全 文 ：　 　ｗｗｗ．ｈｘｙｓｗｇｃ．ｃｏｍ　２０１６，Ｖｏｌ．３３Ｎｏ．０７化学与生物工程
　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
５２
基金项目：海南省自然科学基金资助项目（３１１４０６４，２０７５３０７３）
收稿日期：２０１６－０１－３１
作者简介：姚广龙（１９８５－），男，山东东阿人，讲师，研究方向：热带植物资源开发与利用；通讯作者：罗先群，副教授，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｕｏｘｑ３５
＠１６３．ｃｏｍ。
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－５４２５．２０１６．０７．０１２
姚广龙，李乐，邢炎慧，等．海南全缘褶萼苔内生真菌的分离及抑菌活性的初步研究［Ｊ］．化学与生物工程，２０１６，３３
（７）：５２－５４．
海南全缘褶萼苔内生真菌的分离及抑菌活性的初步研究
姚广龙，李　乐，邢炎慧，马凤菲，张莉娜，王新广，罗先群
（海南大学 海南优势资源化工材料应用技术教育部重点实验室，海南 海口５７０２２８）
摘　要：研究了海南全缘褶萼苔的表面消毒条件及其内生真菌 ＴＸ００３菌株发酵液的抑菌活性。结果表明，采用
７５％乙醇浸泡２ｍｉｎ，无菌水冲洗４次，再用５．０％次氯酸钠浸泡５ｍｉｎ，无菌水冲洗４次，是海南全缘褶萼苔表面消毒的
最佳条件。其内生真菌ＴＸ００３菌株发酵液具有广谱抑菌活性，对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单
胞菌、白色念珠菌抑菌圈直径分别达到１７ｍｍ、１６ｍｍ、１３ｍｍ、８ｍｍ、１１ｍｍ。海南全缘褶萼苔内生真菌ＴＸ００３可以产
生具有抑菌活性的次生代谢产物，为新型抗菌药物的筛选提供了新的途径。
关键词：全缘褶萼苔；内生真菌；分离；抑菌活性
中图分类号：Ｒ　９３１．１　　　　文献标识码：Ａ　　　　文章编号：１６７２－５４２５（２０１６）０７－００５２－０３
Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　Ｆｕｎｇｉ
ｆｒｏｍ　Ｈａｉｎａｎ　Ｐｌｉｃａｎｔｈｕｓ　ｂｉｒｍｅｎｓｉｓ（Ｓｔｅｐｈ．）Ｒ．Ｍ．Ｓｃｈｕｓｔ
ＹＡＯ　Ｇｕａｎｇ?ｌｏｎｇ，ＬＩ　Ｌｅ，ＸＩＮＧ　Ｙａｎ?ｈｕｉ，ＭＡ　Ｆｅｎｇ?ｆｅｉ，ＺＨＡＮＧ　Ｌｉ?ｎａ，ＷＡＮＧ　Ｘｉｎ?ｇｕａｎｇ，ＬＵＯ　Ｘｉａｎ?ｑｕｎ
（Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ
ｉｎ　Ｈａｉｎａｎ　Ｓｕｐｅｒｉｏｒ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｈａｉｎａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｉｋｏｕ５７０２２８，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｈａｉｎａｎ　Ｐｌｉｃａｎｔｈｕｓ　ｂｉｒｍｅｎｓｉｓ（Ｓｔｅｐｈ．）Ｒ．Ｍ．Ｓｃｈｕｓｔ　ａｎｄ　ａｎ－
ｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｆｕｎｇｉ　ＴＸ００３ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｒｏｔｈ　ｗｅｒｅ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ，
ｓｏａｋｅｄ　ｗｉｔｈ　７５％ｅｔｈａｎｏｌ　ｆｏｒ　２ｍｉｎ，ｗａｓｈｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｔｅｒｉｌｅ　ｗａｔｅｒ　ｆｏｒ　４ｔｉｍｅｓ，ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｓｏａｋｅｄ　ｗｉｔｈ　５．０％ ＮａＣｌＯ
ｆｏｒ　５ｍｉｎ，ｗａｓｈｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｔｅｒｉｌｅ　ｗａｔｅｒ　ｆｏｒ　４ｔｉｍｅｓ　ｗｅｒｅ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｈａｉｎａｎ
Ｐｌｉｃａｎｔｈｕｓ　ｂｉｒｍｅｎｓｉｓ（Ｓｔｅｐｈ．）Ｒ．Ｍ．Ｓｃｈｕｓｔ．Ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｒｏｔｈ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｆｕｎｇｉ　ＴＸ００３ｈａｄ　ｂｒｏａｄ－
ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｚｏｎｅ　ｄｉａｍｅｔｅｒｓ　ｏｆ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ，Ｓｔａｐｈｙ－
ｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　ｗａｓ　１７ｍｍ，１６ｍｍ，１３ｍｍ，８ｍｍ，１１ｍｍ，ｒｅｓｐｅｃ－
ｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｗｉｔｈ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｈａｉｎａｎ　Ｐｌｉｃａｎｔｈｕｓ　ｂｉｒｍｅｎ－
ｓｉｓ（Ｓｔｅｐｈ．）Ｒ．Ｍ．Ｓｃｈｕｓｔ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｆｕｎｇｉ　ＴＸ００３．Ｉｔ　ｐｒｏｖｉｄｅｓ　ａ　ｎｅｗ　ｗａｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｎｅｗ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ
ｄｒｕｇｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｌｉｃａｎｔｈｕｓ　ｂｉｒｍｅｎｓｉｓ（Ｓｔｅｐｈ．）Ｒ．Ｍ．Ｓｃｈｕｓｔ；ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ　ｆｕｎｇｉ；ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ；ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ
　　苔藓植物是植物界由水生向陆生过渡的高等植物
类群，从形态学上可分为苔纲 （Ｈｅｐａｔｉｃａｅ）、藓纲
（Ｍｕｓｃｉ）和角苔纲（Ａｎｔｈｏｅｅｒｏｔａｅ）３类。苔纲约有
５　０００种，藓纲约有１５　０００种，角苔纲有近１００种［１］。
为适应生存环境、保护自己，苔藓植物常能合成某些具
有细胞毒、抗菌等活性的次级代谢产物。所以，几乎所
姚广龙等：海南全缘褶萼苔内生真菌的分离及抑菌活性的初步研究／２０１６年第７期 　５３　
有苔藓都不被自然界各种动物和昆虫所摄食，也不被
细菌、真菌或病毒所感染。在研究苔藓植物化学成分
时发现，萜类、半萜类、联苄、双联苄、黄酮类化合物等
生物活性物质使苔藓植物具有抗细菌、抗真菌、抗病
毒、抗肿瘤、抗凝血等特性［２－５］。
苔藓内生真菌是一类能定殖在苔藓体内靠苔藓来
获取营养和保护却不对苔藓产生病害的微生物。２０
世纪末，研究者发现内生真菌能够产生与宿主相同或
相似的生物活性物质后，内生真菌的研究迅速成为热
点［６－７］。作者首次从海南全缘褶萼苔［Ｐｌｉｃａｎｔｈｕｓ　ｂｉｒ－
ｍｅｎｓｉｓ（Ｓｔｅｐｈ．）Ｒ．Ｍ．Ｓｃｈｕｓｔ］中分离出内生真菌，经
多次分离、纯化，筛选出内生真菌ＴＸ００３，对其发酵液
的抑菌活性进行了初步研究，旨在为海南苔藓植物内
生真菌资源的研究提供参考。
１　实验
１．１　材料与菌种
海南全缘褶萼苔，采自海南省乐东市尖峰岭国家
级自然保护区，经海南大学园林园艺学院老师鉴定，凭
证标本存放在海南大学生物工程系实验室。
枯草芽孢杆菌 （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、大肠杆菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、白色念珠菌（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）、
金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）、铜绿假单
胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ），由海南大学材料与
化工学院生物工程系实验室提供。
１．２　培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ＰＤＡ培养基）：取去皮
马铃薯２００ｇ切成块，煮沸０．５ｈ后纱布过滤，加入葡
萄糖２０ｇ、琼脂粉１５～２０ｇ，定容到１　０００ｍＬ，ｐＨ值
自然，于１２１℃灭菌２０ｍｉｎ。首次分离内生真菌时在
此培养基中加链霉素（５０Ｕ·ｍＬ－１）抑制细菌生长。
马铃薯葡萄糖液体培养基（ＰＤＢ培养基）：取去皮
马铃薯２００ｇ切成块，煮沸０．５ｈ后纱布过滤，加入葡
萄糖２０ｇ，定容到１　０００ｍＬ，ｐＨ值自然，于１２１℃灭
菌２０ｍｉｎ。
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏３ｇ，蛋白胨１０ｇ，
ＮａＣｌ　５ｇ，琼脂粉１５ｇ，定容至１　０００ｍＬ，ｐＨ值７．０～
７．２，１２１℃灭菌３０ｍｉｎ。
１．３　方法
１．３．１　海南全缘褶萼苔的表面消毒
除去海南全缘褶萼苔中枯枝和泥沙，洗洁精清洗
几遍，纯净水冲洗１ｈ，将全缘褶萼苔表面水分用无菌
纱布吸干，在超净工作台上进行全缘褶萼苔茎表面消
毒，用印迹法检验表面消毒效果。
具体过程如下：用７５％乙醇浸泡２ｍｉｎ，无菌水冲
洗４次；再用５．０％次氯酸钠溶液分别浸泡２～６ｍｉｎ，
无菌水漂洗４次，ＰＤＡ培养基上做印记，２８℃培养箱
中培养５ｄ，观察平板，若没有微生物长出，说明表面消
毒效果良好。
１．３．２　内生真菌的分离与纯化
无菌条件下，将表面消毒完全的全缘褶萼苔茎用
无菌纱布吸干水分，剪刀剪小后，置于无菌研钵中充分
研磨，无菌水稀释，稀释液涂布于ＰＤＡ 培养基上进行
内生菌的分离。长出真菌后，挑取其尖端部分移至新
的ＰＤＡ平板上，２８℃培养，经反复几次纯化后，即得
到全缘褶萼苔内生真菌纯培养物 ＴＸ００１、ＴＸ００２、
ＴＸ００３、ＴＸ００４、ＴＸ００５，于４℃冰箱保藏，备用。
１．３．３　内生真菌的发酵
将分离得到的ＴＸ００３内生真菌接种于ＰＤＢ培养
基中，２５０ｍＬ三角瓶装４０ｍＬ培养液，摇床振荡培养
（１８０ｒ·ｍｉｎ－１，２５℃）７ｄ。将培养物（发酵液和菌球）
从三角瓶中倒入培养皿，在５５℃鼓风干燥箱内烘干并
称量。研钵中研磨成细粉，以１∶１０（ｇ∶ｍＬ）的比例
３０℃下用丙酮浸渍１８ｈ，再用超声波提取发酵培养物
内的化学物质：温度５５℃，时间３０ｍｉｎ，功率３００Ｗ。
获得海南全缘褶萼苔内生真菌ＴＸ００３发酵液和菌球
的丙酮提取液。
１．４　抑菌活性评价［８］
采用双层圆形纸片扩散抑菌法评价抑菌活性。活
化受试菌，用接种环刮取一环受试菌于５ｍＬ无菌水
中，振荡摇匀，得菌悬液，用涂布棒将平板中的菌液涂
抹均匀。取经高压湿热灭菌过的直径为６ｍｍ的圆形
滤纸片浸渍丙酮提取液。两片滤纸重叠，分别紧贴在
涂布了细菌、真菌菌悬液的培养皿上。细菌３７℃恒温
培养１８～２４ｈ，真菌２８℃恒温培养４８～７２ｈ。测量
抑菌圈直径，做空白对照实验，３组平行样，取平均值。
２　结果与讨论
２．１　海南全缘褶萼苔表面消毒最佳条件
海南全缘褶萼苔表面消毒效果如表１所示。
由表１可知，海南全缘褶萼苔茎先用７５％乙醇浸
泡２ｍｉｎ，无菌水冲洗４次；再用５．０％次氯酸钠浸泡５
ｍｉｎ，无菌水冲洗４次，可达到表面完全灭菌，且对内
生菌破坏最小，为全缘褶萼苔的表面消毒最佳条件。
２．２　海南全缘褶萼苔内生真菌ＴＸ００３的抑菌活性
海南全缘褶萼苔内生真菌ＴＸ００３的抑菌活性筛
选结果见表２。
由表２可知，海南全缘褶萼苔内生真菌ＴＸ００３菌
　 姚广龙等：海南全缘褶萼苔内生真菌的分离及抑菌活性的初步研究／２０１６年第７期５４　
表１　 海南全缘褶萼苔表面消毒效果
Ｔａｂ．１　 Ｔｈｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ
Ｐｌｉｃａｎｔｈｕｓ　ｂｉｒｍｅｎｓｉｓ（Ｓｔｅｐｈ．）Ｒ．Ｍ．Ｓｃｈｕｓｔ
序号 消毒条件 消毒效果
１
７５％乙醇浸泡２ｍｉｎ，无菌水冲洗４次，
５．０％次氯酸钠浸泡２ｍｉｎ，无菌水冲洗４次
＋＋
２
７５％乙醇浸泡２ｍｉｎ，无菌水冲洗４次，
５．０％次氯酸钠浸泡３ｍｉｎ，无菌水冲洗４次
＋
３
７５％乙醇浸泡２ｍｉｎ，无菌水冲洗４次，
５．０％次氯酸钠浸泡４ｍｉｎ，无菌水冲洗４次
＋
４
７５％乙醇浸泡２ｍｉｎ，无菌水冲洗４次，
５．０％次氯酸钠浸泡５ｍｉｎ，无菌水冲洗４次
－
５
７５％乙醇浸泡２ｍｉｎ，无菌水冲洗４次，
５．０％次氯酸钠浸泡６ｍｉｎ，无菌水冲洗４次
－
注：“－”表示没有菌生长；“＋”表示有菌生长，但是生长速度慢；“＋＋”
表示菌生长得较好。
表２　 ＴＸ００３的抑菌活性筛选结果
Ｔａｂ．２　 Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ
ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ＴＸ００３
受试菌 抑菌圈直径／ｍｍ
枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ） １７
大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ） １６
金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ） １３
铜绿假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ） ８
白色念珠菌（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ） １１
株发酵液对５种受试菌（４种细菌、１种真菌）均有较好
的抑菌活性。由此可见，海南全缘褶萼苔内生真菌
ＴＸ００３在一些疾病的治疗中有明显的开发利用价值
和前景，为新型抗菌药物的筛选提供了新途径。
２．３　讨论
（１）目前从海南全缘褶萼苔分离内生真菌多采用
其茎部组织，可能是因为茎中含有丰富的营养物质，有
利于内生真菌的生长。
（２）金黄色葡萄球菌危害大，是一种常见的病原
菌，可引起多种严重感染，如心包炎、肺炎，甚至引发败
血症、脓毒症等全身感染。白色念珠菌常侵犯皮肤、粘
膜，也可引起内脏或全身感染。海南全缘褶萼苔内生
真菌ＴＸ００３菌株发酵液对金黄色葡萄球菌、白色念珠
菌都有良好的抑菌作用，有望作为人类抗感染药物资
源菌而进一步开发。
（３）海南全缘褶萼苔内生真菌ＴＸ００３菌株发酵液
对细菌及真菌的抑菌机制、抑菌活性成分及其化学结
构有待进一步研究。
３　结论
研究了海南全缘褶萼苔的表面消毒条件及其内生
真菌ＴＸ００３菌株发酵液的抑菌活性。结果表明，采用
７５％乙醇浸泡２ｍｉｎ，无菌水冲洗４次，再用５．０％次
氯酸钠浸泡５ｍｉｎ，无菌水冲洗４次，是海南全缘褶萼
苔表面消毒的最佳条件。其内生真菌ＴＸ００３菌株发
酵液具有广谱抑菌活性，对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌抑菌圈直
径分别达到１７ｍｍ、１６ｍｍ、１３ｍｍ、８ｍｍ、１１ｍｍ。
海南全缘褶萼苔内生真菌ＴＸ００３可以产生具有抑菌
活性的次生代谢产物，为新型抗菌药物的筛选提供了
新的途径。
参考文献：
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