全 文 ：第 6 期
第 54 卷第 6期
2015 年 3 月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 54 No.6
Mar.，2015
收稿日期：2014－12－16
基金项目：国家自然科学基金项目（31100314）；河北省自然科学基金项目（C2012408007）；河北省遗传学重点发展学科建设项目；廊坊师范学院
微生物学重点学科项目
作者简介：侯晓强（1979－），男，河北怀来人，副教授，博士，主要从事药用植物菌根生物学研究，（电话）0316－2197013（电子信箱）xqhou1979＠126．com。
大花杓兰（Cypripedium macranthum Sw．）为兰
科杓兰属植物，其花大而艳丽，不仅是名贵的观赏
花卉，还是濒危紧缺的药用植物，对全身浮肿、小便
不利、风湿性腰腿痛、带下及跌打损伤等具有治疗
作用 ［1］，疗效确切，经济价值很高。 由于该植物的生
态环境遭到严重破坏，资源几近枯竭。 大花杓兰的
繁殖率很低，虽可以产生大量的成熟种子，但因不
含胚乳，自然条件下极难萌发。 研究表明，几乎所有
兰科植物均与真菌形成共生关系，很多内生真菌能
促进兰科植物的种子萌发，加快植株的生长，提高
繁殖率，增加宿主抗逆性，产生许多药用成分和新
化合物等。 通过对大花杓兰内生真菌的多样性进行
研究，以期更加深入地了解大花杓兰与内生真菌的
共生关系，为利用内生真菌促进大花杓兰种子萌发
和生长，实现大花杓兰的快速繁殖提供理论依据。
1 材料与方法
1．1 试验材料
供试材料为大花杓兰，分别采自北京市房山区
百花山和吉林省通化县富江乡。
大花杓兰内生真菌多样性研究
侯晓强，付亚娟，袁建平，吴智艳，王利冉，李 微
（廊坊师范学院生命科学学院/河北省高校食药用菌应用技术研发中心，河北 廊坊 065000）
摘要：对大花杓兰（Cypripedium macranthum Sw．）内生真菌类群组成及多样性进行了分析。 结果表明，从
大花杓兰植株中分离到内生真菌 59 株，利用 ITS－rDNA 序列分子鉴定法将大花杓兰内生真菌鉴定为 18
个分类单元，分布在 7 纲 9 目 11 科 16 属。 北京大花杓兰内生真菌包括 12 个属，内生真菌的多样性指数
H＝1．39、D＝0．96，优势菌群为毛壳菌属（Chaetomium）和茎点霉属（Phoma）真菌，分别占总菌株数的 15．25％
和 8．47％；吉林大花杓兰样品内生真菌归于 9 个属，内生真菌的多样性指数 H＝1．31、D＝0．93，以毛壳菌属
（Chaetomium）为优势菌群，占总菌株数的 23．73％。 由此可见，北京大花杓兰中内生真菌多样性高于吉林
大花杓兰。
关键词：大花杓兰（Cypripedium macranthum Sw．）；内生真菌；分离；鉴定；多样性
中图分类号：Q939．5 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2015）06－1357-04
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.06.019
Diversity of Endophytic Fungi in Cypripedium macranthum
HOU Xiao－qiang， FU Ya－juan， YUAN Jian－ping， WU Zhi－yan， WANG Li－ran， LI Wei
（College of Life Science， Langfang Teachers University/Edible and Medicinal Fungi Research and Development Center of Hebei Universities，
Langfang 065000， Hebei， China）
Abstract： The composition and diversity of endophytic fungal taxa in Cypripedium macranthum Sw was analyzed． The results
showed that a total of 59 fungal strains were isolated from C． macranthum． These fungi were belonged to 18 taxa containing 7
classes， 9 orders， 11 families and 16 generas with analyzing ITS－rDNA sequence． Endophytic fungal groups in Beijing C．
Macranthum included to 12 generas， with the diversity index H of 1．39 and D of 0．96． Chaetomium （15．25％） and Phoma
（8．47％） were two major fungal groups． Endophytic fungal groups in Jilin C． Macranthum included 9 generas， with the diver-
sity index H of 1．31 and D of 0．93．Chaetomium belonged to the core group（23．73％）． Diversity of endophytic fungi in Beijing
C． Macranthum was higher than that of Jilin C． Macranthum．
Key words：Cypripedium macranthum； endophytic fungi； isolation； identification； diversity
湖 北 农 业 科 学 2015 年
1．2 培养基
所用培养基为 PDA 培养基（马铃薯 200 g，葡萄
糖 20 g，琼脂 12 g，去离子水 1 000 mL）。
1．3 方法
1．3．1 内生真菌的分离 随机选取大花杓兰健康
的根、茎、叶，用清水洗净，切成 1 cm左右小段。采用
体积分数为 70％的乙醇浸泡 30 s， 无菌水冲洗，3％
次氯酸钠浸泡消毒， 根、 茎、 叶消毒时间分别为 2
min、4 min、1 min。 无菌条件下， 将材料剪成 0．2 cm
小段，置于 PDA 培养基上，25 ℃暗培养。 待组织长
出真菌菌丝，挑取菌丝先端接种至 PDA 斜面培养基
上，25 ℃暗培养完成后，4 ℃保藏。
1．3．2 内生真菌的纯化 将 PDA 斜面培养基保藏
的内生真菌接种至 PDA 平板培养基上，25 ℃暗培
养 6～7 d， 根据内生真菌的菌落形态及显微形态特
征，合并形态一致的菌株。
1．3．3 内生真菌的分子鉴定 内生真菌依据 rDNA
的内部转录间隔区（ITS）序列进行分子鉴定。内生真
菌 DNA 提取采用 CTAB 法［2］，用通用引物 ITS1（5′－
TCCGTAGGTGAACCTGCGG －3′）、ITS4（5′－TCCTC-
CGCTTATTGATATGC－3′）［3］ 扩增 ITS1，5．8S和 ITS2
的全序列。 PCR 反应体系 50 μL：10×PCR Buffer 5
μL，25 mmol ／ L MgCl2 1 μL ， 10 mmol/L dNTP 2 μL ，
10 μmol ／ L上下游引物各 1．5 μL ，1．0 U ／μL Taq酶 2
μL ，5 μg ／ mL DNA模板 2 μL，ddH2O 35 μL。 PCR热
循环程序：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 l min，55 ℃
引物复性 45 s，72 ℃延伸 1 min，共 35 个循环；72 ℃
充分延伸 8 min。 PCR 产物送上海生工生物工程有
限公司测序。将不同真菌的 ITS序列在 GenBank中进
行 BLAST 分析，寻找与查询序列相似性大于 95％［4］
的 rDNA ITS序列，利用 ClustalX 1．83 软件进行全序
列比对［5］，用 Paup* 4b10 软件［6］进行聚类分析，构建
最大邻接树。 根据聚类结果，对内生真菌进行分子
鉴定。
1．3．4 大花杓兰内生真菌多样性分析 度量在一
个特定的植物组织样品中内生真菌的丰度，采用分
离频率和多样性指数等指标［7，8］。分离频率可以反映
出某种真菌在植物中出现的频率，多样性指数反映
每种植物内生真菌的物种多样性程度。
分离频率（isolation frequency，IF）：分离到的某
一指定类型内生真菌的菌株数占分离内生真菌总
菌株数的百分率。
Shannon－Wiener 多样性指数 （H），H＝－Σ（Pi）
（lnPi）；Simpson 多样性指数（D），D＝1－Σ（Pi）2，式中Pi
为给定的菌种 i的菌株数量占真菌总数量的比例。
采用 Sorenson（Cs）相似性系数比较两地之间内
生真菌种类组成的相似程度。 Cs＝2j ／ （a＋b），式中，
j 为两个样地共有种数或属数；a 和 b 分别为样地 A
和样地 B的物种数或属数。
2 结果与分析
2．1 内生真菌的分离与鉴定
从大花杓兰材料中共分离出 59 株内生真菌，
对各菌株及与其 ITS序列相似性大于 95％的已知真
菌的 ITS 序列进行 BLAST 分析， 构建最大邻接树，
获得与待测菌株聚在同一分支且相似性最大的已
知真菌。 根据序列相似性原则［9］，进行菌种的鉴定，
若相似性≥99％，可鉴定到种；相似性为 95％～99％，
可鉴定到属；相似性＜95％，可鉴定到科。 59 株内生
真菌中 57 株分别归于 16 个属，有 1 株内生真菌只
能鉴定到纲，为粪壳菌纲（Sordariomycetes）真菌，另
有 1 株内生真菌只能鉴定到科 ， 为肉座菌科
（Hypocreaceae）真菌。 其中，毛壳菌属（Chaetomium）
和茎点霉属（Phoma）真菌为优势菌群，分别占总菌
株数的38．98％和 10．17％（表 1）。
2．2 内生真菌的分布
2．2．1 不同器官内生真菌的分布 不同地区的大
花杓兰不同器官内生真菌的数量具有一定差异，北
京百花山大花杓兰共分离出 28 株内生真菌， 其中
根中分离出 18 株，茎中分离出 7 株，叶片中分离出
3 株。 吉林通化大花杓兰共分离出 31 株真菌，其中
根中分离出 23 株，茎中分离出 5 株，叶片中分离出
3株。由此可见，大花杓兰根中内生真菌的数量高于
其他部位，而叶中的数量最少。
2．2．2 不同地区大花杓兰内生真菌的分布 北京
大花杓兰样品内生真菌的种类比吉林大花杓兰样
品多， 北京大花杓兰内生真菌归属于 12 个属和 1
个科，优势菌群为毛壳菌属和茎点霉属真菌，分别
占总菌株数的 15．25％和 8．47％；吉林大花杓兰样品
内生真菌归属于 9 个属和 1 个纲，以毛壳菌属为优
势菌群，占总菌株数的 23．73％（表 1）。 有 5 个属的
真菌均在两地的大花杓兰中出现，两个样地内生真
菌组成相似性系数 Cs＝0．43，说明北京和吉林两地大
花杓兰内生真菌组成具有一定的相似性。
2．3 大花杓兰内生真菌多样性
多样性指数主要与内生真菌的种类数量和个
体分配的均匀性有关。 北京大花杓兰内生真菌的
Shannon－Wiener 多样性指数 H＝1．39，Simpson 多样
性指数 D＝0．96；吉林大花杓兰内生真菌的 Shannon－
Wiener 多样性指数 H＝1．31，Simpson 多样性指数
D＝0．93；两地大花杓兰内生真菌的多样性存在差异，
北京大花杓兰内生真菌的多样性略高于吉林大花
1358
第 6 期
表 1 大花杓兰内生真菌种群组成
目
毛霉目
Mucorales
球壳目
Sphaeriales
肉座菌目
Hypocreales
柔膜菌目
Helotiales
散囊菌目
Eurotiales
煤炱目
Capnodiales
格孢腔菌目
Pleosporales
伞菌目
Agaricales
多孔菌目
Polyporales
科
毛霉科
Mucoraceae
毛壳菌科
Chaetomiaceae
生赤壳科
Bionectriaceae
丛赤壳科
Nectriaceae
肉座菌科
Hypocreaceae
小丛壳菌科
Glomerellaceae
发菌科
Trichocomaceae
Davidiellaceae
格孢腔菌科
Pleosporaceae
小脆柄菇科
Psathyrellaceae
原毛平革菌科
Phanerochaetaceae
属
毛霉属
Mucor
接霉属
Zygorhynchus
毛壳菌属
Chaetomium
生赤壳属
Bionectria
丛赤壳属
Neonectria
镰孢菌属
Fusarium
木霉属
Trichoderma
刺盘孢属
Colletotrichum
Leptodontidium
青霉属
Penicillium
枝孢菌属
Cladosporium
链格孢属
Alternaria
茎点霉属
Phoma
光黑壳属
Peyronellaea
小鬼伞属
Coprinellus
孔韧菌属
Porostereum
北京
1.69
3.39
15.25
3.39
1.69
3.39
1.69
1.69
1.69
8.47
1.69
1.69
1.69
吉林
23.73
5.08
3.39
1.69
1.69
5.08
3.39
3.39
1.69
3.39
合计
1.69
3.39
38.98
5.08
3.39
3.39
1.69
1.69
1.69
3.39
6.77
1.69
5.08
3.39
10.16
1.69
5.08
1.69
纲
接合菌纲
Zygomycetes
核菌纲
Pyrenomycetes
粪壳菌纲
Sordariomycetes
锤舌菌纲
Leotiomycetes
散囊菌纲
Eurotiomycetes
座囊菌纲
Dothideomycetes
伞菌纲
Agaricomycetes
门
接合菌亚门
Zygomycotina
子囊菌亚门
Ascomycota
担子菌亚门
Basidiomycota
内生真菌分离频率//%
注：根据国际真菌学会分类方法，将半知菌亚门中部分真菌归属至子囊菌亚门。
杓兰内生真菌。
3 小结与讨论
植物内生真菌的分离多采用组织分离法，即将
表面消毒后的植物组织置于培养基上培养，继而分
离内生真菌，根据宏微观形态特征和分子生物学方
法鉴定菌种，进行多样性分析。 任何一种培养基均
具有选择性，不能将植物组织中所有内生真菌分离
出来，这也是植物内生真菌研究的困境 ［10］，采用宏
基因组测序分析法能更好体现植物组织中内生真
菌的种类，但不能将内生真菌分离出来，所以组织
分离法尚为当前获得植物内生真菌的主要方法。
本研究采用组织分离法从大花杓兰植株中分
离得到内生真菌 59 株，利用 ITS－rDNA 序列分子鉴
定的方法将其鉴定为 18 个分类单元， 分布在 7 个
纲 9 个目 11 科 16 个属 ， 优势菌群为毛壳菌属
（Chaetomium）和茎点霉属（Phoma）真菌。 乔元宝 ［11］
在扁脉杓兰内生真菌多样性研究中也发现扁脉杓
兰中有毛壳菌属、丛赤壳属、镰孢菌属、链格孢属、
小鬼伞属和木霉属真菌的存在。 张亚平［12］从大花杓
兰根中也分离得到毛壳菌属、枝孢菌属、光黑壳属、
Leptodontidium、镰孢菌属、木霉属、青霉属真菌，从
山西杓兰根中同样分离到了 Leptodontidium 和毛壳
菌属真菌， 在紫点杓兰根中亦获得 Leptodontidium
属真菌。 除上述类群的真菌外，杓兰属植物内生真
菌还涉及到另外 20 个属的真菌［11，12］，可见杓兰属植
侯晓强等：大花杓兰内生真菌多样性研究 1359
湖 北 农 业 科 学 2015 年
显示出稳定的 COD 去除效果，C ／ N 值对 SBR 新型
运行方式下脱氮效果的影响较大。
7）葡萄糖作为主要碳源除磷时会减少磷的厌
氧释放量，从而降低除磷效果，减少污泥中的聚磷
菌含量。通过提高 COD的浓度则能较好地实现生物
除磷。
参考文献：
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（责任编辑 彭西甜）
（上接第 1356页）
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物内生真菌存在丰富的多样性。
大花杓兰不同器官内生真菌的数量存在一定
的差异， 根中分离到的内生真菌较茎和叶中多，叶
中最少， 可能与大花杓兰为多年生草本植物有关。
北京大花杓兰和吉林大花杓兰中只有 5 个属的真
菌同时存在，两采样地的大花杓兰内生真菌多样性
存在差异，与张亚平［12］分离得到的大花杓兰内生真
菌的类群同样存在差异，可见同一种植物在不同生
境下具有不同的内生真菌群落组成，其多样性受生
境影响较大。 这一点与 Pecoraro等［13］对兰科石豆兰
属植物内生真菌的研究结果相似。
植物中蕴藏着丰富的内生真菌，内生真菌在植
物中的分布受组织、年龄结构、生境等因素的影响，
其多样性的研究往往受到内生真菌分离方法的制
约。 因此，在随后的兰科植物内生真菌研究中，应综
合考虑这些因素，全面调查兰科植物内生真菌多样
性，获得大量的内生真菌资源，为进一步寻找兰科
植物促生真菌以及筛选内生真菌来源的生物活性
物质奠定基础。
参考文献：
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（责任编辑 韩 雪）
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