全 文 ：深圳塘朗山桫椤孑遗种群的遗传分化研究
苏应娟 , 王 艇 , 李雪雁 , 陈国培 , 江 宇 , 欧阳蒲月 , 郑 博
(中山大学生命科学学院 , 广东 广州 510275)
摘 要:应用 RAPD标记分析了深圳塘朗山桫椤孑遗种群全部 57 个个体的遗传变异和进化关系。 50 个引物共
检测到 171个位点 , 其中多态位点 10 个 , 多态位点比率 5.85%。基于基因频率的 Shannon 多样性指数平均值为
0.016 5 , Nei基因多样度指数平均值为 0.009 4 , 表明该种群的遗传多样性水平极低。对 Jaccard 相似性系数矩阵
用UPGMA法进行聚类分析显示 , 57 个个体可分为 4个亚群。 RAPD谱带表型的主成分分析 (PCA)支持聚类分析
结果。根据研究结果讨论了种群的管理和保护策略。
关键词:桫椤;种群;RAPD标记;遗传变异
中图分类号:Q941;Q948 文献标识码:A 文章编号:0529-6579 (2003)06-0069-04
桫椤 Alsophila spinulosa (Hook.)Tryon 俗名树
蕨 , 是著名的孑遗植物。在距今约 1.8亿年前的中
生代侏罗纪曾经十分繁盛 , 但由于第四纪冰川的侵
袭 , 种群遭到极大破坏 , 分布范围急剧缩小[ 1] 。现
在桫椤主要分布在热带亚热带静风 、高湿和荫蔽的
山地林中 , 幸存的种群和个体数量十分有限 , 已被
列为国家一级保护植物。近些年由于经济利益的驱
动 , 桫椤所受到的威胁日深 , 不少种群濒于灭绝 ,
如何拯救这一具重要科研价值的古老孑遗植物已成
为许多人关心的课题 。
随机扩增多态性 DNA (RAPD)技术经常被用
于分析种群的遗传变异。该技术对珍稀濒危物种的
研究具有一些潜在优势 , 它方法简捷 、 所费相对便
宜而且可以检测到大量的多态位点 , 这对分析遗传
变异水平较低的物种很有意义 。然而 , RAPD也有
带型可重复性欠佳的不足 。此问题可以通过反应条
件的预研究得到较好控制。另外 , RAPD作为显性
标记在数据分析方面的困难也被 Stewart和 Excoffier
提出的方法较好地解决[ 2] 。
在深圳西部的塘朗山发现有天然的桫椤孑遗种
群 , 个体数目仅残存 57个。该种群同分布于广东
境内的其他桫椤种群在地理位置上偏于孤立 , 其生
境正被不断侵蚀 , 研究种群的遗传变异 , 以期为保
护管理奠定基础已显得十分迫切。本文运用 RAPD
标记以这一种群的所有个体为材料对它们的遗传分
化进行了分析。
1 材料和方法
1.1 实验材料
在深圳西部的塘朗山 , 桫椤仅见于沟谷南坡 ,
沿小溪生长 , 范围 100 m 内 , 共 57 个个体。植株
高度为 0.20 ～ 2.10 m , 胸围 10 ～ 56 cm 。本研究采
摘该种群所有 57个个体的新鲜叶片。于-20 ℃保
存 。
1.2 DNA提取
采用改进的十六烷基三甲基溴化胺 (CTAB)
法[ 3] 。测定紫外光吸收以确定 DNA 浓度和纯度 ,
琼脂糖凝胶电泳检查 DNA完整性 。
1.3 引物的筛选
从上海生工公司合成的 167个 10碱基随机寡
核苷酸引物中筛选出 50 个扩增产物稳定 、 重复性
好的引物进行 RAPD扩增。引物序列见表 1。
1.4 RAPD扩增与检测
经预实验优化条件后确定反应体系为:总体积
25μL , 其中 10×PCR buffer (500 mmol L KCl , 100
mmol L Tris_HCl , φ=1.0%Triton X_100 , 20 mmol L
MgCl2)2.5 μL , 引物 (1.5 μmol L)0.3 μL , dNTP
(0.2 mmol L)0.5 μL , 模板 1 μL (70 ng), Taq 酶
0.5μL (0.5U), 反应混合物用 20 μL石蜡油覆盖。
扩增条件:94 ℃200 s预变性;94 ℃ 60 s , 36 ℃
60 s;72 ℃ 120 s , 40 个循环;72 ℃延伸 10 min。
所有反应在 Gene Amp PCR System 2400 (Perkin
收稿日期:2002-12-25
基金项目:国家自然科学基金资助项目 (30170101);国家自然科学基金重点资助项目 (39830310);广东省自然科学
基金资助项目 (011125)
作者简介:苏应娟 (1965年生), 女 , 副教授;E_mail:ls97@zsu.edu.cn
第 42 卷 第 6 期
2003年 11 月
中山大学学报 (自然科学版)
ACTA SCIENTIARUM NATURALIUM UNIVERSITATIS SUNYATSENI
Vol.42 No.6
Nov. 2003
Elmer Corporation)上进行 。扩增产物经 w =1.5%
的琼脂糖凝胶电泳检测 , 紫外灯下观察 、照相。
表1 RAPD分析的随机引物及序列
Tab.1 Random oligonucleotide primers
and sequences for RAPD analysis
引物 序列(5′※3′) 引物 序列(5′※3′)
S2 TGATCCCTGC S382 TGGGCGTCAA
S5 TGCGCCCTTC S404 GGCGGTTGTC
S17 AGGGAACGAG S405 GGGAACGTGT
S57 TTTCCCACGG S423 GGTACTCCCC
S71 AAAGCTGCGG S428 ACCTCAGCTC
S73 AAGCCTCGTC S451 GACAGGAGGT
S77 TTCCCCCCAG S456 TCGGCGGTTC
S85 CTGAGACGGA S463 CTGATACGCC
S90 AGGGCCGTCT S487 CCCCGATGGT
S91 TGCCCGTCGT S492 AGTAGGGCAC
S103 AGACGTCCAC S504 CCCGTAGCAC
S106 ACGCATCGCA S507 ACTGGCCTGA
S120 GGGAGACATC S511 GTAGCCGTCT
S121 ACGGATCCTG S1017 CAGTGGGGAG
S134 TGCTGCAGGT S1178 GTCGTCGACA
S145 TCAGGGAGGT S1192 CAGCTCCTGT
S152 TTATCGCCCC S1273 CCAAGCACAC
S182 CCTCTGACTG S1299 CTCGATCACC
S194 AAAGGGGTCC S1340 ACACTCGGCA
S236 ACACCCCACA S1349 CCGATCCAAC
S312 TCGCCAGCCA S1360 TCATTCGCCC
S314 ACAGGTGCTG S2012 GTTGGGCAC
S320 CCCAGCTAGA S2018 CTCGGATGTC
S359 GGACACCACT S2061 TCACTCGCTC
S378 CCTAGTCGAG S2101 GGAGCTGACT
1.5 数据分析
在某一特定位点上 , 若扩增片段出现的频率小
于0.99 , 则此位点称为多态位点 。多态位点比率
即在所有检测位点中多态位点所占的比例。
将每个 RAPD扩增条带视为具有两个等位基因
(1和 0)的复等位基因位点 , 求算基因频率矩阵 ,
利用 PopGen32软件计算基于基因频率的 Shannon多
样性 、观测等位基因数 、 有效等位基因数 、 基因多
样度指数 。
应用NTSYSpc2软件 , 选择 UPGMA法对 Jaccard
相似性系数进行聚类分析;对 RAPD表型数据矩阵
进行主成分分析 (PCA)。
2 结 果
用50个随机引物对深圳塘朗山桫椤种群 57个
个体的基因组 DNA进行的 RAPD分析显示 , 每个
引物测到的位点数在 1 ～ 7个之间 , 扩增片段长度
介于 300 ～ 3 000 bp。50个引物共检测到 171 个位
点 , 平均每个引物检测到的位点数为 3.42。50 个
引物中 , 有 5 个引物 S314 、 S405 、 S456 、 S463 和
S2061分别检测到 1 、 2 、 1 、 4和 2个多态性位点 ,
多态位点比率5.85%。
基于基因频率的 Shannon 多样性指数结果显
示 , 各引物扩增结果估算出的值在0 ～ 0.276 5之间
变动 , 平均值为 0.016 5。Nei基因多样性估测结果
见表2 , 基因多样度指数平均为 0.009 4。
对 Jaccard相似性系数用 UPGMA法进行聚类分
析的结果表明 , 桫椤塘朗山种群的 57个个体可分
为 4个分支 (图2);sz18 、 sz44与 sz45各构成一个
亚群 , sz37 、 sz02 、 sz09 、 sz14 、 sz25 、 sz41 、 sz55和
sz57共 8 个个体构成一亚群 , 其余的 46个个体组
成一个亚群 。亚群之间有 97.41%～ 99.20%的相似
性;而亚群内个体 间的相似性 为 99.33% ～
99.90%。图 3是依据提取的前 3个主成分获得的 3
-D分布图 , 显示了个体间相似性的格局 。基于
RAPD谱带表型的主成分分析 (PCA)支持 UPGMA
聚类结果。
图 1 用引物 S1340 对桫椤个体 (1-11)
扩增出的 RAPD带型 , M(100 bp ladder marker)
Fig.1 RAPD pattern amplified from individuals(1-11)
of Alsophila spinulosa by the primer S1340
图 2 桫椤种群 57 个个体 Jaccard
相似性系数矩阵经 UPGMA 法构建的树系图
Fig.2 Dendrogram generated from Jaccard
similarity coefficient matrix of 57 individuals
in Alsophila spinulosa population by using UPGMA method
70 中山大学学报 (自然科学版) 第 42 卷
表 2 桫椤种群的基因多样性
Tab.2 Gene diversity of Alsophila spinulosa population
引物 平均观察等位基因数
平均有效
等位基因数
基因多样
度指数 引物
平均观察
等位基因数
平均有效
等位基因数
基因多样
度指数
S2 1.0000 1.0000 0.0000 S382 1.0000 1.0000 0.0000
S5 1.0000 1.0000 0.0000 S404 1.0000 1.0000 0.0000
S17 1.0000 1.0000 0.0000 S405 1.2857 1.0280 0.0241
S57 1.0000 1.0000 0.0000 S423 1.0000 1.0000 0.0000
S71 1.0000 1.0000 0.0000 S428 1.0000 1.0000 0.0000
S73 1.0000 1.0000 0.0000 S451 1.0000 1.0000 0.0000
S77 1.0000 1.0000 0.0000 S456 1.5000 1.1492 0.1149
S85 1.0000 1.0000 0.0000 S463 1.6667 1.1989 0.1532
S90 1.0000 1.0000 0.0000 S487 1.0000 1.0000 0.0000
S91 1.0000 1.0000 0.0000 S492 1.0000 1.0000 0.0000
S103 1.0000 1.0000 0.0000 S504 1.0000 1.0000 0.0000
S106 1.0000 1.0000 0.0000 S507 1.0000 .0000 0.0000
S120 1.0000 1.0000 0.0000 S511 1.0000 1.0000 0.0000
S121 1.0000 1.0000 0.0000 S1017 1.0000 1.0000 0.0000
S134 1.0000 1.0000 0.0000 S1178 1.0000 1.0000 0.0000
S145 1.0000 1.0000 0.0000 S1192 1.0000 1.0000 0.0000
S152 1.0000 1.0000 0.0000 S1273 1.0000 1.0000 0.0000
S182 1.0000 1.0000 0.0000 S1299 1.0000 1.0000 0.0000
S194 1.0000 1.0000 0.0000 S1340 1.0000 1.0000 0.0000
S236 1.0000 1.0000 0.0000 S1349 1.0000 1.0000 0.0000
S312 1.0000 1.0000 0.0000 S1360 1.0000 1.0000 0.0000
S314 1.3333 1.0059 0.0058 S2012 1.0000 1.0000 0.0000
S320 1.0000 1.0000 0.0000 S2018 1.0000 1.0000 0.0000
S359 1.0000 1.0000 0.0000 S2061 1.3333 1.0557 0.0441
S378 1.0000 1.0000 0.0000 S2101 1.0000 1.0000 0.0000
Ave. 1.0585 1.0119 0.0094
图3 基于 RAPD表型特征的主成分分析 (PCA)
Fig.3 Principal components analysis(PCA)
based on RAPD phenetic characters
3 讨 论
利用酶电泳研究陆生和附生蕨类植物天然种群
的遗传多样性已有一些报道。但是 ,将基于 PCR技
术的分子标记用于蕨类种群的工作却还极为有限 。
Schneller等对远地鳞毛蕨 Dryopteris remota 种群的
RAPD研究发现 ,分子手段可以检测到更多的遗传
变异位点 ,从而提供等位酶无法揭示的种群遗传学
信息[ 4] 。在本研究中 ,我们运用 RAPD技术定量分
析了深圳塘朗山桫椤孑遗种群全部 57 个个体的遗
传变异和进化关系 。该种群基于基因频率的
Shannon指数平均为 0.016 5 ,Nei基因多样度指数平
均为 0.009 4 ,大约只有其他蕨类植物种群相应值的
7%～ 10%和 7%～ 12%[ 5 , 6] ;反映出此孑遗种群的遗
传多样性水平极低 。桫椤种群在遭受第四纪冰川的
严重侵袭后 , “瓶颈效应”(bottleneck effect)和“建群
者效应”(founder effct)可能是导致其遗传变异水平
低下的主要原因。被片段化的种群由于遗传漂变和
缺乏有效基因流致使种群内的遗传分化程度降低 ,
这种现象在孑遗植物中并不罕见。应用 RAPD分析
鳞茎虎耳草 Saxifraga cernua 的孑遗种群 ,无论是种
群内还是同地区的种群间都检测不到遗传变异的存
在[ 7] 。对孑遗植物美加红松 Pinus resinosa 的研究也
没有发现遗传变异[ 8] 。至于桫椤孑遗种群极低的遗
71 第 6 期 苏应娟等:深圳塘朗山桫椤孑遗种群的遗传分化研究
传多样性是否和其繁育系统有关 ,则还有待于进一
步的研究 。
作为起源古老的孑遗植物 ,桫椤保留的一些独
特生物学性质使它不能很好地适应现代气候条件和
环境 ,只能在极其有限的适宜生境中残存。例如 ,它
的孢子寿命短(仅有 7 ～ 8 d),而且萌发条件也极为
苛刻;从孢子萌发到幼孢子体形成生活周期长达一
年以上 ,其间丝状体和原叶体缺乏保护性结构 ,极易
被恶劣环境因子伤害;孢子萌发 、配子体和胚胎的形
成对生境要求非常严格;此外 ,它无发达根系 ,输导
系统也较原始[ 9 , 10] 。种群遗传分化的研究能为深圳
塘朗山野生桫椤的管理和保护提供重要的理论依
据。根据 57个个体进化关系的聚类分析结果和主
成分分析提供的遗传相似性分布格局 ,我们认为在
资源和经费有限时 ,应首先对 sz07 、sz18 、sz24 、sz37 、
sz44 、sz45和 sz54等 7个个体进行重点拯救 ,在此基
础上也对其余的 50个个体予以保护。
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Studies on the Genetic Differentiation of a Relict Population of
Alsophila spinulosa in Tanglangshan Mountain , Shenzhen , China
SU Ying_juan , WANG Ting , LI Xue_yan , CHEN Guo_pei , JIANGYu ,
OUYANG Pu_yue , ZHENG Bo
(School of Life Sciences , Sun Yat_sen University , Guangzhou 510275 , China)
Abstract:RAPD markers were used to assess the genetic variations and the evolutionary relationships of all 57
individuals of a relict population of Alsophila spinulosa naturally grown in Tanglangshan mountain , Shenzhen , South
China.50 random primers detected 171 sites of which 10 ones were polymorphic , the percentage of polymorphic sites was
5.85%.Average values of index of Shannon diversity based on gene frequencies and Neis index of gene diversity were
0.016 5 and 0.009 4 , respectively , which demonstrated that the relict popuplation possesses very low level of genetic
diversity.Cluster analysis of the Jaccard coefficient matrix using UPGMA method revealed that 57 individuals were
clustered into 4 subpopulations which was also lent support from the spatial representation of principle components
analysis(PCA)of RAPD phenetic patterns.Management and protection strategy of the relict population was discussed
based on these results.
Key words:Alsophila spinulosa;population;RAPD markers;genetic variation
72 中山大学学报 (自然科学版) 第 42 卷