全 文 ：正交设计法在刺叶墙藓原代组织培养中的应用
玄雪梅 ,王艳 ,蔡伟民＊(上海交通大学环境科学与工程学院 ,上海 200240)
摘要:以从新疆采集的刺叶墙藓(Tortula desertorum)为研究对象 , 采用正交实验设计法对刺叶墙藓的原代组织培养基进行了
筛选。从而找出最佳的培养基配方为:Hogland + 2.25×10-7mg/ L 6-BA+0.5mg/ L NAA+1.73×10-5mg/L GA3+0.5mg/ L 2 , 4-
D+0.1%葡萄糖+1%琼脂。
关键词:刺叶墙藓;正交设计;基质;荒漠藓种;生物结皮
中图分类号:Q943.1　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2004)03-0032-02
收稿日期:2003-11-04;修回日期:2004-11-28
作者简介:玄雪梅(1978-),女 ,在读硕士生 ,专业方向:苔藓植物繁殖
生物学;＊通信联系人:蔡伟民(1946-),男 , 博士生导师 ,教授, 从事
荒漠化治理 、噪声污染处理 、光催化剂方面研究 ,E-mail:junzhu1216@
yahoo.com.cn ,Tel:021-54747359。
在苔藓植物的组织培养工作中 , 培养基的组成具有十分重要
的作用。选择培养基最佳组成时 , 除了可以参考和借鉴以前
的工作经验以外 , 往往要依靠大量实验进行筛选[ 1] 。这不仅
费时费力 ,而且筛选出来的组合常常不能代表最佳组合 , 因而
带有一定的盲目性。正交设计法可用最少的处理组合数研究
较多的实验因素 , 已在农业研究中广泛应用[ 2] 。本实验以新
疆的刺叶墙藓为研究对象 ,采用正交设计法 , 对其原代组织培
养的培养基进行了优化筛选。
新疆维吾尔自治区是我国最大的省区 , 面积约 165×104
km2 ,占全国总面积的 1/ 6 , 属于典型的干旱和半干旱气候[ 3] 。
苔藓植物是高等植物中的水生向陆地过渡的重要门类 ,
全世界约有 23000 种[ 4] ,在自然界的环保过程中和生物圈中扮
演着必不可缺的角色[ 5] 。特别是荒漠苔藓作为环境演替过程
中主要的先锋植物 ,参与土壤生物结皮的形成 , 在防沙 、固沙 、
沙漠化土壤生态修复和生态小环境的改善中发挥着不可替代
的作用[ 6] ,显示出其独特的生物多样性。本实验所研究的刺
叶墙藓就属于一种荒漠藓种 , 因此找出它的最佳培养基组合
对于它的大量扩繁及后续实验的进行具有不可忽视的作用。
1　材料与方法
1.1　材料:刺叶墙藓(Tortula desertorum)采自新疆古尔班通古
特地区。
1.2　试剂
药品名称 生产商 配制浓度(g/500ml)
取用(ml/
1000ml)
KH2PO4 上海试剂一厂 9 10
Ca(NO3)·4H2O 上海通亚精细化工厂 5.5 10
MgSO4·7H2O 兴塔化工厂 7 10
KNO3 上海试剂一厂 0.5 11
H3BO3 上海试剂一厂 2.86
MnSO4·H2O 上海金山区兴塔美兴化工厂 1.54 0.5
(原兴塔化工厂)
ZnSO4·7H2O 金山化工厂 0.23
CuSO4·5H2O 上海试剂一厂 0.07
Na2C10H14O8N2·2H2O 上海稼丰园艺用品有限公司 1.34 1
(EDTA·2H2O) (注:先将 EDTA溶解
FeSO4·7H2O) 上海山海工学团实验二厂 0.99 后加热再加入
FeSO4·7H2O)
　　将以上母液灭菌(20～ 40min ,压力 0.105 ～ 0.14 ,温度 121 ～ 126℃)后贮存在 4℃冰箱
中 ,用时按上表配置 ,调 pH值 6 ～ 7后 ,加入琼脂 10g/1000ml ,灭菌锅灭菌 15min。
吐温—80 上海化学试剂公司
次氯酸钠 上海化学试剂公司
琼脂粉 Sanland International Inc
　　注:以上试剂均为分析纯
1.3　实验方法
外植体用吐温-80 和次氯酸钠消毒后用无菌水洗 5 ～ 6
次[ 7] 。培养基选用 Hoagland 为基本培养基 , 置于 RXZ-300B
型培养箱培养(宁波江南仪器厂)参试因子选择 6-BA、NAA 、
GA3 、2 , 4-D和葡萄糖五个因子。正交表选用 4 个水平的 L16
(45),设置 2 次重复 ,表头设计和各因子水平参见表 1[ 8] 。
2　结果与分析
不同生长物质对刺叶墙藓原代培养的影响的正交设计实
验结果见表 1。
表 1　新疆刺叶墙藓原代培养基的正交设计及直观分析
Table 1　The Orthogonal Design and Visualized Analysis of Tortula desertorum
组合
因素
A
6-BA
B
NAA
C
GA3
D
2, 4-D
E
葡萄糖
相对分枝比率
Ⅰ Ⅱ ∑ X
1 1(2.25×10-7mg/ l) 1(0.2mg/ l) 1(1.73×10-5mg/ l) 1(0.2mg/ l) 1(0.1%) 1.0 0.6 1.6
2 1 2(0.5mg/ l) 2(3.46×10-5mg/ l) 2(0.5mg/ l) 2(0.4%) 0.75 0.5 1.25
3 1 3(0.7mg/ l) 3(1.38×10-4mg/ l) 3(0.7mg/ l) 3(0.7% 0 0 0
4 1 4(0) 4(0) 4(0) 4(0) 0.33 1.0 1.33
5 2(1.13×10-6mg/ l) 1 2 3 4 0 0.33 0.33
6 2 2 1 4 3 0 0.5 0.5
7 2 3 4 1 2 0.33 0.33 0.66
8 2 4 3 2 1 0.4 0.67 1.07
9 3(1.58×10-6mg/ l) 1 3 4 2 0.2 0 0.2
10 3 2 4 3 1 0.375 0.75 1.125
11 3 3 1 2 4 1.0 1.0 2.0
12 3 4 2 1 3 0 0.2 0.2
13 4(0) 1 4 2 3 0.2 0 0.2
14 4 2 3 1 4 1.0 0.33 1.33
15 4 3 2 4 1 0.67 0.67 1.34
16 4 4 1 3 2 0.25 0.25 0.50
T1 4.18＊ 2.33 4.60＊ 3.79 5.14＊ 6.505 7.13 13.635
T2 2.56 4.03＊ 3.12 4.52＊ 2.61
T3 3.53 4.00 2.60 1.96 0.90
T4 3.37 3.10 3.32 4.24 4.99
R 1.62 1.70 2.00 2.56 4.24
　　注:1)相对分枝比率是指产生新分枝的原代植株数占接种植株数的
百分比;2)＊最佳水平的相对分枝比率总和;3)以上数据为培养 15d时
统计;4)培养条件为 5(8h)～ 15℃(16h),湿度 85%;5)表中数据计算参
见文献[ 9] 。
表 2　相对分枝比率方差分析
Table 2　Variance Analysis of Relative Ramous Ratio
变异来源 自由度 平方和 均方 F F0.05 F0.01
A 3 0.17 0.06 1.00 3.29 5.42
B 3 0.10 0.03 0.50 3.29 5.42
C 3 0.24 0.08 1.33 3.29 5.42
D 3 1.27 0.42 7.00 3.29 5.42
E 3 1.56 0.52 8.67 3.29 5.42
实验误差 15 0.91 0.06
表 3　相对分枝比率的比较
Table 3　Comparison of Relative Ramous Ratio
水平 6-BA NAA GA3 2 , 4-D 葡萄糖
1 0.52 0.29 0.58 0.47 0.64
2 0.32 0.50 0.39 0.57 0.33
3 0.44 0.50 0.33 0.25 0.11
4 0.42 0.39 0.42 0.53 0.62
极差 0.20 0.21 0.25 0.32 0.53
　　经直观分析表明 , 五种因子对刺叶墙藓产生新分枝数效
应的大小 , 依次是葡萄糖>2 , 4-D>GA3>NAA>6-BA。 经
方差分析表明 , 除NAA、GA3 和 6-BA 未达到显著水平外 , 其
它因子(2 , 4-D和葡萄糖)都达到了 F0.01的极显著水平(见表
2)。可见 ,葡萄糖和 2 , 4-D是影响藓株产生新分枝的主要因
子。葡萄糖浓度过高和过低都不利于藓株产生新分枝 , 浓度
为 0.1%时的相对分枝比率为 0.64 , 分别是浓度为 0 、0.4%、
0.7%时的 1.03 、1.94 和 5.82 倍 , 四种水平的平均相对分枝率
的极差为 0.53(见表 3);2 , 4-D浓度为 0.5mg/ l时的平均相对
分枝率最高 , 为 0.57 , 其四种水平的平均相对分枝率的极差为
0.32。可见适宜浓度的葡萄糖和 2 , 4-D 有利藓株产生新分
枝。但是 GA3、NAA 和 6-BA 均未达到显著水平 , 可见 GA3 的
浓度在 0～ 1.38×10-4mg/ l时 , NAA的浓度在 0～ 0.2mg/ l时 , 6
-BA的浓度在 0 ～ 1.58×10-6mg/ l时 , 对刺叶墙藓产生新分
枝的影响并不显著。 五种因子的最佳水平组合应 为
A1B2C1D2E1(2.25×10-7mg/L 6-BA、0.5mg/ L NAA、1.73×10-5
mg/L GA3、0.5mg/ L 2 , 4-D和 0.1%葡萄糖)。
4　讨论国内已有将正交设计实验法应用于植物组织培养的报
道[ 10-13] 。有关作者一致认为 ,正交设计法是选择最佳实验方
案的十分有效的工具 , 其优越性在于能省时省力。但是正交
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生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
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DOI :10.16519/j.cnki.1004-311x.2004.03.017
设计在苔藓植物培养中的应用在国内外还均未见报道。
　　由于参照了前期实验所得到的数据 , 因此对参试因子和
实验水平范围的选择是适宜的不过影响苔藓组织培养的条件
错综复杂 ,正交实验设计是在特定条件下进行的 , 因此所筛选
出的培养基还有待于进一步实验检验。
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东北梅花鹿再生茸之胆固醇 、神经磷脂 、脑磷脂定性研究
赫俊峰1 ,朱世兵1 ,刘应竹1 ,王健飞2(1.黑龙江省科学院自然资源研究所 , 黑龙江 哈尔滨 , 150040;2.黑龙江省国际工程咨询公司 , 黑龙江 哈尔滨 , 150040)
摘要:为了弄清楚东北梅花鹿再生茸中是否含有胆固醇 、神经磷脂 、脑磷脂 ,将制得的东北梅花鹿再生茸精用萃取 、离心 、薄
层层析法(TLC)等方法进行其成分鉴定。经过乙醚 、乙醇(50%)的萃取 、过滤和沉淀 , 三次薄层层析法 , 实验证明:东北梅花鹿再
生茸和头茬茸一致 ,均含有此三种物质。
关键词:东北梅花鹿;胆固醇;神经磷脂;脑磷脂;萃取
中图分类号:Q593　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2004)03-0033-02
收稿日期:2003-01-10;修回日期:2003-03-21
作者简介:赫俊峰(1962-),男 ,副研究员 ,从事野生动物保护与利用
方面研究 ,主持国家 、省级项目 10余项 ,已发表论文 20余篇。
　　鹿茸是我国传统名贵中药材 , 被列为“东北三宝”之首 , 誉
满全球。鹿全身都是宝 , 除了鹿茸外 , 还有大量的副产品 , 如
鹿鞭 、鹿血 、鹿胎 、鹿筋 、鹿肉 、鹿皮等都具有不同的营养滋补
作用和药理作用。具有壮肾阳 ,益精血 , 强筋骨 ,调冲任 , 托疮
毒等作用[ 1] 。自 1987年以来 , 我国仅鹿茸一项 , 年创产值约 5
亿元。加强这方面的研究对我国的养鹿业的快速发展有较大
的推动作用。
在鹿茸中 ,无论头茬茸还是再生茸 ,其化学成分与鹿茸角
的生长发育及其调控都有密切的关系[ 5] 。作者对东北梅花鹿
再生茸增质增量进行了三年多的研究 , 同时也分析研究了再
生茸的各种化学成分 ,为以后鹿茸产品方面的开发研究打下
了坚实的基础。
1　材料与方法
1.1　仪器与试剂
OS101—1电动鼓风电热干燥箱(重庆银河试验仪器公
司), 粉碎机(河北民用机械总厂生产),离心机(上海安葶 TD—
40)、乙醇(AR)、乙醚(AR)、丙酮(AR)、氢氧化钠(AR)。
1.2　供试品
东北梅花鹿(Cervus Nippon hortulorun , Swinchone 1864)再生
茸一付 ,采自黑龙江省海林市林海鹿业有限公司 , 粉碎制成再
生鹿茸精。
1.3　方法
1.3.1　萃取流程:取东北梅花鹿的再生茸一枝 , 整枝粉碎 , 并
分别经过 50%乙醇和水提制 , 用乙醇脱蛋白 , 制成实验东北梅
花鹿再生茸精。然后再进行如下流程萃取分离 , 并分别获得
各个分析单元 ,进行定性分析研究[ 4] 。
1.3.2　取再生茸精 50ml ,用乙醚反复萃取 5 次 ,每次 15 ml , 得
到残渣和乙醚液 ,然后分两步进行实验分析:
1.3.2.1　用热乙醇反复提取残渣5 次 , 经过过滤去掉残渣 , 得
到乙醇液 ,将所得乙醇液加热挥发去乙醇 , 再用热丙酮提取 ,
去掉丙酮液 ,留下残渣 , 加入热的乙醇溶液溶解 ,得到乙醇液 ,
浓缩加乙醚 , 出现沉淀 , 用乙醚洗沉淀 , 就可以得到白色粉末
状物质[ D] 。
1.3.2.2　将乙醚液挥发去乙醚后加丙酮提取 ,这样反复操作
5 次 ,每次用量 15ml ,得到丙酮液[ A] 和残渣 , 过滤后再用残渣
进行实验 , 用乙醇提取残渣 5 次 , 每次 15ml , 过滤后在残渣中
加水缓慢溶解 ,得到乳化液[ C] ;将乙醇液挥发去掉乙醇得到
残渣 , 然后用乙醚提取残渣 , 将提取液浓缩后加入冷的丙酮 ,
这时得到了絮状沉淀 , 然后经过离心 , 自然风干 ,沉淀变为白
色蜡状物质[ B] 。
2　定性分析
2.1　胆固醇的定性分析:
2.1.1　取流程中丙酮提取液[ A] 2ml , 挥发去丙酮 , 加醋酸溶
液 , 再加浓硫酸 2～ 3滴 , 在交界面出现红色环。
2.1.2　取流程中丙酮提取液[ A] 2ml , 挥发去丙酮 , 加乙醇浓硫
酸(1:1)混合液 1ml , 交界面出现绿色荧光。
2.1.3　取流程中丙酮提取液[ A] 2ml , 加三氯醋酸溶液 , 呈现
出棕红色。
2.1.4　取流程中丙酮提取液[ A] , 挥发去丙酮进行薄层层析
检查 , 其色点和 Rf值均与标准胆固醇完全相同。
2.2　总磷脂的定性分析
根据文献报道 , 东北梅花鹿的头茬茸中含有总磷脂[ 6] 。
作者对东北梅花鹿再生茸成分进行了定性分析 ,分析结果显
示再生茸的化学成分中也含有神经磷脂和脑磷脂这两种物
质。
2.2.1　神经磷脂
取流程中[ D] 水乳化液 5ml ,加 10%NaOH , 产生碱性气体 ,
可使试管口的红色石蕊试纸变蓝 , 并得到水溶液。取水溶液
用浓硝酸酸化后加钼酸铵 , 可生成黄色沉淀 , 这也是磷酸根反
应 , 反应式为:
C21H33O6NPR+NaOH※Na3PO4+C19H28O3N+C5H15ON +
RCOONa
C5O2H15※C2O2H6+C3H9N←
三甲胺具有挥发性 , 有鱼腥味 , 碱性 , 可使红色石蕊试纸
变蓝[ 2] 。磷酸盐在酸性条件下 , 与钼酸铵反应生成黄色磷钼
酸铵沉淀。反应式如下:
H3PO4+12NH4MoO4+21HNO3 ※(NH4)3PO4·12MoO4↑+
12NH4NO3+12H2O
此外 ,再取流程中白色粉末状分离物质[ D] , 制成水乳液
进行薄层层析 , 与标准品神经磷脂进行对比 , 结果分离物层析
的色点及 Rf值与标准品完全相同。
2.2.2　脑磷脂
脑磷脂是磷脂酰乙醇胺的习惯名称 , 是动植物含量最丰
富的磷脂 , 与血液凝结有关。脑磷脂为白色蜡状固体 , 不易溶
于无水丙酮 , 可溶于含有少量水的多数非极性溶剂中。用氯
仿———甲醇混合溶剂很容易从组织 、细胞中将脑磷脂提取出
来。通过以下四个试验来检验再生茸中是否含有脑磷脂。
2.2.2.1　流程中白色蜡状分离物[ B] 与空气接触不久即变成
黄色 , 稍久则成褐色 ,这与甘油磷脂中不饱和脂肪酸遇空气氧
化变褐性质相互 , 说明此白色蜡状物中含有不饱和脂肪酸。
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