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药用苔藓植物银叶真藓和泥炭藓组织培养基配方研究



全 文 :第34卷第12期         西 南 大 学 学 报 (自然科学版)           2012年12月
Vol.34 No.12 Journal of Southwest University(Natural Science Edition) Dec. 2012
文章编号:1673-9868(2012)12-0061-07
药用苔藓植物银叶真藓和
泥炭藓组织培养基配方研究

姜 山, 田学武
贵州师范大学 生命科学学院,贵阳550001
摘要:该实验用银叶真藓和泥炭藓为外植体,以不同体积质量分数的Knop培养基、微量元素、酒石酸铵和糖类为
因子,采用正交试验设计的方法,研究影响两种苔藓植物配子托和银叶真藓原丝体生长的主要因子.研究结果显
示:① 在以上4种因子中,糖类是影响两种苔藓植物生长的主要因子,葡萄糖或蔗糖的体积质量分数在接近5g/L
时最有利于两种苔藓植物生长;② 银叶真藓原丝体液体培养,采用未经稀释的knop培养基效果最好,而在固体培
养基上培养银叶真藓和泥炭藓配子托,采用稀释2倍的Knop培养基效果最好;③ 酒石酸铵对泥炭藓配子托生长
的影响程度仅次于糖类,是比较重要的因子.
关 键 词:银叶真藓;泥炭藓;组织培养
中图分类号:Q949.35 文献标志码:A
苔藓植物是现存陆生植物中的重要类群之一,约有23 000余种,其种类数量仅次于被子植物[1].它隶
属于高等植物中较为低等的类群,是研究陆生植物进化的理想实验材料.由于苔藓植物结构简单,其拟叶
往往只有一层细胞,十分便于进行细胞学研究[2].其配子体发达,孢子体退化,是研究植物基因功能的有
用材料[3].另外,随着近年苔藓植物药理学和植物化学研究的深入,在苔藓植物体内发现了一些具生物活
性的新结构化合物.因此,苔藓植物还被认为是一类有潜力的药用植物资源[4-10].
银叶真藓Bryum argenteum 隶属真藓属,为世界广布种.据《中华本草》记载,银叶真藓有清热解毒和
止血的功效,对细菌性痢疾、鼻窦炎等疾病有较好疗效.另外,银叶真藓的环境适应能力较强,是研究植物
抗性的理想材料.泥炭藓Sphagnum隶属泥炭藓科,常见于湿润山区或沼泽中,在中国大部分山区均有分
布.据《中华本草》记载,泥炭藓具清热明目和止痒的功效,对皮肤病也有较好疗效.Bown等[11](1996)和
Saxena等[12](2004)报道泥炭藓提取物可用于治疗湿疹和其他皮肤病.由于泥炭藓有较强吸水性和抗菌活
性,在第一次世界大战时曾被用来代替药棉制作敷料[13].
对苔藓植物进行可持续的开发应用,必须首先解决培养和繁殖问题.苔藓植物组织培养多以不同体积
质量分数的Knop培养基为基本培养基[2].PPNH4 培养基也常用于小立碗藓组织培养.小立碗藓作为模式
植物是目前基因功能研究中应用最多和最广的苔藓植物,其组织培养技术比较成熟[14-16].PPNH4 和Knop
培养基的主要不同在于PPNH4 中加入了酒石酸铵和微量元素.另外,糖类是培养基中的主要碳源.因此,
① 收稿日期:2011-08-26
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30860158);贵州省科学技术基金资助项目(黔科合J字[2008]2264).
作者简介:姜 山(1967-),男,贵州贵阳人,副教授,博士,主要从事苔藓植物研究.
本实验拟考察不同体积质量分数Knop培养基、酒石酸铵、微量元素和糖类对银叶真藓和泥炭藓生长的影
响,实验结果可为筛选两种植物的最优组织培养基配方提供研究数据.
1 材料和方法
1.1  植物材料采集
在野外将苔藓植物及其基质一起采集后,装在牛皮纸袋中以避免失水.本研究所用植物材料银叶真藓
B.argenteum采自贵州师范大学校园内(海拔980m),泥炭藓S.palustre L.采自贵州省贵阳市高坡乡
(海拔1 500m).
1.2 方 法
1.2.1 培养基配制
固体培养基配制时,取4个因素:Knop培养基、微量元素、酒石酸铵和葡萄糖.每个因素的体积质量
分数设4个水平,用正交设计软件II V3.1设计实验,共有16个组合(表1).
表1 银叶真藓和泥炭藓组织培养基正交实验设计
处 理 Knop
微量元素
/(mL·L-1)
酒石酸铵
/(g·L-1)
葡萄糖(或蔗糖)
/(g·L-1)
1  11) 02) 0 0
2  1  0.50  0.25  2.5
3  1  1.00  0.50  5.00
4  1  1.50  0.75  7.5
5  1/2  0  0.25  5.00
6  1/2  0.50  0  7.50
7  1/2  1.00  0.75  0
8  1/2  1.50  0.50  2.51
9  1/4  0  0.50  7.50
10  1/4  0.50  0.75  5.00
11  1/4  1.00  0  2.50
12  1/4  1.50  0.25  0
13  1/6  0  0.75  2.50
14  1/6  0.50  0.50  0
15  1/6  1  0.25  7.50
16  1/6  1.50  0  5.00
  注:1)1代表未稀释的Knop培养基,1/2,1/4和1/6分别代表Knop培养基被稀释2,4和6倍;2)表1中的数字代表
每升培养基中加入微量元素储藏液的体积.
Knop培养基配方为:Ca(NO3)2·4H2O 1g/L,FeSO4·7H2O 13.5 mg/L,MgSO4·7H2O
0.25g/L,KCl 0.25g/L,KH2PO40.25g/L.微量元素储藏溶液中含有:CuSO4 ﹒5H2O 0.05 5g/L,
ZnSO4 ﹒7H2O 0.05 5g/L,H3BO30.61 4g/L,MnCl2 ﹒6H2O 0.389g/L,CoCl2 ﹒6H2O 0.055g/L,
KI 0.028g/L,NaMoO3 ﹒2H2O 0.255g/L.
液体培养基的配制大致与固体培养基相同,不同之处在于培养基中不加琼脂,同时蔗糖替代葡萄糖.
1.2.2 外植体消毒及接种
植物材料采集当天进行外植体消毒.首先选取生长状况良好和健壮的植株用自来水冲洗,以去除表面
基质,然后再将植株放入烧杯中.烧杯口用纱布盖上,把烧杯置于自来水下冲洗6h.冲洗后的植株在超菌
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工作台中用蒸馏水和无菌水分别清洗3次和1次后,用2%(w/w)次氯酸钠消毒2min.最后,用无菌水清
洗3~4次.用无菌镊子截取不少于100根茎尖接种到不同配方的固体培养基上.植物材料在25℃,16h光
照和8h黑暗的光照周期下培养20d.
银叶真藓原丝体液体培养采用在标准Knop培养基上培养20d的无菌植株.植株在超净工作台中用
无菌研钵研磨后,将组织原浆倒入250mL标准Knop液体培养基中,在光照摇床中培养20d(25℃,转
速120r/m,24h光照)得到原丝体母液.取母液1mL分别加到250mL不同配方液体培养基中培养
20d(25℃,转速120r/m,24h光照).
1.2.3 苔藓植物生长状况评价
银叶真藓和泥炭藓在不同配方的固体培养基上的生长状况分别用分枝数和净质量增加率作为评价指
标.银叶真藓原丝体在液体培养基中的生长状况用净质量增加率评价.
银叶真藓茎尖接种到固体培养基上生长20d后,分别计数每一根茎尖上的分枝数,然后统计不同培养
基中每一根茎尖的平均分枝数.
泥炭藓接种到固体培养基上之前,先称量每一根茎尖的质量,培养20d后再称量每一株植物质量,然
后用以下公式计算出净质量增加率:
净质量增加率 = (培养20d后的植株-最初接种的茎尖)/最初接种的茎尖(W/W)
银叶真藓原丝体母液接种到液体培养基中后,取200mL母液用滤纸过滤,滤纸连同其上的原丝体在
100℃下烘干2h.用药匙把干燥原丝体刮下称量,换算出接种的银叶真藓干物质量.用同样方法得到培
养20d后的原丝体干物质量.然后用以下公式计算净质量增加率:
净质量增加率 = (培养20d后的原丝体干物质量-最初接种的原丝体干物质量)/最初接种的原丝体干物质量
实验共重复3次,实验数据为3次重复的平均值.
图1 各因素不同水平与银叶真藓
配子托分枝数均值的关系
2 结 果
2.1 Knop培养基、葡萄糖、酒石酸铵和微量元素4
因素对银叶真藓配子托生长的影响
根据正交设计法,某因子不同水平的极差越大,
表示该因子对实验指标的影响越大,为主要因子;极
差小则为次要因子.从正交试验结果(表2)可以看出,
葡萄糖体积质量分数变化对银叶真藓生长的影响最
大,为主要因子;其次是 Knop、酒石酸铵和微量元
素.在葡萄糖各水平中,银叶真藓分枝数的平均值分
别是3.00,3.27,3.52和3.16,所以第三水平5g/L
为最好(表2,图1).同样可以得出Knop、微量元素和酒石酸铵的最好水平分别为稀释2倍后的体积质量
分数、0.5mL/L和0.5g/L(表2,图1).
2.2 Knop培养基、葡萄糖、酒石酸铵和微量元素4因素对银叶真藓原丝体在液体培养基中生长的影响
在4个因素中蔗糖的极差最大,说明该因子对实验指标的影响最大,为主要因子;其次是Knop、酒石
酸铵和微量元素(表3).在蔗糖各水平中,原丝体质量净增加率的平均值分别是6.02,9.01,12.86和
12.38,所以第三水平(5g/L)在本次实验的各水平中为最好(表3,图2).同样方法可以得出Knop、微量元
素和酒石酸铵的最好水平为原体积质量分数、0.5mL/L和0.75g/L(表3,图2).微量元素在第二水平
(0.5mL/L)时,银叶真藓质量净增加率最大.Knop培养基在不稀释的情况下,原丝体的质量净增加率最
大,随稀释倍数的加大净增加率减少.
36第12期      姜 山,等:药用苔藓植物银叶真藓和泥炭藓组织培养基配方研究
表2 银叶真藓配子托培养正交实验结果比较
处 理 Knop
微量元素
/(mL·L-1)
酒石酸铵
/(g·L-1)
葡萄糖
/(g·L-1)
分枝数
/株
1  11) 02) 0  0  2.59±0.20
2  1  0.50  0.25  2.50  3.12±0.21
3  1  1.00  0.50  5.00  3.69±0.23
4  1  1.50  0.75  7.50  3.01±0.20
5  1/2  0  0.25  5.00  3.87±0.30
6  1/2  0.50  0  7.5  3.66±0.27
7  1/2  1.00  0.75  0  3.61±0.31
8  1/2  1.50  0.50  2.51  3.15±0.19
9  1/4  0  0.50  7.50  3.23±0.21
10  1/4  0.50  0.75  5.00  3.19±0.24
11  1/4  1.00  0  2.50  3.12±0.18
12  1/4  1.50  0.25  0  3.05±0.26
13  1/6  0  0.75  2.50  3.31±0.22
14  1/6  0.50  0.50  0  3.19±0.25
15  1/6  1.00  0.25  7.50  2.73±0.20
16  1/6  1.50  0  5.00  3.33±0.30
均值1  3.10±0.10  3.20±0.20  3.18±0.30  3.00±0.18
均值2  3.50±0.12  3.29±0.25  3.19±0.10  3.27±0.12
均值3  3.15±0.20  3.18±0.10  3.40±0.20  3.52±0.20
均值4  3.14±0.10  3.23±0.15  3.17±0.15  3.16±0.15
极差 0.45±0.05  0.12±0.01  0.24±0.03  0.52±0.07
  注:1)1表示未稀释的Knop培养基,1/2,1/4和1/6分别代表Knop培养基被稀释2,4和6倍;2)每升培养基中加入
微量元素储藏液的体积.
表3 银叶真藓原丝体液体培养正交实验结果比较
处 理 Knop1)
微量元素2)
/(mL·L-1)
酒石酸铵
/(g·L-1)
蔗糖
/(g·L-1)
净质量增加率
1  1  0  0  0  5.50±0.46
2  1  0.50  0.25  2.50  10.98±0.81
3  1  1.00  0.50  5.00  15.21±1.90
4  1  1.50  0.75  7.50  17.80±1.5
5  1/2  0  0.25  5.00  10.16±0.88
6  1/2  0.50  0  7.50  10.82±0.91
7  1/2  1.00  0.75  0  7.59±0.43
8  1/2  1.50  0.50  2.51  10.15±1.10
9  1/4  0  0.50  7.50  11.32±0.97
10  1/4  0.50  0.75  5.00  11.52±0.95
11  1/4  1.00  0  2.50  6.26±0.70
12  1/4  1.50  0.25  0  4.56±0.49
13  1/6  0  0.75  2.50  8.66±0.79
14  1/6  0.50  0.50  0  6.42±0.69
15  1/6  1  0.25  7.50  9.58±0.10
16  1/6  1.50  0  5.00  6.54±0.59
均值1  12.37±2.00  8.91±0.80  7.28±0.81  6.02±0.58
均值2  9.68±0.60  9.94±1.10  8.82±0.84  9.01±0.98
均值3  8.42±0.91  9.66±1.23  10.78±1.20  12.86±1.14
均值4  7.80±0.72  9.76±0.92  11.40±0.97  12.38±1.24
极差 4.57±0.71  1.03±0.78  4.11±0.60  6.36±0.65
  注:1)1表示未稀释的Knop培养基,1/2,1/4和1/6分别代表Knop培养基被稀释2,4和6倍;2)每升培养基中加入
微量元素储藏液的体积.
46 西南大学学报(自然科学版)     http://xbbjb.swu.cn     第34卷
2.3 Knop培养基、葡萄糖、酒石酸铵和微量元素4因素对泥炭藓配子托生长的影响
在4个因素中葡萄糖的极差最大,说明该因子对泥炭藓配子托生长的影响最大,为主要因子;其次是
酒石酸铵、Knop和微量元素(表4).Knop、葡萄糖、酒石酸铵和微量元素的最好水平为稀释2倍后的体积
质量分数、5g/L、0.5g/L和1.5mL(表4,图3).
表4 泥炭藓配子托培养正交实验结果比较
处 理 Knop1)
微量元素2)
/(mL·L-1)
酒石酸铵
/(g·L-1)
葡萄糖
/(g·L-1)
净质量增加率
1  1  0  0  0  1.72±0.20
2  1  0.50  0.25  2.50  9.46±0.12
3  1  1.00  0.50  5.00  11.12±1.10
4  1  1.50  0.75  7.50  12.37±1.50
5  1/2  0  0.25  5.00  13.00±1.27
6  1/2  0.50  0  7.50  7.58±0.03
7  1/2  1.00  0.75  0  3.68±0.12
8  1/2  1.50  0.50  2.51  11.21±1.20
9  1/4  0  0.50  7.50  10.65±1.23
10  1/4  0.50  0.75  5.00  8.19±0.82
11  1/4  1.00  0  2.50  5.94±0.42
12  1/4  1.50  0.25  0  1.46±0.09
13  1/6  0  0.75  2.50  6.21±0.53
14  1/6  0.50  0.50  0  2.47±0.29
15  1/6  1.00  0.25  7.50  10.31±0.87
16  1/6  1.50  0  5.00  9.12±0.84
均值1  8.67±0.81  7.80±0.82  6.09±0.69  2.33±0.93
均值2  8.87±0.92  6.93±0.51  8.56±0.82  8.21±0.92
均值3  6.56±0.69  7.76±0.88  8.86±0.90  10.36±1.10
均值4  7.03±0.58  8.54±0.75  7.61±0.81  10.23±2.01
极差 2.31±0.31  1.61±0.10  2.77±0.27  8.03±0.91
  注:1)1表示未稀释的Knop培养基,1/2,1/4和1/6分别代表Knop培养基被稀释2,4和6倍;2)每升培养基中加入
微量元素储藏液的体积.
图2 各因素不同水平与银叶真藓
原丝体净质量增加率均值的关系
图3 各因素不同水平与泥炭藓
配子托净质量增加率均值的关系
56第12期      姜 山,等:药用苔藓植物银叶真藓和泥炭藓组织培养基配方研究
3 讨 论
在离体培养条件下,不同植物由于其各自的遗传特性、生物学特征不一样,植物组织生长的营养要求
会随植物种类而变化,甚至同一植物不同部位的组织以及同一部位组织的不同生长阶段对营养的要求也不
同,因而选择适宜的培养基对植物组织培养尤为重要[17-19].
本实验研究了Knop培养基、酒石酸铵、微量元素和糖类对银叶真藓和泥炭藓生长的影响.研究结果
显示,不管是固体培养基还是液体培养基中,糖类对两种藓类植物生长的影响都是最大的,是影响它们生
长的主要因子.研究结果说明,作为培养基中主要碳源的糖类对苔藓植物生长有十分重要的作用.银叶真
藓固体或液体培养基中以及泥炭藓固体培养基中葡萄糖或蔗糖体积质量分数在第三水平时,银叶真藓的生
长状况最好,第四水平时生长状况出现下降的趋势,说明第三水平(5g/L)接近最佳体积质量分数.
Knop培养基体积质量分数对于银叶真藓配子托和原丝体生长的影响是仅次于糖类的因素.本实验结
果显示,液体培养基中用未经稀释的Knop培养基最有利于银叶真藓原丝体生长.银叶真藓和泥炭藓固体
培养基需用经稀释的Knop培养基,本实验结果显示稀释2倍的Knop培养基最有利于两种苔藓植物在固
体培养基上生长.
酒石酸铵体积质量分数对银叶真藓生长的影响要高于微量元素,它甚至比Knop培养基体积质量分数
对泥炭藓生长的影响还要大.文献报道[16]酒石酸铵对原丝体生长有影响,而本实验结果表明,它还对银叶
真藓和泥炭藓配子托的生长也有促进作用.
微量元素对两种苔藓植物生长的影响最小.当微量元素在第二水平(0.5mL)时,银叶真藓生长状况最
好,当达到第三和第四水平时,其生长状况反而有下降的趋势.而泥炭藓生长却需要更多微量元素.
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A Study on Tissue Culture Media of the Medicinal
Mosses Bryum argenteumand Sphagnum palustre L.
JIANG Shan, TIAN Xue-wu
School of Life Sciences,Guizhou Normal University,Guiyang 550001,China
Abstract:The influences of four factors(Knop medium,trace elements,carbohydrates and ammonium tar-
trate)on the growth of the gametophores of Bryum argenteumand Sphagnum palustre and of the proto-
nema of B.argenteumwere studied in an experiment of orthogonal design.Carbohydrates and their con-
centrations were shown to be the main influential factor.Glucose or sucrose with a concentration of about
5g/L was most favorable to the growth of the two mosses.The undiluted Knop medium was optimum for
the growth of B.argenteumprotonema in the liquid medium,and the double-diluted Knop medium was
optimum for gametophore growth of the two mosses on solid medium.Ammonium tartrate was another
important factor,and its influence on gametophore growth of S.palustr was second just to that of carbo-
hydrates.
Key words:Bryum argenteum;Sphagnum palustre;tissue culture
责任编辑 夏 娟    
76第12期      姜 山,等:药用苔藓植物银叶真藓和泥炭藓组织培养基配方研究