在 N端都有一个能帮助蛋白质分泌到胞
外的信号肽[8,12–15]。GLPs除了具有如草酸盐氧化酶
和超氧化物歧化酶等酶类的结构和功能外,还具有
受体和结构蛋白的功能,参与许多关键的生理生化
过程,在逆境胁迫下可保护植物免受生物和非生物
胁迫带来的氧化损伤[11]。近年来,对 GLPs功能的
相关研究多集中于拟南芥和经济作物,很少涉及到
苔藓植物,目前仅见对扭口藓的研究报道[6]。
存放几年的东亚砂藓(Racomitrium japonicum)
标本在复水后仍能恢复正常生长,具有耐干燥、质
量轻、附着性强、在无土的环境中能正常生长的特
点。东亚砂藓在日本还被作为绿化材料来装饰建筑
物的墙壁和屋顶,缓解热岛效应[16–17],因此,研究
东亚砂藓的耐旱机制对提高其在造景上的应用具
有重要意义。本研究中依据东亚砂藓转录组测序获
得的与GPLs同源性较高的基因片段,利用RT–PCR
方法克隆获得东亚砂藓 RjGLP基因,采用生物信息
学分析其编码蛋白序列特征,同时通过荧光定量
PCR 技术比较在干旱和正常生长状态下 RjGLP 基
因的表达模式,旨在为进一步研究该基因的功能和
苔藓植物的耐旱机制打下基础。
1 材料和方法
1.1 材料
供试材料为齐齐哈尔大学遗传学实验室通过
组织培养获得的无菌东亚砂藓配子体。选择高度约
1.5 cm、生长旺盛的植株用于试验。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 的提取及 cDNA 第一链的合成
按照宋晓宏等[18]和沙伟等[19]改良的 SDS 法进
行东亚砂藓总 RNA 的提取,并进行琼脂糖凝胶电
泳和 OD值的检测。以 Oligo(dT)15为引物,利用反
转录酶 M–MLV 试剂盒(Promega 公司)将所提取的
总 RNA反转录成 cDNA,用作基因的克隆。
1.2.2 RjGLP 基因的克隆
根据获得的东亚砂藓转录组中编码 GLP 的序
列,利用 NCBI中的 ORF Finder查找其较长的完整
开放阅读框(ORF),并在 ORF两端设计 1对特异引
物 RjGLP–F和 RjGLP–R(表 1),扩增该基因的全长
cDNA序列,预期大小为 726 bp。PCR总体系为 25
μL,在 PCR管中依次加入 2 μL 10×Buffer,1.4 μL
Mg2+,1.0 μL上游引物,1.0 μL下游引物,1.0 μL
dNTP,2 ng cDNA模板,0.2 μL Taq酶,适量 ddH2O,
瞬时离心混匀,然后于 PCR仪上进行扩增。扩增程
序:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 40 s,58 ℃退火
30 s,72 ℃延伸 1 min,进行 30个循环;72 ℃延伸
10 min,获得特异性片段。产物用北京三博远志生
物技术有限责任公司的胶回收试剂盒回收,通过 T4
DNA连接酶连接到 pMD18–T载体上,并导入大肠
杆菌感受态细胞 DH5α中,挑取阳性克隆送北京华
大生物技术有限公司测序。
表 1 RjGLP 基因克隆及实时荧光定量 PCR 所用的引物
Table 1 Primers for cloning and RT–qPCR of RjGLP
引物用途 引物名称 引物序列(5′→3)
ORF扩增 RjGLP–F CAGTACCCGCTTCGGCTTCGAG
RjGLP–R CGACCGCCTGGTGCTGACTTAC
实时荧光定量 PCR RjGLP–qF CGGTACTGCTCGTGGGCCTG
RjGLP–qR GGACGCCGCCGTGACGTTG
Actin–F GGCGATTCAGGCAGTGTT
Actin–R TCAGTGCGTCCGTCAAGT
1.2.3 RjGLP 基因的生物信息学分析
编码蛋白的氨基酸序列的基本理化性质由
ProtParam 软件分析;蛋白的保守结构域由
Consevered Domains工具预测;信号肽、跨膜结构
域、序列的亲/疏水性、亚细胞定位和二级结构等分
别用 SingalP 4.1、Tmpred、 Protscale、 PSORT
Prediction和 SOPMA等软件进行预测与分析;利用
NCBI 中的 Blastp 在线工具进行其他物种的同源氨
基酸序列搜索;利用 DNAMAN和MEGA 5.0软件
分别进行氨基酸序列同源性比对分析和系统进化
树的构建。
1.2.4 RjGLP 基因的实时荧光定量表达分析
为研究东亚砂藓 RjGLP基因在干旱和正常生长
状态下表达的差异情况,将东亚砂藓组培苗取出,
用镊子快速去除附着于根部的培养基,放入干燥器
第 41卷第 1期 张梅娟等 东亚砂藓类萌发素蛋白基因 RjGLP的克隆及表达分析 49
中,用硅胶进行快速干旱处理,分别取处理 10、20、
30、60 min的样品,液氮速冻,–80 ℃保存,以正常
生长的材料作为对照(CK)。提取以上处理时间点样
品的总 RNA,反转录成 cDNA用作反应模板。
以 Actin基因为内参基因,根据 RjGLP基因测
序结果设计上、下游引物 RjGLP–qF 和 RjGLP–qR
(表 1)进行荧光定量 PCR扩增。扩增体系(20 μL)为
SsoFast EvaGreen Supermix(2×)10 μL,模板 2 μL
(50 ng/μL),上、下游引物各 0.8 μL(10 μmol/L),适
量 ddH2O,瞬时离心混匀,进行 95 ℃预变性 30 s、
95 ℃变性 5 s、59 ℃退火 10 s、72 ℃延伸 30 s,30
个循环的扩增反应。每个循环结束后采集荧光信
号,溶解曲线分析温度为 65 ~95 ℃,每升高 0.5 ℃
保温 5 s。所用定量 PCR 仪为 Bio–Rad 公司的
CFX–96。每个反应设置 3 次重复,取平均值,采
用 2–ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平。
2 结果与分析
2.1 RjGLP 基因的克隆及序列分析结果
以东亚砂藓 RjGLP 基因完整 ORF 序列为基础
设计的引物,经 PCR扩增,产物由琼脂糖凝胶电泳
分离后得到 1 条长约 700 bp的特异性片段(图 1)。
测序结果说明,所得条带为 726 bp,与预期片段大
小一致。后续的生物信息学分析表明,此 cDNA序
列编码 GLP蛋白,命名为 RjGLP。
M DNA Marker 2 000;1 cDNA产物。
图 1 RjGLP 基因 ORF 扩增结果
Fig.1 ORF amplification of RjGLP gene
获得的 cDNA序列长为 726 bp,开放阅读框为
669 bp,可编码 222个氨基酸(图 2)。Protparam预
测该蛋白的相对分子质量为 23 397.9,理论等电点
(pI)为 6.82;有 16个氨基酸残基(Asp + Glu)带正电
荷,16个氨基酸残基(Arg + Lys)带负电荷;不稳定
系数为 14.41,属稳定型蛋白质(<40,蛋白稳定);
脂肪族系数为 91.04,总亲水系数为 0.273。结构域
预测显示,该蛋白具有保守的 cupin 基序。采用
SignalP 4.1进行分析,结果表明,RjGLP蛋白含有
一段有 27个氨基酸残基组成的 N端信号肽序列(图
2),剪切位点可能位于第 26和第 27个氨基酸之间,
下划线部分为信号肽;阴影部分为 N端糖基化位点。
图 2 RjGLP 基因 cDNA 序列和推导的氨基酸序列
Fig.2 cDNA sequence and deduced amino acid sequence of RjGLP gene
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1 M
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推测可能为一种分泌蛋白。蛋白质的跨膜结构域及
疏水性预测和分析对其三维结构的预测有重要作
用。应用 Protscale软件预测发现,该蛋白疏水性氨
基酸所占比例大于亲水性氨基酸所占比例,推断为
疏水性蛋白质。TMpred 分析结果表明,该蛋白为
跨膜蛋白。用 PSORT Prediction对 RjGLP蛋白进行
亚细胞定位,结果显示定位于胞外的可能性为
82.0%,是一种胞外分泌蛋白。
二级结构预测结果(图 3)显示,RjGLP 蛋白由
58个 α螺旋(H),55个延伸链(E)、15个 β转角(T)
和 94 个无规则卷曲(HC)构成,所占总蛋白的比率
分别为 26.13%、24.77%、6.76%和 42.34%。
蓝色部分为 α螺旋;红色部分为延伸链;绿色部分为 β转角;紫红色部分为无规则卷曲。
图 3 RjGLP 蛋白二级结构预测
Fig.3 Prediction of the secondary structure of RjGLP protein
通过 NCBI的 Blastp比对(图 4)发现,RjGLP蛋
白与扭口藓、黄瓜(Cucumis sativas)、葡萄(Vitis vinifera)
等物种的 GLP 蛋白序列相似性较高,均高于 52%,
且与扭口藓的一致性最高,达 75%。选取扭口藓
“△”表示半胱氨酸残基。
图 4 RjGLP 蛋白与其他植物 GLP 蛋白的多重比对
Fig.4 Multiple sequence alignment of RjGLP protein to other GLP proteins
第 41卷第 1期 张梅娟等 东亚砂藓类萌发素蛋白基因 RjGLP的克隆及表达分析 51
(BAC53790.1)、黄瓜(XP_004134614.1,XP_004134 617.1,
XP_004158659.1)、葡萄(XP_002266412.1)、谷子(Setaria
italia,XP_004952511.1)、节节麦(Aegilops tauschii,
EMT14183.1)、可可(Theobroma cacao,XP_007099749.1)、
短花药野生稻(Oryza brachyantha,XP_006647292.1)和
拟南芥(AAB 51572.1,P92997.2)8个物种的 11个 GLP
蛋白质序列与东亚砂藓的 RjGLP 蛋白进行多序列
比对,结果显示,GLPs 家族成员的相似性不是很
高,但都具有完整的 cupin特征结构域(图 4)。该结
构域包含 2个由高度保守的氨基酸序列框 Box B和
Box C组成的“萌发素框”,其序列分别为 G–P–H–
HPRATEXXX XX–G、GXXHFQ–N–G,其中“–”
代表任意氨基酸,“X”代表疏水性氨基酸。在 12
个 GLP蛋白中,还有 9个含有完整的氨基酸序列框
Box A,序列为 QDFCVAD。此现象符合类萌发素
蛋白家族的特征,说明它们可能有着共同的起源。
将东亚砂藓 RjGLP蛋白与其他 11个GLP蛋白进行
聚类分析,构建系统进化树,结果(图 5)显示,东亚
砂藓与黄瓜聚为一支,亲缘关系最近。
图 5 东亚砂藓 RjGLP 蛋白与其他植物 GLP 蛋白的系统进化树
Fig.5 Phylogenetic tree of R.japonicum RjGLP protein and GLP proteins from other plants
2.2 RjGLP 基因的表达特性分析
利用实时荧光定量 PCR 方法对 RjGLP 基因在
干旱胁迫时的表达水平进行研究,结果表明,RjGLP
基因的表达量呈现先升高后降低的趋势(图 6)。快速
干旱 10 min时,基因的表达量迅速上升,约为 CK
的 4.3倍,20 min时表达量急剧上升,约为 CK的
0
2
4
6
8
10
12
CK 10 20 30 60
快速干旱时间/min
相
对
表
达
量
图 6 快速干旱胁迫下 RjGLP 基因的表达分析
Fig.6 Expression analysis of RjGLP gene under quick dehydration
10.4倍;随着干旱胁迫时间的延长,RjGLP基因的
表达量逐渐降低,干旱 60 min时的表达量约为 CK
的 2.3倍。该结果说明 RjGLP基因受到干旱胁迫的
诱导表达,可能参与了对非生物胁迫的防御反应。
3 结论与讨论
对 RjGLP基因进行生物信息学分析发现,该基
因所编码的蛋白在 N末端具有一段信号肽序列,还
含有 Box A、Box B和 Box C这 3个保守的氨基酸
序列框,1个 N–糖基化位点,2个半胱氨酸残基形
成的稳定 N 端的二硫键。Woo 等[20]的研究显示,
萌发素蛋白的酶活性是由 3个组氨酸残基构成的,
可用来结合金属离子,而 RjGLP 蛋白的 Box B 和
Box C中则含有这 3个组氨酸(H)和 1个谷氨酸(E)
残基,同时,PSORT Prediction预测该蛋白是一种
胞外分泌蛋白,这与信号肽是分泌蛋白的标记的特
拟南芥(A.thaliana)
拟南芥(A.thaliana)
谷子(S.italica)
可可(T.cacao)
短花药野生稻(O.brachyantha)
黄瓜(C.sativus)
黄瓜(C.sativus)
黄瓜(C.sativus)
东亚砂藓(R.japonicum)
扭口藓(B.unguiculata)
节节麦(A.tauschii)
葡萄(V.vinifera)100
100
100
100
93
94
79
78
71
0.2
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点相吻合;因此,根据上述特征,初步推断 RjGLP
基因是典型的 GLPs蛋白家族基因。GLPs家族成员
中有一半以上在 C 端有 1 个特异三肽(RGD/KGD/
KGE)。动物细胞中含有的特异三肽为 RGD,是一
种黏连蛋白,能与整合素互相作用,从而参与到细
胞信号转导的过程,故有类似于 RGD三肽的 GLPs
都被推断为可能起着类似受体的作用[3,8]。豌豆根部
的 GLP以 RGD为受体,与根瘤菌表面蛋白发生相
互作用[21]。东亚砂藓的 RjGLP 蛋白具有类似于三
肽的 PGE,推测可能是位于胞外基质的黏连蛋白起
着类似受体的功能。
近年来的研究[22]表明,GLPs 是一类参与植物
对逆境胁迫响应的重要基因,可受多种非生物胁迫
的诱导,在植物防御反应的调节上发挥着重要作
用。Membré等[23]在烟草(Nicotiana tabacum)中过表
达拟南芥类萌发素基因 (AtGER1、 AtGER2、
AtGER3),发现烟草的抗高温能力得到明显提高。
Komatsu等[24]研究发现,大豆(Glycine max)在遭受
水分胁迫时,根和下胚轴的生长受到抑制,4 个
GLPs前体表达量下调。刚毛柽柳(Tamarix hispida)
在受到干旱、盐、低温、CdCl2 和脱落酸胁迫时,
ThGLP基因被诱导表达,并且受ABA信号转导途径
调控 [25]。刘 超 等 [26] 对 天 山 雪 莲 (Sasussured
involucrata) SikGLP基因在低温、MV和 PEG处理
下的表达情况进行了分析,结果显示该基因均被诱
导表达,可能提高了天山雪莲抗逆境的氧化胁迫能
力。大豆 GmGER基因在 IAA胁迫下可诱导表达,
将其转入番茄后,过表达 GmGER可提高番茄的抗
盐能力[27]。晋文娟等[28]将从番茄中获得的 Mdip1
基因重新遗传转化到番茄中,使其过表达,发现番
茄的抗低温诱导能力得到明显提高。本研究荧光定
量 PCR 结果显示,在东亚砂藓受到干旱胁迫时,
RjGLP基因的表达量迅速上升,随后呈现下降趋势,
但整体来说,表达量始终明显高于 CK,这说明
RjGLP基因可能参与了对干旱胁迫的应答。
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(下转第 66 页)
66 湖南农业大学学报(自然科学版) http://xb.hunau.edu.cn 2015 年 2 月
的分类预测中,如文档和图片分类等。将来的研究
目标是将这种算法扩展到 DAG 层次结构上,解决
在 GO上蛋白质功能预测的问题。
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责任编辑:苏爱华
英文编辑:王 库
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责任编辑:苏爱华
英文编辑:王 库