全 文 ：浙 江 农 林 大 学 学 报， 2015， 32（5）： 815-820
Journal of Zhejiang A＆ F University
doi:10.11833/j.issn.2095-0756.2015.05.024
黄花杓兰菌根真菌 rDNA ITS的多样性
缪福俊1， 蒋 宏1， 王宏虬2， 原晓龙1， 陈 剑1， 杨宇明1， 王 娟1
（1. 云南省林业科学院 国家林业局云南珍稀濒特森林植物保护和繁育重点实验室 云南省森林植物培育
与开发利用重点实验室, 云南 昆明 650201； 2. 西南林业大学 林学院， 云南 昆明 650224）
摘要： 杓兰属 Cypripedium植物因具较高的观赏和药用价值而长期被过度采集， 已成为濒危植物。 菌根真菌是其栽
培和保育能否成功的重要协同因子。 采用免培养技术对滇西北 4 个不同居群的黄花杓兰 Cypripedium flavum 毛根的
真菌进行核糖体脱氧核糖核酸内转录间隔区（rDNA ITS）区段扩增。 结果表明： 从 4 个居群的毛根中共克隆得到 366
个真菌 ITS-taxa， 其中白水河居群 93个， 石卡雪山居群 90个， 天生桥居群 103个， 纳帕村居群 80个； 黄花杓兰毛
根系统中存在丰富多样的菌根真菌类型， 分别涉及胶膜菌属 Tulasnella， 伏革菌属 Corticium， 瘤菌根菌属 Epulorhiza
和丝核菌属 Rhizoctoia 4个属及一类归属未定的真菌（uncultured mycorrhizal fungi）； 胶膜菌属对于黄花杓兰具有一定
的寄主专一性特征， 可能对黄花杓兰的生长有促生作用。 以上结果为菌肥的研制和黄花杓兰植物的栽培与保育工
作提供科学依据。 图 1表 3参 24
关键词： 微生物学； 黄花杓兰； 菌根真菌； rDNA ITS； 胶膜菌属； 多样性
中图分类号： S718.81； Q948.12 文献标志码： A 文章编号： 2095-0756（2015）07-0815-06
The rDNA ITS diversity of mycorrhizal fungi with Cypripedium flavum
MIAO Fujun1, JIANG Hong1, WANG Hongqiu2, YUAN Xiaolong1, CHEN Jian1, YANG Yuming1, WANG Juan1
（1. Key Laboratory for Conservation of Rare, Endangered & Endemic Forest Plants, State Forestry Administration,
Yunnan Provincial Key Laboratory of Cultivation and Exploitation of Forest Plants, Yunnan Academy of Forestry,
Kunming 650201 , Yunnan, China; 2. School of Forestry, Southwest Forestry University, Kunming 650224, Yunnan,
China）
Abstract: Cypriped ium plants, which are endangered by over-harvesting due to their high ornamental and
medicinal value, use mycorrhizal fungi to guarantee cultivation and conservation. In order to explore the diver-
sity of mycorrhizal fungi, the rDNA internal transcribed spacer （ITS） sequences from mycorrhizal fungi of four
C. flavum populations （Baishui River, Shika Snow Mountain, Tiansheng Bridge, and Napa Village） were ampli-
fied by nested polymerase chain reaction （PCR） methods. Results showed a total of 336 distinct ITS-taxa of C.
flavum obtained from clones of mycorrhizal fungi with populations from Baishui River （93）, Shika Snow Moun-
tain （90）, Tiansheng Bridge （103）, and Napa Village （80）. Blast results of rDNA ITS sequences showed a
rich diversity in mycorrhizal fungi systems with mycorrhizae belonging to Tulasnella, Corticium, Epulorhiza, and
Rhizoctoia. Tulasnella fungi probably had host-specificity and growth-promoting effects on C. flavum. These re-
sults may provide a scientific basis for further conservation work of C. flavum and fungal manure development.
［Ch, 1 fig. 3 tab. 24 ref.］
收稿日期： 2014-12-08； 修回日期： 2015-01-22
基金项目： 云南省应用基础研究计划青年项目（2014FD070）； 国家林业公益性行业科研专项（201204110）； 云南
省应用基础研究重点项目（2013FA054）； 云南省社会事业发展专项（2010CA010）； 云南省中青年学
术技术带头人后备人才培养项目（2010CI016）； 云南藏区典型区域生态安全防控技术研究及应用示
范项目； 云南省教委湿地生态学创新团队项目
作者简介： 缪福俊， 研究实习员， 从事根际微生物研究。 E-mail: miaofujun@yeah.net。 通信作者： 王娟， 教授，
从事植物分子生物学与植物菌根研究。 E-mail: schima@163.com
浙 江 农 林 大 学 学 报 2015 年 10 月 20 日
Key words: microbiology; Cypripedium flavum; mycorrhizal fungi; rDNA ITS; Tulasnella； diversity
黄花杓兰 Cypripedium flavum 属兰科 Orchidaceae 杓兰属 Cypripedium 植物， 为中国特有种， 分布于
云南西北部、 西藏东南部、 四川、 甘肃南部和湖北西部的高海拔地区， 是一种典型的多年生高山草本植
物［1］。 因其花型独特、 色彩艳丽， 是整个兰科植物中最具特色的类群之一， 极具观赏价值。 然而， 人类
对杓兰野生环境的日益破坏， 使得黄花杓兰种群数量急剧下降。 该种已处于濒危状态， 亟待保护［2－3］。
目前， 在杓兰属植物保育工作中， 因多数自花不育导致自然结实率较低， 种子微小， 多采取分株繁殖和
组织培养方式进行扩繁种苗［4－5］。 在此过程中存在一个很大的瓶颈： 在扩繁种苗过程中， 杓兰幼苗出现
生长缓慢、 死亡率高等常见问题， 极大地限制了濒危植物杓兰的保育工作［6－7］。 前人的研究表明： 兰科
植物对菌根真菌具有较高的依赖性， 菌根可能成为杓兰营养代谢的重要协同因子［8］。 在自然条件下， 兰
属植物必须与真菌建立共生关系， 其种子萌发、 幼苗生长发育以及成年兰属植物营养的获取才得以实
现［9］。 Harley等［8］于 1983 年首次证实杓兰和真菌是互利的关系。 同时 Hadley等［10］也认为： 平衡的共生关
系可在一定条件下变为寄生关系， 接种根际促生菌可显著提高杓兰幼苗的成活率。 Shimura 等［11］的研究
表明： 两者可能是斗争的关系， 但通过前期的斗争， 一旦真菌与杓兰建立共生关系后， 可互利共生。 王
瑞苓等［12］通过对黄花杓兰植株根的生长周期切片观察， 也证实菌根真菌与黄花杓兰是互惠互利的共生关
系。 臧穆等［13］在黄花杓兰的根际和根皮层细胞内发现了不同阶段的小型菌核， 菌核的存在表明： 杓兰和
真菌是协同的关系。 侯天文等［14］研究发现： 四川黄龙沟杓兰的菌根真菌多样性随生长季节转换呈现的变
化规律与营养需求规律是基本一致的。 高倩等［15］对黄花杓兰， 云南杓兰 Cypripedium yunnanense, 西藏杓
兰 Cypripedium tibeticum 和斑花杓兰 Cypripedium guttatum 的菌根结构及其周年动态变化进行了研究， 发
现真菌的新近入侵、 开始被消解、 消解后的残余及消解后的物质 4 个阶段在这 4 种杓兰的生活周期中周
而复始地进行。 上述前人的研究主要集中于菌根解剖结构特征观察和真菌的入侵方式等方面， 有关杓兰
属植物菌根真菌多样性的研究还缺乏报道。 本研究前期调查发现， 黄花杓兰在滇西北高海拔区域分布较
多， 这为研究杓兰属植物菌根真菌提供极好的试验材料。 本研究以黄花杓兰毛根为材料， 提取总 DNA，
采用免培养巢式聚合酶链式反应（PCR）技术扩增其真菌核糖体脱氧核糖核酸内转录隔离区（rDNA ITS）区
段， 并对不同居群黄花杓兰的菌根真菌多样性进行分析， 为杓兰属植物的保育和开发利用方面提供科学
依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
采样地的地理位置信息详见表 1。 采集时间为杓兰花盛开期（2013 年 6 月 10 日）。 黄花杓兰为地生
兰， 生于林缘， 样地为腐殖质土壤。 根据采样地点分为 4 个不同的居群， 对每种选样植株（居群）中随机
选取 5株进行取样， 在黄花杓兰的根尖处选取毛根段 10 个·株－1， 长约 1 cm。 用水洗净根尖土壤， 置于
装有十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）缓冲液的 1.5 mL离心管中， 避光低温储存。
表 1 滇西北黄花杓兰采样居群表
Table 1 Sample collection of Cypripedium flavum at Northwest of Yunnan
编号 居群名称 采样地点 经纬度 海拔/m 坡度/（°） 样方中分布数量/株（10 m×10 m）
1 白水河 丽江白水河 99°14′33 N， 27°07′24.4 E 2 970 18 14
2 纳帕村 香格里拉纳帕村 99°37′51 N， 27°51′40 E 3 349 20 43
3 天生桥 香格里拉天生桥 99°49′12 N， 27°48′13 E 3 376 19 16
4 石卡雪山 香格里拉石卡雪山 99°16′35 N， 27°59′11 E 4 499 22 26
1.2 方法
1.2.1 样品总 DNA的提取 采用天根 DNA试剂盒提取各样品中的总 DNA。
1.2.2 样品 rDNA ITS 区段扩增和多样性分析 采用 Nest PCR 方法扩增， 第 1 轮 PCR 扩增引物为 NSI1
和 NLB4（NSI1： 5′-GATTGAATGGCTTAGTGAG-3′， NLB4： 5′-GGATTCTCACCCTCTATGA-3′）。 反应体系
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为： 1.0 μL 模板 DNA， 1.0 μL NSI1， 1.0 μL NLB4， 9.5 μL 双蒸水（ddH2O）， 12.5 μL Prime STAR Max
DNA Premix（2×）。 反应条件为: 98 ℃ 30 s， 60 ℃ 5 s， 72 ℃ 10 s， 30次循环， 72 ℃ 1 min。
第 2 轮 PCR 扩增引物为 NSI1-F 和 ITS4 （NSI1-F： 5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′， ITS4： 5′-
TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。 反应体系为： 1.0 μL 第 1 轮 Nest PCR 产物做模板 DNA， 1.0 μL NSI1-
F， 1.0 μL ITS4， 9.5 μL ddH2O， 12.5 μL Prime STAR Max DNA Premix（2×）。 反应条件为 : 98 ℃ 10 s，
55 ℃ 5 s， 72 ℃ 10 s， 30次循环， 72 ℃ 1 min。
将扩增出的 PCR 产物分别用限制性内切酶 Hinf1 和 Alu1 进行酶切分析。 反应体系为： 3.0 μL PCR
产物， 1.0 μL 内切酶缓冲液（10×）， 1.0 μL 内切酶， 5.0 μL 双蒸水。 37 ℃水浴 4 h。 经电泳检测， 分析
限制性片段长度多态性（RFLP）带型。 将代表不同的 RFLP 带型的单克隆样品挑出， 连接载体 pEASY-
Blunt 转入 Trans1-T1 感受态细胞中， 挑取阳性克隆， 用菌液 PCR 法（M13F、 M13R 引物） 鉴定重组子，
确认包含重组子的克隆， 送上海生工公司用 M13F 和 M13R 引物测序。 测序结果用 DNAman 去除载体后
使用在线软件 NCBI Blast进行比对分析。
1.2.3 多样性指数计算 集中性测度： λ=Σ［Ni（Ni－1）/N（N－1）］； 多样性测度： D＝1－Σ ［Ni（Ni－1）/N
（N－1）］， 公式中 N为样方中物种总体个数， Ni为第 i种个体数。
2 结果与分析
2.1 黄花杓兰毛根中真菌 rDNA ITS区段聚合酶链反应（PCR）扩增结果
黄花杓兰部分毛根总 DNA 的提取电泳结果如图 1A 所示， 其真菌 rDNA ITS 区段扩增结果如图 1B
所示， 表明提取的总 DNA 条带清晰， 采用巢式 PCR 可较好地扩增得到 rDNA ITS 区段， 大小均在 750
bp左右。
图 1 黄花杓兰毛根中真菌 rDNA ITS PCR扩增的电泳结果
Figure 1 Agarose gel electrophoresis results of rDNA ITS PCR amplification products of mycorrhizal fungi from Cypripedium flavum
2.2 黄花杓兰毛根中真菌 ITS序列分析结果
从 4 个不同居群黄花杓兰的毛根中直接提取的总 DNA， 通过 Nest PCR 扩增及克隆建立了 4 个克隆
库， 总共得到了 366个单克隆， 其中从白水河居群中得到 93个单克隆， 从石卡雪山居群中得到 90 个单
克隆， 从天生桥居群中得到 103个单克隆， 从纳帕村居群中得到 80个单克隆。
2.3 不同居群黄花杓兰 ITS序列多样性分析
从表 2可见： 白水河居群涉及 3 个真菌属， 分别属于瘤菌根菌属 Epulorhiza， 归属未定真菌（Uncul-
tured mycorrhizal fungi）和胶膜菌属 Tulasnella， 均属典型的兰科菌根真菌类型。 其中， 瘤菌根菌属占大多
数， 频率为 58.1%， 同源性为 97%， 其次是胶膜菌属， 与美胞胶膜菌 Tulasnella calospora 的同源性高达
98%， 可初步确定为美胞胶膜菌。 集中性指数 λ＝0.489， 多样性测度 D＝0.511； 石卡雪山居群涉及 3 个
真菌属， 分别属于胶膜菌属、 丝核菌属 Rhizoctoia 和瘤菌根菌属。 其中， 胶膜菌属占大多数， 频率为
缪福俊等： 黄花杓兰菌根真菌 rDNA ITS 的多样性 817
浙 江 农 林 大 学 学 报 2015 年 10 月 20 日
41.1%， 同源性为 98%， 其次是丝核菌属。 集中性指数 λ＝0.350， 多样性测度 D＝0.650； 天生桥居群涉及
3 个真菌属， 分别属于胶膜菌属， 伏革菌属 Corticium 和瘤菌根菌属。 胶膜菌属占大多数 ， 频率为
69.9%， 同源性为 97%， 其次是伏革菌属。 集中性指数 λ＝0.568， 多样性测度 D＝0.432； 纳帕村居群涉及
1 个真菌属， 全部属于胶膜菌属， 与美胞胶膜菌的同源性高达 99%。 集中性指数 λ＝0.640， 多样性测度
D＝0.360。
表 2 黄花杓兰菌根真菌 rDNA ITS序列的 Blast比对结果
Table 2 Blast results of rDNA ITS sequences of mycorrhizal fungi from Cypripedium flavum
居群 单克隆数 真菌种类 单克隆数 频率/% GenBank 中比对菌名及登录号 相似度/% 缺失或插入比例/%
瘤菌根菌属 54 58.1 Epulorhiza sp. AJ313445.1 623/641（97） 5/641（0）
白水河 93 胶膜菌属 35 37.6 Tulasnella calospora AY643804.3 582/591（98） 0/591（0）
归属未定真菌 4 4.3
Uncultured mycorrhizal fungi
DQ790793.1
504/515（98） 0/515（0）
胶膜菌属 37 41.1 Tulasnella calospora AY643804.3 582/591（98） 0/591（0）
石卡雪山 90 丝核菌属 31 34.4 Rhizoctoia sp. AF200520.1 840/850（99） 0/850（0）
胶膜菌属 72 69.9 Tulasnella sp. AY373285.1 578/595（97） 5/595（0）
天生桥 103 伏革菌属 29 28.1 Corticium salmonicolor EU435011.1 716/735（97） 13/735（1）
纳帕村 80 胶膜菌属 80 100 Tulpoasnella calosra AY643804.3 583/591（99） 0/591（0）
瘤菌根菌属 22 24.4 Epulorhiza sp. JF907601.1 559/570（98） 0/570（0）
瘤菌根菌属 2 2.0 Epulorhiza sp. JF907601.1 560/577（97） 7/577（1）
2.4 不同居群黄花杓兰菌根真菌类型
从表 3可见： 4 个居群的黄花杓兰菌根系统中涉及 4 个真菌属， 其中胶膜菌属、 瘤根菌属和伏革菌
属隶属于担子菌亚门 Basdiomycotina， 丝核菌属隶属于半知菌亚门 Deuteromycotina， 还有一类归属未定
的真菌， 所占频率最少， 为 1.0%。 说明不同居群的黄花杓兰菌根系统中可能存在丰度不同的真菌菌落
结构， 如白水河居群真菌群落丰富多样， 涉及 3个真菌属， 但在纳帕村黄花杓兰居群只有胶膜菌属， 其
多样性较为单一。 胶膜菌属在每一个居群中都出现且占有较大的比例， 高达 61.2%。
表 3 黄花杓兰菌根不同属真菌的比例
Table 3 Number ratio from different genus of mycorrhizal fungi from C. flavum
编号 真菌种类 单克隆数 频率/%
1 胶膜菌属 Tulasnella 224 61.2
2 瘤菌根菌属 Epulorhiza 78 21.3
3 丝核菌属 Rhizoctoia 31 8.5
4 伏革菌属 Corticium 29 8.0
5 非培养菌 Uncultured mycorrhizal fungi 4 1.0
3 结论与讨论
本研究首次采用微生物免培养技术对滇西北 4个不同居群的黄花杓兰植物的毛根总 DNA 进行提取，
用真菌 ITS 区 2 对引物 NSI1/NLB4 和 NSI1-F/ITS4 直接扩增毛根中真菌的 ITS 区段， 免去了微生物纯培
养的过程。 从 4 个不同居群的黄花杓兰毛根中总共克隆得到 366 个真菌 ITS-taxa， 与 NCBI 数据中的菌
根真菌进行比对， 表明均属菌根真菌类型。 说明黄花杓兰菌根系统中存在丰富多样的真菌类型， 此方法
能较好地反应黄花杓兰菌根中真菌多样性水平， 能快速的获得菌根真菌生态系统中的真菌群落类型。
目前研究已知， 感染兰科植物根部并能与之共生的真菌类型约有担子菌亚门的 7 个属（瘤菌根菌属，
胶膜菌属， 腊壳菌属 Sebacina， 念珠菌根菌属 Moniliopsis， 角担菌属 Ceratobasidium， 层孔菌属 Fomes 和
伏革菌属）； 半知菌亚门的 1 个属（丝核菌属）和子囊菌亚门的 1 个属（毛壳菌属 Chaetomium）［16－18］。 而本
研究发现： 4个居群黄花杓兰菌根真菌类型（胶膜菌属、 瘤菌根菌属、 丝核菌属和伏革菌属）为典型的兰
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第 32 卷第 5 期
科植物菌根真菌， 均在兰科植物菌根真菌系统中已报道。 其中， 胶膜菌属在每一个居群中都占有较大的
比例， 且在每个居群中都出现， 说明胶膜菌属可能是黄花杓兰菌根真菌系统中的优势种群， 存在着一定
的寄主特异性。 这与已有的研究结果一致。 对胶膜菌属的美孢胶膜菌进行研究发现， 该菌能促进兰科植
物（石斛 Dendrobium candidum 和地宝兰 Geodorum eulophioides）的种子萌发， 可能对兰科植物的定植和
生长有促进作用［19］。 在本研究的另外 3 个居群中都涉及到瘤菌根菌属真菌， 所占比例仅次于胶膜菌属，
说明有瘤菌根菌属对黄花杓兰也有着一定的寄主特异性。 相关研究也表明， 分离自兰科植物的瘤根菌属
和胶膜菌属真菌共同促进兰科植物的生长发育 ［20－21］。 Oliveira 等 ［22］对巴西 4 种兰花不同居群的菌根真菌
进进行菌群多样性研究发现， 其根内生真菌主要为腊壳菌属， 高达 81.61%， 对这 4 种兰花有着寄主专
一性。 另外， 在 3个居群的黄花杓兰菌根系统中涉及 3种类型的真菌， 说明不同种的真菌能促进同一种
杓兰植物生长发育。 这很可能是因为这些真菌皆能提供兰科植物萌发生长所需要的营养物质， 它们之间
存在营养专一性［23－24］， 此结论还有待进一步研究证实。
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