全 文 ：2008年 6月第 31卷第 2期 成都中医药大学学报
Jun.2008, Vol.31, No.2 JournalofChengduUniversityofTCM
白芷 ISSR-PCR反应体系的建立和优化
郭丁丁 1 　马逾英1 　唐琳 2 　陈要臻2
(1.成都中医药大学 药学院 , 四川成都　610075; 2.四川大学生命科学院 , 四川成都　610064)
　　摘　要:目的:建立白芷的 ISSR最佳反应体系及 PCR扩增参数 , 为今后利用 ISSR标记技术进行白芷
鉴定及种质遗传多样性分析提供一个标准化程序 。方法:以白芷基因组 DNA为模板 , 分析了 ISSR反应体
系中模板 DNA、 Mg2+、 dNTPs、引物浓度 , TaqDNA聚合酶用量及退火温度对 ISSR-PCR扩增的影响 。结
果:建立了重复性好 , 分辨率高的 ISSR反应体系 , 即在 25 μL反应体系中 , 模板 DNA浓度为 10 ～ 30 ng,
2.5μL10×PCRbufer(Mg2+ free), MgCl2 2.0mmol/L, dNTPs0.2mmol/L, Taq酶 1.0U, 引物 0.6μmol/
L;扩增程序为:94℃预变性 5 min;94℃变性 30 s, 引物在筛选后的最佳退火温度退火 45 s, 72℃延伸 2
min, 共计 39个循环 , 循环结束后在 72℃延伸 5min。结论:建立了适用于白芷的 ISSR反应体系 , 为今后
利用 ISSR标记技术开展白芷遗传变异分析和构建遗传图谱奠定了基础 。
关键词:白芷;ISSR反应体系;建立和优化
中图分类号:R282.71;R931.5　　文献标识码:A　　文章编号:1004-0668 (2007)02-0045-04
基金项目:国家自然科学基金资助项目 “白芷优良种质资源综合评价的研究” (编号:30572337)
作者简介:郭丁丁 , 女 , 1983年生;硕士研究生 , 研究方向:中药品种 、 质量和资源开发研究。马逾英 , 通讯作者 , 副教
授 , 硕士生导师 , 研究方向:植物生物技术及天然产物的研究。
OptimizationfortheReactionSystemofAngelicadahuruicaISSR-PCR
GUODing-ding, MAYu-ying, TANGLin, etal
(1.ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine, Chengdu, Sichuan, 610075;2.SichuanUniversity, Chengdu, Sichuan, 610064, China)
Abstract:ThispaperstudiedtheeffectingfactorsinAngelicadahuricaISSRanalysis.ThesefactorsincludedDNA, Mg2+, dNTPs,
TaqDNApolymeraseandprimerconcentration, andannealingtemperature.AreactionsystemandamplifiedproceduresuitableforAngel-
icadahuricawereestablished, thatis, 25μLamplificationreactionssystemcontaining10 ～ 30ngtemplateDNA、 2.5μL10×PCRbufer
(Mg2+free)、 MgCl2
2.0 mmol/L、 dNTPs0.2 mmol/L、 TaqDNApolymerase1.0 U、 primer0.6μmol/L.Theoptimalamplifiedprocedurewereasfol-
lows:afterapre-denaturingof5minat94℃, 39 cycleswereperformedwithdenaturingof30sat94℃, annealingof45sduetodena-
turingtemperatureofdiferentprimer, extensionof2minat72℃, afinalextensionstepof7minat72℃ andholdat4℃.Thisoptimal
systemlaidthestandardizationprogramoftheidentificationofAngelicadahuricaandtheefficientuseofitsgermplasmresource.
Keywords:Angelicadahurica;ISSRreactionsystem;establishmentandoptimization
　　ISSR标记技术由加拿大蒙特利尔大学的 Zietk-
iewicz等于 1994年提出[ 1] , 它是在 SSR序列的 3
端或 5 端加上 2 ～ 4个随机核苷酸 , 在 PCR反应
中 , 锚定引物可以引起特定位点退火 , 导致与锚定
引物互补的间隔不太大的重复序列间 DNA片段进
行 PCR扩增。 ISSR分子标记因具有操作简单 、 快
速高效 、遗传多态性高 、 重复性好等特点 , 已被广
泛应用植物遗传多样性分析 、 DNA指纹图谱绘制及
分子生态学研究等方面 [ 2-7] 。
白芷 , 来源于伞形科植物白芷 Angelicadahurica
(Fisch.exHofm.)Benth.etHook.f.或杭白芷 An-
gelicadahurica(Fisch.exHofm.)Benth.etHook.
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DOI :10.13593/j.cnki.51-1501/r.2008.02.016
成都中医药大学学报 2008年第 31卷
f.var.formosana(Bois.)ShanetYuan的干燥根 ,
具有驱风散寒 , 燥湿排脓 , 消肿止痛等功效 , 临床
应用广泛。目前对白芷品质 、化学成分 、 药理作用
等方面的研究较多 , 其种质资源多样性 、 亲缘关系
方面也有一些研究报道[ 8-10] , 但应用 ISSR分子标记
技术对白芷种质资源遗传多样性进行的研究迄今未
见报道 。本实验首次进行了白芷 ISSR反应体系优
化的研究 , 建立了重复性好 、 结果清晰而稳定的白
芷 ISSR反应体系和扩增程序 , 为进一步利用该标
记技术进行白芷鉴定 、种质资源遗传多样性分析及
构建遗传图谱奠定了基础 。
1　材料和方法
1.1　供试材料
实验所用白芷材料采自于四川遂宁 GAP基地
白芷种质资源圃 , 经贾敏如教授鉴定 。取新鲜叶
片 , 用硅胶迅速干燥后带回实验室 , 储于 -70℃冰
箱保存 。
1.2　试剂及仪器
Mg2+、 10 ×PCRbufer(Mg2+ free)、 TaqDNA
聚合酶购于大连宝生物公司;引物根据加拿大哥伦
比亚大学 (UBC)公布的序列设计 , 由北京赛百盛
基因技术有限公司合成;BiometraTpersonalPCR扩增
仪;GeneGeniusBio-imagingSystem凝胶成像仪。
1.3　方法
1.3.1　基因组 DNA的提取及检测
改良 CTAB法提取总 DNA[ 11] :液氮中迅速将
样品研磨成粉 , 加 800 μL2×CTAB提取液 , 混匀
后 65℃水浴保温 60 min, 偶尔轻摇。 10000 r/min
离心 2 min, 取水相 , 等体积氯仿 /异戊醇 (24∶
1), 抽提 2次 , 10000 r/min离心 10 min。水相中
加 2/3体积冰冷异丙醇 , 置 -20℃ 30 min以上。
10000 r/min离心 10 min收集沉淀 , 室温下自然风
干后溶于 400 μLRnaseA储备液 (10 mg/mL)中 ,
37℃保温 1 h, 等体积氯仿 /异戊醇 (24∶1)抽提
1次 , 取水相加入 1/5体积 10 mol/L的 NH4Ac及 2
体积冰冷的 95%乙醇 , 置 -20℃至少 30 min。
10000 r/min离心 10 min收集沉淀 , 70%乙醇洗沉
淀 , 室温下自然风干至无醇味 , 加少量水溶解后放
入 -20℃储存。采用分光光度计法测定其浓度和纯
度 , 同时采用琼脂糖凝胶电泳法检测提取的 DNA
是否降解。最后将样品稀释为 100ng/μL, 用于 IS-
SR反应条件的优化实验。
1.3.2 　ISSR-PCR初始条件及程序
根据实验室前期研究 , 确定白芷 ISSR-PCR初
始 25 μL反应体系包括:10 ×PCRbufer(Mg2+
free);MgCl2 1.5 mmol/L;dNTPs0.2 mmol/L;引
物 0.8μmol/L;Taq酶 1.0U;基因组 DNA10 ～ 20
ng。
相应的扩增程序为:94℃预变性 5 min;94℃
变性 30s;引物在筛选后的最佳退火温度退火 45s,
72℃延伸 2 min, 共计 39个循环 , 循环结束后在
72℃延伸 5 min。
1.3.3　实验设计
引物的退火温度在 Tm-8℃ ～ Tm+12℃范围内
由 PCR扩增仪自动产生 8个温度梯度 , 选择最佳温
度做以下实验。
在上述其他条件不变的情况下分别改变以下
量 , 每一个合适条件确定后作为后续研究的一个条
件。每一种组合都设立相应的阴性对照 (以等体积
的无菌双蒸水代替模板 DNA作为对照)。
本实验 DNA模板量设立以下 6个梯度:10 ,
20, 30 , 40, 50, 60 ng;Mg2+设立以下 9个浓度:
1.0, 1.2, 1.5, 1.8, 2.0, 2.2, 2.5, 2.8, 3.0
mmol/L;dNTPs设立以下 7个处理:0.05, 0.1 ,
0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.4 mmol/L;TaqDNA聚
合酶用量:0.5 , 1.0, 1.5 , 2.0, 2.5 U;引物浓
度设立以下 7个处理:0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、
0.6、 0.8μmol/L。
1.3.4 　ISSR-PCR产物鉴定
反应产物在含有 EB的 1.5%的琼脂糖凝胶电
泳中电泳分离 , 用 DNAMarker(100bp)作为相对
分子量标记 , 以 5 V/cm的电压电泳 2.5 ～ 3 h, 在
紫外凝胶成像系统下观察照相见图 1。
1-6:DNA量为 10, 20, 30, 40, 50, 60ng
图 1　 DNA模板浓度对 PCR反应的影响
2　结果与讨论
2.1　模板 DNA浓度对 ISSR扩增的影响
·46·
第 2期 郭丁丁等　白芷 ISSR-PCR反应体系的建立和优化　
适宜的 DNA模板量是影响 ISSR-PCR扩增效
果的一个重要因子 , 模板量过低 , 分子碰撞的几率
低 , 扩增产物不稳定或无扩增产物;模板量过多 ,
特异扩增效率降低 , 非特异性产物增加。本试验中
10 ng～ 60ng范围内均可扩增出条带 , 但在 10ng～
30 ng时扩增的条带多且清晰。见图 2。此外 , 扩增
效果还与模板 DNA的纯度有关 。根据实验结果及
上述原理 , 认为 10 ng～ 30 ng的模板 DNA含量范
围适合于白芷的 ISSR试验分析 。
2.2　Mg2+浓度对 ISSR扩增的影响
PCR反应混合物中 Mg2+浓度对反应的特异性
和扩增效率均有影响 。Mg2+是 Taq酶实现聚合反应
所必需的 , 但 Mg2+过多 , 易鳌合 dNTPs, 使 dNTPs
消耗殆尽 , 无延伸反应 , 扩增产物单链化 , 造成扩
增失败;Mg2 +过少又造成 dNTPs鳌合 Mg2+或降低
Taq酶活性 。此外 , Mg2+还直接影响随机引物与
DNA模板的结合 , 从而导致 PCR结果的改变。本
试验通过对 9个梯度的浓度进行筛选认为 Mg2+浓
度为 2.0mmol/L时效果最佳。
2.3　 dNTPs浓度对 ISSR扩增的影响
dNTPs是 PCR反应的原料 , 其量的多少对反应
的特异性以及扩增产物的量有较大影响 。浓度过
低 , 分子碰撞几率低 , 扩增产物减少 , 易导致条带
模糊;浓度过高 , 一方面降低反应的正确率 , 另一
方面同 Taq酶竞争 Mg2+, 使反应体系中 Mg2 +总量
降低 , Taq酶活性受到影响。本试验对 dNTPs浓度
进行了 7个梯度的考察 , 结果表明当浓度在 0.2
mmol/L时 , 条带多且清晰 , 而高于或低于此浓度
时 , 扩增较少或无扩增。
2.4　TaqDNA聚合酶对 ISSR扩增的影响
Taq酶的活性与用量直接关系到 PCR扩增反应
的成败 , 是 PCR反应中最重要的因子 。酶含量过低
会导致扩增产物不足;含量过高会导致产生非特异
性扩增 , 造成假阳性 。图结果表明:0.5 ～ 2.5U均
可获得重复清晰的条带 , 考虑到取样时尽量减少误
差 , 我们选择 1.0 U用于白芷的 ISSR试验分析。
1, 6— 0.5U　 2, 7— 1.0U　3, 8— 1.5U　4, 9— 2.0U　5, 10— 2.5U
图 2　TaqDNA聚合酶对 PCR反应的影响
2.5　引物浓度对 ISSR扩增的影响
引物浓度对 PCR扩增的带型有明显的影响 。浓
度过低不能扩增 , 浓度过高又产生假阳性 。以 868
号引物 , 比较了引物浓度差异对扩增结果的影响。
发现在 0.1 ～ 0.2 μmol/L时条带数量少;0.3 ～ 0.5
μmol/L其扩增效果较前者好 , 但 0.6 μmol/L时扩
增效果最好 , 条带数目多且清晰 , 0.8 μmol/L时条
带数目减少 , 因此 , 确定引物浓度为 0.6 μmol/L。
2.6　退火温度对 ISSR扩增的影响
根据上述各因子比较实验的结果 , 可以确定白
芷 ISSR-PCR最佳反应体系 , 但反应程序中变性 、
退火 、 延伸的温度与时间 、循环的周期数也会影响
PCR反应的结果 , 本实验主要分析了退火温度的影
响。
引物的退火温度极大地影响着 ISSR反应的进
行 , 退火温度过低易导致非特异性扩增 , 重复性降
低;温度过高又使条带减少 , 导致一些可能反应多
态性的条带消失。引物不同 , 退火温度也不一样 ,
因而确定合适的退火温度非常必要 。本实验采用引
物 Tm-8℃ ～ Tm+12℃范围 , 以 864号引物
[ (ATG)6, Tm=48℃] 为例 , 由 PCR扩增仪自动
产生 8个温度 , 选择最佳退火温度。由图得出 864
·47·
成都中医药大学学报 2008年第 31卷
引物的 Ta值为 48℃。
1-7:引物浓度为 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5,
0.6, 0.8μmol/L
图 3　引物浓度对 PCR反应的影响
1-8:温度为:40.0, 41.3, 43.8, 47.3, 52.1,
55.9, 58.4, 60.0℃
图 4　退火温度对 PCR反应的影响
3　结论
ISSR分子标记技术基于 PCR反应 , 其扩增条
带虽较 RAPD标记稳定 , 但也受反应条件变化以及
物种不同的影响 。该实验结果证明 , 采用不同的反
应体系会对 ISSR扩增产生较大的影响 , 从而影响
ISSR分析的准确性 , 而 ISSR带谱的准确性与稳定
性是进行遗传多样性分析的前提 。为了利用这一分
子标记对白芷进行遗传多样性分析 , 获得重复性和
可靠性较高的 ISSR带谱 , 有必要对其影响因子进
行筛选和优化 , 确立最适宜的 ISSR反应体系。
本研究以白芷 DNA为材料 , 建立了重复性好 ,
分辨率高的 ISSR反应体系 , 即在 25 μL反应体系
中 , 模板 DNA浓度为 10 ～ 30 ng, 2.5 μL的 10 ×
PCR bufer(Mg2+ free), MgCl2 2.0 mmol/L,
dNTPs0.2mmol/L, Taq酶 1.0 U, 引物 0.6 μmol/
L;扩增程序为:94℃预变性 5 min;94℃变性 30
s, 引物在筛选后的最佳退火温度退火 45s, 72℃延
伸 2min, 共计 39个循环 , 循环结束后在 72℃延伸
5min。利用该体系 , 对 100条 ISSR引物进行筛选 ,
得到了 10条反应条带清晰 、 多态性丰富的引物 ,
关于白芷种质资源遗传多样性 ISSR的研究将另文
报道。
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(收稿日期:2008-01-05)
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