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Study on Extraction Technology of Hirudo from Qianliening Capsule
WU Yi-man, ZHOU Jian-heng, HONG Zhen-feng, et al
（College of Integrative Medicine, FUTCM, Fuzhou, Fujian 350108, China)
ABSTRACT: Objective To optimize the extraction technology of hirudo from Qianliening capsule.
Methods The antithrombin activity was served as index, and orthogonal design method was used to obtain
extraction parameters. Results The optimized extraction technology was as follows: 60% ethanol was used
as solvents, the volume of solvents was 6 times of that of materia medica, the soaking time was 24 h, and the
percolate speed was 1 mL/min. Conclusion The percolation process can be used for the extraction of hiru-
do from Qianliening capsule.
KEY WORDS: Qianliening capsule; hirudo; extraction technology; orthogonal design
在过去 20 年，约有 1 ／ 2 的药物来源于天然产
物或与天然的先导化合物有关， 天然产物是创制
新药的重要原料来源 ［1］。 研究发现，特殊生态环境
下的微生物能够产生特殊的次生代谢产物，内生真
菌存在于植物体内的特殊生长环境，已被证实具有
合成和宿主植物相同或相似活性成分的能力 ［2］。
由于苔藓植物生长环境特殊， 其内生真菌较种子
植物内生真菌的生长环境更为特殊， 因此是筛选
天然生物活性成分或先导化合物的潜在资源。 粗
疣合叶苔（Scapania verrucosa Heeg.）常在潮湿、阴
凉的岩石等独特的环境下生长， 植株高 10 cm 左
右，含有多种挥发性成分，宿主及其内生真菌的醇
提取物均具有抗肿瘤作用 ［3］，是筛选天然生物活
性成分的新资源， 已从粗疣合叶苔抗肿瘤内生真
菌的次生代谢产物中获得挥发性成分 ［3］，我们采
用 DPPH 法 （2，2-二苯基-1-苦肼基自由基，2，2-
diphenyl-1-picrylhydrazyl）筛选抗氧化活性的内生
真菌， 为抗氧化的天然生物活性成分研究提供实
验依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器 UV-1800 紫外分光光度计（日本岛津
公司）；HYG-A 全温摇床柜（太仓市试验设备厂）；
SW-CJ-1D 超净工作台（苏净集团）；YXQ-LS-75S
Ⅱ蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司）。
1.2 试药 DPPH（日本和光纯药株式会社，AR）；
Vit C （中国药品生物制品检验所， 批号：10425-
DPPH法测定粗疣合叶苔内生真菌的抗氧化活性
曾培源 1，林雄浩 1，蔡巧燕 2，吴锦忠 2
（1. 福建中医药大学药学院，福建 福州 350108；2. 福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350108）
摘要： 目的 研究粗疣合叶苔内生真菌的体外抗氧化作用。 方法 以 2，6－二叔丁基对甲
酚（BHT）、L-抗坏血酸（Vit C）为对照，采用 DPPH 法测定粗疣合叶苔中的 49 株内生真菌的抗氧化
活性。 结果 具有抗氧化活性的菌株 6 株， 其中活性菌株 T24、T38、T44 对 DPPH 自由基有较强
的清除作用，半数抑制浓度 IC50为 8.493、14.366、18.349 μg ／mL。 结论 粗疣合叶苔含有抗氧化活
性的内生真菌，是筛选天然生物活性成分或先导化合物的潜在资源。
关键词：粗疣合叶苔；内生真菌；抗氧化活性；DPPH 法
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1004-5627（2010）05-0041－03
收稿日期：2010-05-05
基金项目：福建省自然科学基金资助课题（2008J0097），福建省中西医结合老年性疾病重点实验室开发课题（2008 J1004-42），陈可冀中西
医结合发展基金（CKJ2008079）
作者简介：曾培源（1985—），男，2008 级中药学专业硕士研究生，主要从事药用植物资源化学研究。
通信作者：吴锦忠（1965—），男，教授。 E-mail：jinzhongfj@126.com
Journal of Fujian University of TCM October 2010，20（5）
福建中医药大学学报 2010 年 10 月 第 20 卷 第 5 期
41
DOI:10.13261/j.cnki.jfutcm.002396
200301）；BHT（上海华蓝生物科技有限公司，批号：
26973）；甲醇、乙酸乙酯等试剂为分析纯。 自制马
铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）和马铃薯葡萄糖培
养基（PDB）。 粗疣合叶苔（Scapania verrucosa Heeg.）
于 2006 年 10 月采自浙江省雁荡山，由上海师范
大学曹同教授鉴定。 内生真菌按组织分离法从粗
疣合叶苔中分离、 纯化得到 49 株 （编号：T1～
T49）［4］。
2 方 法
2.1 内生真菌发酵培养 从 PDA 平板培养基中
取内生真菌 1 cm×cm 左右， 转接入 250 mL 摇瓶
装的 100 mL 的 PDB 培养基中，28℃、200 r ／min 摇
床振荡培养 14 d，得到发酵液。
2.2 样品溶液制备 发酵液经 4 层纱布过滤得
到上清液，用等体积的乙酸乙酯萃取 3 次，浓缩至
干，4℃保存。 分别精密称取干燥恒重的乙酸乙酯
提取物 5 mg， 甲醇溶解， 定容至 50 mL， 即 100
μg ／mL 的母液，备用。
2.3 DPPH 工作液的配置 精密称取 DPPH 5.9
mg，甲醇溶解，定容至 100 mL，即 0.15 mmol ／ L 的
DPPH 工作液，放置于 4℃避光保存，备用。
2.4 对照品溶液的配置 精密称取 BHT 5 mg，
甲醇溶解，定容至 50 mL，备用。 精密称取维生素
C 5 mg，甲醇溶解，定容至 50 mL，备用。
2.5 清除 DPPH 自由基能力的测定 根据 Leong
等 ［5］方法，分别取 100、50、25、12.5、6.25 μg ／mL 的
不同浓度样品溶液各 1 mL 置不同的试管，在试管
中加入 0.15 mmol ／ L 的 DPPH 溶液 2 mL，混匀，避
光反应 30 min，在 517 nm 波长处测吸光度，以上
实验平行测定 3 次。 样品对 DPPH 自由基清除率
用下式表示：
清除率＝1－Ai ／Ao×100%
Ai 为样品与 DPPH 反应后的吸光度 ；Ao 为
DPPH 与甲醇混合后的吸光度。
2.6 半数抑制浓度 IC50计算 DPPH 的原始质量
浓度减少至 50%的样品添加量即 IC50， 由统计软
件 SPSS 13.0 计算得出，当 IC50超过测定浓度范围
时 ，计为 “＞100 μg ／mL，低于 6.25 μg ／mL 时 ，计
为＜6.25 μg ／mL。
3 结 果
49 株内生真菌，经过抗氧化活性筛选和检测，
结果见表 1。 由表 1 可见，49 株内生真菌中表现较
好的抗氧化活性（IC50＜100 μg ／mL）的有 6株，分别
是 T21、T24、T32、T38、T44、T45， 占总分离菌数的
12.2%，其中 T24、T38、T44 的 IC50 值分别为（8.493
±0.391）、 （14.366±0.223）、 （18.349±0.550） μg ／
mL，阳性对照物 BHT的 IC50为（36.093±1.861） μg ／
mL。 T24、T38、T44 显示出较强的抗氧化活性，T24
抗氧化活性最强。
不同样品的不同浓度对清除 DPPH 自由基的
活性分析，结果见图 1。由图 1 可见，6 株内生真菌
乙酸乙酯提取物清除 DPPH 自由基的活性与样品
浓度呈正相关，在浓度为 25 μg ／mL 时，T24、T38、
T44 对 DPPH 自由基清除率为 95.0% 、68.5% 、
31.1%，其中 T24 在清除 DPPH 自由基活性与浓度
的相关性上表现的与Vit C极为相似。从 25 μg ／mL
到 100 μg ／mL 浓度， 对 DPPH 自由基的清除率变
化不大，对 DPPH 的清除率分别为 95.0%、94.6%、
94.0%。说明在浓度 25 μg ／mL 时，DPPH 已基本被
清除。 T38 和 T44 显示为相似的抗氧化活性。 T21、
T32、T45 清除 DPPH 自由基活性与浓度的相关性
上表现相似， 但是 3种真菌抗氧化活性较弱，在
100 μg ／mL 浓度条件下，对 DPPH自由基的清除率
仅 67.2%、63.7%、70.3%。
4 讨 论
人体中的许多疾病与自由基的过量生成有
关，但作为新陈代谢的副产物，一定的自由基在人
体中是必然存在的， 因病变或生理机能障碍而产
生的大量自由基，如果不能及时清除，就会对机会
造成氧化损伤，引起 DNA 受损、酶失活、脂质过氧
化，以致细胞死亡，从而引起机体衰老或诱发恶性
疾病的发生 ［6］。 目前从植物内生真菌中筛选抗氧
化活性物质先导化合物的报道甚少 ［7］，DPPH 法筛
选出 6 株具有抗氧化活性的粗疣合叶苔内生真
菌， 表明粗疣合叶苔内生真菌是筛选天然生物活
性成分或先导化合物的潜在资源， 其抗氧化活性
物质值得进一步的深入研究。
（本项目在国家中医药管理局中药生药学室
表 1 49 株内生真菌乙酸乙酯提取物清除
DPPH 自由基的 IC50（n＝3）
样品
T21
T24
T32
T38
T44
T45
其它菌株
BHT
Vit C
IC50
61.995±1.680
8.493±0.391
60.084±1.052
14.366±0.223
18.349±0.550
59.073±1.821
＞100
36.093±1.861
12.406±0.241
μg ／mL
福建中医药大学学报 第 20卷42
三级实验室、 福建省卫生厅中药生药学重点研究
室、 福建省中西医结合老年性疾病重点实验室完
成。 参加实验的有中国人民解放军第二军医大学
药学院秦路平教授、韩婷副教授和郭蕾同学，福建
中医药大学药学院 2009 级中药学专业硕士生张
艳艳同学、2006 级制药工程专业涂永元同学、2008
级中药学专业林剑军、黄金喜同学，特此致谢。 ）
参考文献：
［1］ 黎万奎，胡之璧 . 内生真菌与天然药物［J］. 中国天然药物，
2005，3（4）：193-200.
［2］ STIERLE A，STROBEL G，STIERLE D. Taxol and taxane pro-
duction by Taxomyces andreanae，an endophytic fungus of Paif-
ic yew［J］. Science，1993，260（5105）：214-216.
［3］ LEI GUO，JIN-ZHONG WU，TING HAN，et al. Chemical com-
position，antifungal and antitumor roperties of ether extracts of
Scapania verrucosa Heeg. and its endophytic fungus chaet -
omium fusiforme. Molecules，2008，13（9）：2114-2125.
［4］ 郭蕾，吴锦忠，许强芝，等 . 利用稻瘟霉模型筛选粗疣合叶苔
内生真菌中的活性菌株［J］. 中草药，2008，40（7）：1090－1094.
［5］ LEONG L P，SHUI G. An investigation of antioxidant capacity
of fruits in Singapore markets［J］. Food Chemistry，2002，76
（1）：69-75.
［6］ 孙丽萍，王大仟，张智武 . 11 种天然植物提取物对 DPPH 自
由基的清除作用［J］. 食品科学，2009，30（1）：45- 47.
［7］ 谢辉，陈双林. 杜仲内生球毛壳菌的抗氧化活性研究［J］. 菌
物学报，2009，28（4）：591-596.
Analysis of Antioxidant Activity of Endophytic
Fungi from Scapania verrucosa Heeg. by DPPH
ZENG Pei-yuan1, LIN Xiong-hao1, CAI Qiao-yan2, et al
(1. College of Pharmacy, FUTCM, Fuzhou, Fujian 350108, China;
2.Fujian Academy of Integrative Medicine, FUTCM, Fuzhou, Fujian 350108, China)
ABSTRACT: Objective To investigate the antioxidation of endophytic fungi from Scapania verrucosa
Heeg. in vitro. Methods Butylated hydroxytoluene and ascorbic acid were used as control, and the antioxi-
dant activity of 49 strains of endophytic fungi from Scapania verrucosa Heeg. were analyzed by DPPH. Re-
sults Six strains of endophytic fungi had the antioxidant activity, in which strain T24, T38, T44 had good
scavenging effect on DPPH free radical, and the IC50 were 8.493, 14.366, 18.349 μg/mL respectively. Con-
clusion Some endophytic fungi from Scapania verrucosa Heeg. have the antioxidant activity, and could be
used as the potential resource for screening natural bioactivity constituents and lead compounds.
KEY WORDS: Scapania verrucosa Heeg.; endophytic fungi; antioxidant activity; DPPH method
第 5期 曾培源等：DPPH 法测定粗疣合叶苔内生真菌的抗氧化活性 43