全 文 ：维吾尔药材刺山柑组织快繁无菌系建立的初步研究
刘显峰 ,马生军 ,包晓玮 ,买合木提·买吐送 ,王 颖
(新疆农业大学药学院 ,乌鲁木齐　830052)
摘　要:【目的】建立的刺山柑组织快繁无菌系。【方法】根据不同部位 、不同采集时间等 , 确定刺山柑外植体的
采集时间 、部位 、灭菌剂和灭菌时间。【结果】建立刺山柑的无菌体系时 , 选择晴天去采集外植体为好;带芽的
茎段污染率高 ,腋芽的污染率低 , 选用腋芽作为外植体;操作台外的最佳消毒方法是饱和的洗洁精清洗后用自
来水冲洗20 min;操作台内消毒对比 10%次氯酸钠 、2%双氧水 、2%溴水 、0.1%升汞 , 0.1%升汞灭菌效果好 ,
而最佳操作台内最佳灭菌体系为 75%酒精消毒 10 s , 以灭菌去离子水冲洗 2次 , 后于 0.1%升汞中浸泡 9 min ,
以灭菌去离子水冲洗 5次。【结论】对外植体的采集时间晴天相对雨天污染率低 ,腋芽出芽率高 ,酒精和升汞
双灭菌效果最佳。
关键词:刺山柑;无菌系;消毒剂
中图分类号:S567.048　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-4330(2010)02-0251-05
Establishment of a Aseptic System of Medicinal Plant Capparis
spinosa L.Explant in Vitro
LIU Xian-feng ,MA Sheng-jun ,BAO Xiao-wei ,Maihemuti·Maitusong ,WANG Ying
(College of Pharmaceutical Science ,Xinjiang Agricultural Univercity , Urumqi 830052 , China)
Abstruct:【Objective】Establishment of a aseptic system of medicinal plant.【Method】In this article ,
gathering time , type ,biocide , disinfection time of explants in vitro with Capparis spinosa L.are studied.【Result】
When establishing Capparis spinosa L.aseptic system , explants gathering should be shosen in the cloudless day;
The pollution rate of the stems with a bud was high , but the pollution rate of a bud was low , the optimum explants
are a bud segment in the cloudless day;The disinfection should first use the saturated laundry utility solution to soak
outside the operation table , then flushes 20 minutes with the running water.When the inside of operation table was
sterilized , it should be compared to 10%NaClO ,2%H2O2 ,2%Br2 ,0.1%HgCl ,0.1%HgCl solution has the best
sterilization effect.The optimal system in the optimal operation sterilization table was 75% ethylal- cohol soak 10
seconds , the aseptic water flushes 2 times , then it was soaked with 0.1% mercuric chloride for 9 minutes , the
aseptic water flushes 5 times.【Conclusion】Compared with the raining day , the explants of pollution rate is lower in
the cloudless day.Growwing rate of bud is high.ethylal- cohol and HgCl had the best sterilization effect.
Key words:Capparis spinosa L.;aseptic system;cellulose utility;
0　引言
【研究意义】刺山柑是新疆独具特色的药材 ,含有丰富的黄酮 、生物碱 、脂质和糖苷等化学成分 。同
时刺山柑也是一种固沙植物 ,对沙漠地带的植被绿化具有重要意义。建立刺山柑组培无菌系 ,为组培研
究奠定完善的基础条件。【前人研究进展】刺山柑(Capparis spinosa L.),为白花菜科山柑属植物 ,藤本状
小灌木 ,根粗壮 ,枝条平卧 ,呈辐射状 ,长约 2 ～ 3 m ,无毛或具绒毛;极耐干旱 ,喜生于荒漠地带的戈壁 、
沙地 、低山和山麓地带 ,荒地也有生长[ 1] 。它源于亚洲西部或中部的干旱地区 ,其分布穿过地中海盆地
向东延伸至伊朗 ,分布于热带与亚热带 。刺山柑也是一种优良的固沙植物 ,我国新疆北疆 、东疆 ,乌鲁木
齐到乌苏一带最常见 ,西藏境内广有分布[ 2] 。刺山柑的根皮 、叶和果实在维吾尔族民间有着广泛的应
收稿日期:2009-08-31
基金项目:新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(200821105)
作者简介:刘显峰(1981-),女 ,硕士研究生 ,(E-mail)lxf10@126.com
通讯作者:王颖(1957-),女 ,教授 ,硕士研究生导师 ,研究方向为药理与毒理学, (E-mai l)wy2028@yahoo.com.cn
新疆农业科学　2010 ,47(2):251-255
Xinjiang Agricultural Sciences
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
用 ,主要用于治疗风湿病 ,有祛风 、散寒 、除湿的作用[ 3 ,4] 。同属的其他变种还被当作传统药物用作驱虫
药 、泥敷剂 、利尿剂 、通便剂 、止痛剂 、抗高血压药和滋补剂用于治疗胃肠道感染 、痢疾 、痛风等[ 3～ 5] 。刺
山柑快繁的先决条件是外植体的选择及消毒灭菌 ,继而才能够进行初代 、继代及生根培养 。贾茂腾等初
步建立快繁体系 。【本研究切入点】目前 ,刺山柑快繁无菌体系及快繁体系的研究尚缺乏 。【拟解决的关
键问题】刺山柑外植体采集时间 、采集部位 、灭菌剂及时间 ,筛选刺山柑快繁的最佳外植体并建立较完善
的灭菌条件 ,以期更好地为刺山柑组培和规模化繁殖提供科学依据。
1　材料与方法
1.1　材 料
1.1.1　试验样品
试验样品采集于乌鲁木齐市雅玛里克山 ,从当年抽生的新梢上剪取无病虫害 、无破损 、生长旺盛的
嫩枝茎段 , 去掉所有叶片 , 当天将采集的嫩枝低温保湿带回实验室 ,作为外植体培养材料 。
1.1.2　培养基及培养条件
培养基附加不同浓度的细胞分裂素和生长素 、3%蔗糖 、0.7%琼脂 ,培养基 pH 5.8。培养温度为(25
±2)℃, 光照度 1 500 ～ 2 000 lx ,光照时间 16 h·d。
1.2　方 法
1.2.1　不同部位 、不同采集时间外植体的采集
分别于晴天 、雨天从当年抽生的新梢上剪取健壮嫩枝茎段 ,带回实验室 。每个处理分别接种带腋芽
的幼嫩茎段和腋芽各 30个外植体 ,分别接入不定芽诱导培养基上 ,取其平均值 。
1.2.2　外植体的消毒灭菌
将采集回的嫩枝剪去叶片 , 留叶柄基部 。先用自来水冲洗 3 ～ 5遍 , 用软毛刷蘸洗洁精溶液轻轻刷
洗 ,再用自来水冲洗 20 min左右 。将外植体置于超净工作台 , 用 75%酒精浸泡 10 s ,无菌水冲洗 2次 ,
再用 0.1%升汞溶液浸泡消毒9 min ,无菌水冲洗5次 ,用消毒滤纸吸干表面水分 。将消毒后的腋芽切成
1.5 cm大小左右 ,分别接入不定芽诱导培养基上 ,每个处理观察 15个外植体的生长分化情况 ,取其平均
值。
1.2.3　外植体的截取
一组处理将采集回的嫩枝剪去叶片 ,留叶柄基部;另一组处理将叶柄和叶片一起剪去 ,分别接入不
定芽诱导培养基上 ,观察污染情况 ,每个处理观察 15个外植体的生长分化情况 ,取其平均值 。
1.2.4　洗洁剂及冲洗时间
将采集回的嫩枝剪去叶片 ,留叶柄基部。先用自来水冲洗 3 ～ 5遍 , 用软毛刷分别蘸取洗洁精溶液
和洗衣粉轻轻刷洗 ,再用自来水冲洗20 、60 、120和 240 min ,接入不定芽诱导培养基上 ,每个处理观察 30
个外植体的污染及生长情况 ,取其平均值。
1.2.5　不同消毒剂 、消毒时间对腋芽灭菌效果的影响
取生长健壮 、无病虫害刺山柑的新生枝条作外植体 , 用 75%酒精浸泡 10 s ,无菌水冲洗 2次后 ,对
腋芽以灭菌剂10%次氯酸钠 、2%双氧水 、2%溴水 、0.1%升汞分别灭菌处理6 、9 、12 、15 min ,共设16个处
理 ,每个处理接种 30个外植体 ,每 3个外植体接种于一个三角瓶中 ,每隔1 d观察一次 ,15 d后统计成活
个数和成活率。
1.2.6　不同消毒灭菌处理
设计 12种消毒灭菌处理方法。每个处理分别接种 15个外植体 , 外植体为腋芽。培养时间 15 d ,在
培养过程中 , 定期观测外植体污染情况 、褐化情况。无菌外植体得率为剔除污染和褐化的外植体后剩
余的外植体数与接种数的比值 。表 1
2　结果与分析
2.1　不同部位 、不同采集时间外植体的生长及污染情况
实验结果表明 ,不同部位 、不同时间采集的外植体 ,经酒精和升汞消毒灭菌后接种到不定芽诱导培
养基上 ,其污染率有很大差异 。晴天的污染率明显低于雨天的 ,芽更易诱导;腋芽与幼嫩带腋芽的茎段
相比 ,幼嫩茎段在11 d后污染率升高 ,带腋芽的茎段的无菌外植体污染率比腋芽高;腋芽较幼嫩茎段更
·252·　　　　　　　　　　　　　　　新疆农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　47卷
易诱导芽的发生 , 这可能与腋芽的顶端分生组织外包裹着多层幼叶 , 不易被消毒剂伤害有关。表 2
表 1　外植体的不同消毒灭菌处理
Table 1　The different sterilization methods of explants
处理号
No.
外植体(个)
Explants
酒精处理时间(s)+升汞处理时间(min)
ethyl alcohol t reatment+mercuric chloride treatment
1 15 10 + 6
2 15 10 + 9
3 15 10 + 12
4 15 10 + 15
5 15 20 + 6
6 15 20 + 9
7 15 20 + 12
8 15 20 + 15
9 15 30 + 6
10 15 30 + 9
11 15 30 + 12
12 15 30 + 15
表 2　不同部位 、不同采集时间的外植体生长及污染情况
Table 2　The growing and pollution of explants from different gathering time and position
采集部位
Gathering type
采集时间
Gathering time
外植体(个)
Explants
污染率(%)
Pollution rate
生长情况
The growning situation
腋芽 Bud 雨天 30 56.7 3 d长出叶片 ,7 d萌发生芽 ,转接仍有部分污染
晴天 30 33.0 2 d长出叶片 ,5 d开始长芽 ,无污染
幼嫩带腋芽的茎段The stemswith buds 雨天 30 80.0 9 d小芽萌发 ,11 d污染率升高 ,转接后继续污染
晴天 30 26.7 9 d小芽萌发 ,11 d污染率升高 ,转接后继续污染
2.2　叶柄截取对外植体诱导及污染的影响
实验结果表明 ,截取的叶柄 ,经消毒处理后接种到不定芽诱导培养基上 ,有叶柄较无叶柄外植体污
染率高 ,但总出芽数也较高 ,而无叶柄外植体的褐化率高于有叶柄外植体。表 3
表 3　叶柄截取对外植体诱导芽及污染的影响
Table 3　Effect of the cutting petiole on the bud induction and pollution of explants
方法　　　　　
Methods　　　　　
接种数(个)
No.of explants
污染数(个)
No.of pollution
污染率(%)
Pollution rate
褐化数(个)
Browning
褐化率(个)
Browning rate
30 d总出芽数
Sum buds
有叶柄 Petiole 15 2 13.3 无 0 58
无叶柄 No petiole 15 1 6.7 3 20 40
2.3　消毒剂及流水冲洗时间
实验结果表明 ,以洗洁精刷洗后流水冲洗 20 min既可降低污染率又能够保证芽的诱导 ,而洗衣粉
处理后冲洗时间短污染率高 ,冲洗时间过长又会影响芽的诱导。由此可知 ,流水冲洗时间短 ,芽的诱导
更容易 ,所以在建立刺山柑无菌体系时 ,应首先在超净工作台外采用洗洁精处理的消毒方式 ,这样污染
率低 ,更易诱导芽。表 4
2.4　灭菌剂及灭菌时间对外植体成活率的影响
结果表明 ,腋芽的最佳灭菌剂及最佳灭菌时间为 0.1%升汞灭菌 9 min。表5
2.5　不同消毒灭菌处理对外植体污染率 、褐化率的影响
实验结果表明 ,不同的消毒处理时间 , 其供试外植体的污染率和无菌外植体得率有差异 。延长酒
精处理时间 , 对降低外植体污染率效果不明显 ,但使外植体的褐化率大大增加;而增加升汞处理时间 ,
可明显减少外植体的污染率 , 但对外植体的伤害较严重 , 甚至致死 。因此 ,以酒精 10 s+升汞 9 min 进
行消毒灭菌处理最佳 , 其无菌外植体得率最高 , 为 86.7%。表 6
·253·2期　　　　　　刘显峰等:维吾尔药材刺山柑组织快繁无菌系建立的初步研究　　　　　　　　　
表 4　不同消毒剂 、流水冲洗时间对外植体污染及芽的诱导的影响
Table 4　Effect of different the disinfection and the running water on the bud
induction and pollution of explants
编号
No.
处理
Treatment
时间(min)
Time
污染率(%)
Pollution rate
生长情况
Growning situation
1 洗洁精 20 6.7 3 d长出叶片;7 d长芽
2 60 10.0 同上
3 120 3.3 同上
4 240 6.7 3 d长出叶片;8 d长芽
5 洗衣粉 20 20.0 3 d长出叶片;7 d长出芽
6 60 3.3 同上
7 120 6.7 同上
8 240 6.7 3 d长出叶片;8 d长芽
表 5　不同灭菌剂 、灭菌时间对外植体成活率(%)的影响
Table 5　Effect of different sterilization liquid and time on the survival rate of explants
处理时间(min)
Treatment
10%NaClO 2%H2O2 2%Br2 0.1%HgCl2
6 53.3 50.0 45.7 46.7
9 33.3 40.0 33.3 93.3
12 23.3 26.7 16.7 90.0
15 3.3 6.7 3.3 53.3
表 6　不同消毒灭菌对污染率 、褐化率影响
Table 6　Effect of different sterilization type on the browning and pollution of explants
处理号
No.
处理时间(75%酒精+0.1%升汞)
Sterilization time
褐化率(%)
Browning rate
污染率(%)
Pollution rate
无菌苗得率(%)
Aseptic plants obtaining rate
1 10 s+6 min 0 53.3 46.7
2 10 s+9 min 0 13.3 86.7
3 10 s+12 min 6.7 6.7 86.7
4 10 s+15 min 26.7 0 73.3
5 20 s+6 min 13.3 46.7 40.0
6 20 s+9 min 20.0 6.7 73.3
7 20 s+12 min 20.0 13.3 66.7
8 20 s+15 min 53.3 26.7 20.0
9 30 s+6 min 80.0 6.7 23.3
10 30 s+9 min 73.3 6.7 20.0
11 30 s+12 min 93.3 0 6.7
12 30 s+15 min 100 0 0
3　讨论
维药材刺山柑是较有代表性且开发较少的维吾尔原料药之一 ,通过组培繁殖育苗与规模化栽培 ,生
产出药用成分含量不低于野生刺山柑药材的原植物 ,一方面为制药行业提供优质原料 ,另一方面能促进
新疆特色中药产业的有序发展 ,更好地开发利用新疆特色维药资源[ 6] 。刺山柑群落具有保持水土 ,防风
固沙和保护绿洲及工程设施的生态功能 ,是恶劣 、严酷生境造就出来的一种高经济价值 、生态功能显著
植物种群和荒漠植物群落[ 7] 。
4　结论
外植体最佳采集时间为晴天 ,腋芽为最佳采集部位。外植体消毒灭菌处理时应留有叶柄基部 。王
晓明等[ 8]在对灰毡毛忍冬无菌体系的研究中也发现留有叶柄基部效果较好;刺山柑外植体灭菌宜采用
二次灭菌法 ,最佳超净工作台外的消毒方法为洗洁精洗净后流水冲洗 20 min ,冲洗时间不宜过长 ,以免
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影响诱导芽的生成;最佳超净工作台内的消毒处理方法是先以 75%酒精处理 10 s ,然后用 0.1%升汞消
毒9 min。
该实验发现幼嫩带腋芽的茎段在接种后 11 d易污染 ,可能是由于本身携带病毒所致;酒精浓度过
高 、处理过长容易造成褐化。
参考文献:
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·255·2期　　　　　　刘显峰等:维吾尔药材刺山柑组织快繁无菌系建立的初步研究