全 文 ：书白藓种壳粗提物体外抑菌作用的研究
丁 芬
哈尔滨圣泰生物制药有限公司( 黑龙江 哈尔滨 150025)
摘 要 白藓( Dictamnus dasycarpus Turcz. ) 为芸香科( Ｒutaceae) 白藓属( Dictamnus) 植物。本实验主要对黑龙
江牡丹江地区白藓的 95%乙醇提取物通过纸片琼脂扩散法和 MIC 法进行了抑菌实验。研究结果表明:白藓种壳醇
提物的氯仿相、乙酸乙酯相萃取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草杆菌的抑菌作用相似，对变形杆菌的抑制作用
主要表现在其中等强度的极性部位乙酸乙酯萃取相。从上述实验结果可得出结论:极性较强的乙酸乙酯相提取物对
4种细菌抑菌效果较为突出。白藓种壳粗提物氯仿相对供试菌的最小抑菌浓度分别是金葡菌 1. 57 mg. ml －1、大肠杆
菌 1. 57mg. ml －1、枯草杆菌 3. 13 mg. ml －1，变形杆菌 3. 13 mg. ml －1。白藓种壳粗提物乙酸乙酯相对供试菌的最小抑
菌浓度分别:金葡菌 1. 57 mg. ml －1、大肠杆菌 1. 57 mg. ml －1、枯草杆菌 3. 13 mg. ml －1，且对变形杆菌无抑菌效果。
关键词:白藓;抑菌;纸片琼脂扩散法; MIC法
中图分类号:Ｒ285 文献标识码:A 文章编号:1006 － 2882(2013)01 － 058 － 02
Study on Dittany shell Extracts in Vitro Bacteriostatic Action
Ding Fen
Harbin Shengtai Biological Pharmaceutical Co.，Ltd(Heilongjiang Harbin 150025)
Abstract:The genus Dictamnus dasycarpus Turcz，Belongs to Ｒutaceae family. The Anti － bacteria effects of Dictamnus
dasycarpus Turcz. in mudanjiang Heilongjiang Province in 95% Ethanol extracts were studied by MIC and Agar diffusion
method. The results showed that:the antimicrobial activities against Staphyloccocus aureus Ｒosenbach，Escherichia coli，Bacillus
subtilis of Chloroform extraction phases is the same as ethyl acetate extraction phases. The active ingredients of Dictamnus
dasycarpus Turcz. mainly existed in chloroform and ethyl acetate extraction phases. The MIC of the Chloroform extracts from
Dictamnus dasycarpus Turcz. against tested strains which is 1. 57 mg. ml －1 on Staphylococcus aureus and Escherichia coli，3. 13
mg. ml －1 on Bacillus subtilis and Proteus vulgaris 3. 13 mg. ml －1. The MIC of ethyl acetate extracts from Dictamnus dasycarpus
Turcz. against tested strains which is 1. 57 mg. ml －1 on Staphylococcus aureus and Escherichia coli，3. 13 mg. ml －1 on Bacillus
subtilis，but weaker inhibition on Proteus vulgaris.
Key words:Dictamnus dasycarpus Turcz.;Inhibiting bacteria experiment;Agar diffusion method;MIC
1 实验过程
1. 1 培养基的制备
LB(Luria － Bertani)固体培养基:45g 营养琼脂加
1000ml蒸馏水煮沸后定容。于 121℃灭菌 20min。
LB液体培养基:牛肉膏 3g、蛋白胨 10g、氯化钠 5g、蒸馏
水 1000ml、调 PH7. 2 － 7. 4 于 121℃灭菌 20min。
1. 2 白藓种壳提取液的制备［1 － 2］
采用溶剂冷浸法:将采集的白藓全草清洗干净、阴处晒
干，挑选出阴干的白藓种壳，将其粉碎、过筛。准确称取
330g种壳干粉，放入锥形瓶中，按料液比 1:5 加入 95%的乙
醇水溶液，然后于室温下浸提 24h，浸提过程每隔 2h搅拌一
次，抽滤，重复 3 次，将滤液合并，用旋转蒸发仪减压浓缩至
无乙醇味，最后得浓缩液 A0 为 250ml。密封保存于 4℃冰
箱中备用。
1. 3 白藓种壳不同溶剂提取物的制备
采用液 －液萃取法:将提取的浓缩液依次用等体积的
石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，每种溶剂萃取 3 次，
合并 3 次萃取液，减压浓缩至蒸干溶剂，分别获得石油醚萃
取相(A1)、氯仿萃取相(A2)、乙酸乙酯萃取相(A3)和水萃
取相(A4)。
1. 4 样品的制备
准确称取 A2、A3，分别溶于 DMSO中配制成 25mg /ml的
溶液。头孢氨苄霉素(T)配制成 10mg /ml 作为阳性对照。
每种样品经微孔滤膜(孔径 0. 22μm)过滤灭菌后待用。A1、
A4、萃取物质量太少，因此未被选用。
1. 5 菌液的制备
在无菌室中将供试菌种移接入相对应的试管斜面培养
基上，进行活化，细菌置于 37℃培养箱中培养 24 h，用无菌
·85· 黑龙江医药 Heilongjiang Medicine Journal Vol. 26 No. 6 2013
DOI:10.14035/j.cnki.hljyy.2013.01.028
书水配制成 1 × 107 － 1 × 108 CFU /ml的菌液。
1. 6 体外抑菌试验(滤纸片法)
用打孔器将滤纸打成直径为 10mm 的圆纸片，121℃灭
菌 30min，在每种待测样品中浸入无菌滤纸片，充分浸泡后
取出、晾干。在超净工作台上将灭菌后的固体培养基倒入
无菌培养皿中，每皿 20ml左右。待冷却凝固后，加入制备好
的菌悬液各 0. 1ml 用涂布棒将菌液涂布均匀。用无菌镊子
夹取含样品液的滤纸片贴在培养基表面。每皿贴 3 片，每
个菌种 3 次重复，放在 37℃恒温培养箱中培养 24 h，用游标
卡尺测定其抑菌圈直径，取 3 个平行的平均值。以 DMSO
做为空白对照。
1. 7 最低抑菌浓度(M IC值)的测定
以 A1 为例:取灭菌试管若干支，按每组 9 支进行分组。
第 1 － 7 支试管中加入灭菌的营养琼脂培养基 2ml，向第 1
支试管中加入 2ml 药液，混匀后吸出 2ml 加至 2 号试管中，
如此稀释至第 7 管，此管弃去 2ml。则各管药物稀释倍数依
次为 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128，药液浓度分别为
12. 5、6. 25、3. 13、1. 57、0. 78、0. 39、0. 20mg /ml。然后向各
管中加入 0. 1ml 的菌悬液。第 8 支试管中加入 2 ml LB 液
体培养基不加样品液作为阳性对照，第 9 支试管中加入提
取液但不加菌悬液作为阴性对照，于 37℃培养 24h，观察抑
菌效果。试验重复 3 次。
培养基透明为无菌生长，混浊为有菌生长。以无菌生
长的最低药物浓度作为最低抑菌浓度(MIC)。对药液颜色
较深、肉眼不宜判定有无细菌生长者，在营养琼脂平板上划
线接种，37℃恒温培养 24h 后取出，以无细菌生长平板内药
物的最小浓度为此药物对该菌株的最低抑菌浓度［3 － 5］。其
余样品操作方法同 A1。
1. 8 实验数据处理
1. 8. 1 三氯甲烷相抑菌圈法抑菌效果分析
表 1 白藓种壳氯仿相乙酸乙酯相滤纸片法的抑菌结果
供试菌种 Testing strain
抑菌圈直径
Diameter of bacteriostasis /mm
A2 A3 T
金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 15. 3 15. 0 30. 1
大肠杆菌 Escherichia coli 14. 5 14. 1 24. 1
变形杆菌 Proteus vulgaris 13. 2 － －
枯草杆菌 Bacillus subtilis 12. 7 12. 8 16. 0
注:“－”没有抑菌活性
样品液浓度:25 mg. ml －1
从以上数据可以得出:白藓种壳粗提物氯仿相的抑菌
圈直径金葡菌 ＞大肠杆菌 ＞变形杆菌 ＞枯草杆菌。白藓种
壳粗提物乙酸乙酯相对菌株的抑制效果:金葡菌 ＞大肠杆
菌 ＞枯草杆菌，对变形杆菌无抑菌效果。其中金黄色葡萄
球菌、枯草杆菌为革兰氏阳性菌，大肠杆菌、变形杆菌为革
兰氏阴性菌。
白藓种壳粗提物氯仿相和乙酸乙酯萃取相的抑菌圈直
径结果趋势基本一致，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌效
果强于变形杆菌和枯草杆菌，且乙酸乙酯相对变形杆菌不
具抑菌作用。
1. 8. 2 三氯甲烷相和乙酸乙酯相对供试菌的最小抑菌浓度
研究
表 2 白藓种壳提物对供试菌的最小抑菌浓度
萃取相
Extraction
phase
MIC /mg. ml － 1
金黄色
葡萄球菌
Staphylococcus
aureus
大肠杆菌
Escherichia coli
变形杆菌
Proteus vulgaris
枯草杆菌
Bacillus subtilis
A2 1. 57 1. 57 3. 13 3. 13
A3 1. 57 1. 57 － 3. 13
阳性 － － － －
阴性 + + + +
T 0. 16 0. 31 － 1. 25
注:“－”没有抑菌活性
“+”无菌生长
显示对应的拉丁字符的拼音
从以上数据可以得出:白藓种壳粗提物氯仿相对供试
菌的最小抑菌浓度分别是金葡菌 1. 57 mg. ml －1、大肠杆菌
1. 57mg. ml －1、枯草杆菌 3. 13 mg. ml －1，变形杆菌 3. 13
mg. ml －1。白藓种壳粗提物乙酸乙酯相对供试菌的最小抑
菌浓 度 分 别:金 葡 菌 1. 57 mg. ml －1、大 肠 杆 菌 1. 57
mg. ml －1、枯草杆菌 3. 13 mg. ml －1，且对变形杆菌无抑菌效
果。其中金黄色葡萄球菌、枯草杆菌为革兰氏阳性菌，大肠
杆菌、变形杆菌为革兰氏阴性菌。
阳性对照均没有抑菌活性，阴性对照均为无菌生长。
符合抑菌实验要求。
2 研究结论
氯仿相和乙酸乙酯相对四种供试菌都具有较好的抑菌
效果，但抑菌效果不同。其中氯仿相和乙酸乙酯相对大肠
杆菌、金葡菌抑菌效果较好，其最低抑菌浓度均为 1. 57mg /
ml，氯仿相对变形杆菌和枯草杆菌抑菌效果稍差，其最低抑
菌浓度均为 3. 13mg /ml;乙酸乙酯相对枯草杆菌的最小抑菌
浓度为 3. 13mg /ml，且对变形杆菌不具抑菌作用。
白藓种壳的两个萃取相对金葡菌、大肠杆菌和枯草杆
菌的抑菌作用相似，对变形杆菌的抑制作用主要表现在其
中等强度的极性部位乙酸乙酯萃取相。结果证明本实验方
法是可以实施，希望能为我国芸香科植物的抑菌药理活性
提供科学依据。
参考文献
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收稿日期:2012 － 03 － 01
·95·黑龙江医药 Heilongjiang Medicine Journal Vol. 26 No. 6 2013