全 文 ：·基础研究 ·
哈茨木霉发酵液中肽类物质对
豇豆土著根瘤菌竞争结瘤的影响＊
罗赫荣 1a, 梁志怀 3 , 魏　林 2, 3＊ , 魏宝阳 1b, 申爱荣 4
(1.湖南农业大学 a.生物安全科技学院;b.生物科学技术学院 , 湖南 长沙 410128;2.中南林业科技大学 ,
湖南 长沙 410004;3.湖南省植物保护研究所 , 湖南 长沙 410125;4.湖南林业科学院 , 湖南 长沙 410004)
摘　要:通过树脂吸附 、离子交换 、薄层层析 、高效液相色谱系统以及紫外 、质谱等分离 、纯化和鉴别的方法 , 从
哈茨木霉 T2-16菌株发酵液中分离得到一种对豆科作物生长具促进作用的肽类物质。用该肽类物质对豇豆土著
根瘤菌进行处理后 , 用 AFLP技术研究了该物质对供试根瘤菌遗传稳定性和在土壤中竞争结瘤能力的影响 。结
果表明 , 传代次数和培养温度(28 ℃ ～ 36℃范围)对供试根瘤菌的遗传性状无明显影响 ,其 AFLP指纹未发生明
显变化;但经木霉肽类代谢产物处理后 ,根瘤菌竞争结瘤能力得到提高 , 为对照根瘤菌的 1.53倍。
关键词:哈茨木霉;肽类物质;土著根瘤菌;竞争结瘤能力
中图分类号:Q935
文献标识码:A
文章编号:1007-7146(2008)03-0339-05
EffectsofPeptideintheFermentationLiquidofTrichodermaharzianumon
CompetitioninNodulationAbilityofCowpeaIndigenousRhizobium
LUOHe-rong1a, LIANGZhi-huai3 , WEILin2, 3＊ , WEIBAO-yang1b, SHENAi-rong4 ,
(1.HunanAgriculturalUniversitya.ColegeofBiologicalScienceandTechnology;b.ColegeofBiosience
andBiotechnology, Changsha410128, Hunan, China, 2.CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,
Changsha410004, Hunan, China, 3.HunanPlantProtectionResearchInstitute, Changsha410125,
Hunan, China, 4.HunanAcademyofForestrySciences, Changsha410004, Hunan, China)
Abstract:Variousmethodsincludingmultiplecolumnlayers, TLC, HLPC, UVandMSwereadoptedintheisolation,
purificationandidentificationofthegrowthpromotingsubstanceinthefermentedliquidofTrichodermaharzianumT2-
16.Thetestresultsuggestedthegrowthpromotingsubstancewasakindofpeptide.Then, theindigenousrhizobiumwas
treatedbythemetabolicproduct.Thehereditarycharacterandthenodulationcompetitionabilityweredeterminedby
AFLPfingerprintingmethodbetweenthetreatedstrainandcheckstrain.TheresultsshowedthatthevariationofAFLP
fingerprintingfortheexperimentalstrainscultivatedat28 ℃ aswelasthestrainsincubatedat37 ℃ inYEMmedium
for96 generationwasnotobvious.Meanwhile, thenodulationcompetitionratewas60.47 % forthetreatedstrain, and
thecheckstraincompetitionratewasonly39.53 %.
Keywords:Trichodermaharzianum;peptide;indigenousrhizobium;competitiveability
　　通过树脂吸附 、离子交换 、薄层层析 、高效液相 色谱系统以及紫外 、质谱等分离 、纯化和鉴别的方
第 17卷第 3期
2008年 6月 　　　　　　　　　　
激　光　生　物　学　报
ACTA　LASER　BIOLOGY　SINICA　　　　　　　　　　　Vol.17No.3Jun.2008
＊ 收稿日期:2007-06-28;修回日期:2008-01-12
基金项目:湖南省科技攻关重点项目(2006NK2017)
作者简介:罗赫荣(1956— )男 , 博士 , 主要从事农作物病害生物防治研究工作 。 (电话)0731-4691915
＊通讯作者:(电话)0731-4693299;(电子邮箱)weilincn@163.com
法 ,从哈茨木霉 T2-16菌株发酵液中分离得到一种对
豆科作物生长具促进作用的肽类物质 ,前期研究表
明 ,该活性物质可通过改变根瘤的形态 、结构如增加
根瘤侵染组织的面积和根瘤细胞中类菌体的数量 ,
降低根瘤细胞液泡化程度 ,促进根瘤中公共细胞周
膜较多形成 ,加快类菌体的发育成熟 ,提高根瘤豆血
红蛋白的含量 ,来提高根瘤的固氮活性 [ 1] 。但该物
质对土著根瘤菌自身竞争结瘤能力是否具有促进作
用 ,尚未见研究报道。本文应用 AFLP这一分子指纹
技术对此进行了研究。
1　实验材料
豇豆品种为 “特选 28-2” ,系江西省丰城市津南
区种子公司生产。
木霉菌及其肽类物质的制备:供试木霉菌株及
肽类代谢产物同参考文献 [ 1] 。
2　实验方法
2.1　供试豇豆原始土著根瘤菌菌株的获得
从田间自然条件下生长的初花期豇豆植株根系
上 ,摘取新鲜 、饱满 、个大的根瘤 ,参照 M.奥巴托的
方法进行分离 ,纯化培养后 ,进行回接实验 ,从形成
的根瘤中再次分离得到的根瘤菌 。其中培养根瘤菌
所用的培养基为 YEM,主要成分为磷酸氢二钾 ,硫酸
镁 ,氯化钠 ,甘露醇 ,酵母浸出液 [ 2] 。
2.2　根瘤菌出发菌株的处理
配制两种培养基 ,一为培养根瘤菌的 YEM液体
培养基;另一为含 0.01 %哈茨木霉肽类代谢产物的
YEM液体培养基 。将供试的土著根瘤菌分别接种于
两种培养基中 ,其中接种含木霉代谢产物培养基中
的菌株为 1-1;接种于不含木霉代谢产物培养基中的
菌株为 1-2。将接种后的菌株置于 28 ℃恒温摇床中
培养 60 h,再将培养液中的菌株在 YEM固体培养基
上进行划线培养 ,挑取各根瘤菌单菌落进行纯化培
养后作为种子菌 ,进行如下的实验 。
2.3　纯培养条件下豇豆土著根瘤菌 AFLP指纹图
谱稳定性测定
2.3.1　纯培养根瘤菌 DNA的提取　具体操作参
照文献 [ 3 ]的方法 ,并略有改动。获得的 DNA加入
50 μL1 ×TE缓冲液溶解 ,放入 -20 ℃冰箱中保存
备用。
2.3.2　传代次数对根瘤菌 AFLP指纹的影响　作
者研究表明供试豇豆根瘤菌的平均代时为 4 h。按
此代时将供试菌株 1-1、1-2分别接种到装有 5 mL的
YEM培养液的试管中 ,于 28 ℃、150 r/min条件下培
养 4 d, 获得第 24 代培养物。分别取 该培养物
0.5 mL菌液接种到另一支含 5 mLYEM培养液的试
管中 ,相同条件下培养 24 h。再分别取 0.5mL菌液
接种到另一支含 5 mLYEM培养液的试管。每天按
此方法转接培养 ,一共转接 11次 ,分别取第 24代 、
第 48代 、第 72代和第 96代的根瘤菌提取 DNA,进
行 AFLP分析 [ 4] 。
2.3.3　培养温度对供试菌株 AFLP指纹的影响　
将接种于含有 50 mLYEM培养液的三角瓶中的供试
土著根瘤菌菌株 ,分别于 28 ℃和 37 ℃两温度下 、
150 r/min条件下培养 4 d,再在相对应的温度下 ,对
菌液进行 15次转接培养后 ,提取供试菌株 DNA,进
行 AFLP分析 [ 4] 。
2.3.4　AFLP分析 　AFLP分析中的酶切连接及
PCR扩增反应液组成 、扩增反应的程序均按张小
平 [ 5] 、Vos[ 6]的方法进行。其中酶切反应中的 EcoRI
连 接 子 [ 6] :5-CTCGTAGACTGCGTACCCATCTGACG-
CATGGTTAA-5;MseI连接 子 [ 6] :5-GACGATGAGTC-
CTGAGTACTCAGGACTCAT-5;由宝生物工程 (大连 )
有限公司合成。
PCR扩增反应中选择性碱基引物序列 :EcoRI5
GACTGCGTACCAATTCGC3 (选择性碱基为 GC);
MseI5 GATGAGTCCTGAGTAACG3 (选择性碱基为
CG),由上海生工合成。
PCR扩增后的产物进行 5 %的聚丙烯酰胺凝胶
电泳 ,银染后将染色显影的凝胶置于室温下过夜干
燥 [ 7] ,拍照。
2.4　用 AFLP技术检测木霉肽类代谢产物对豇豆
土著根瘤菌竞争结瘤的影响
2.4.1　豇豆种子处理　取健康 、饱满的供试豇豆
种子 ,用 0.2 % HgCl2表面灭菌 5 min,无菌水洗涤 5
次后 ,置于 27 ℃条件下催芽 ,待种子胚根长至 2 cm
时供试。
2.4.2　根瘤菌的接种　分别将 2.2中不同方法培
养的供试根瘤菌菌液 ,调至浓度为 1 ×108 cfu/mL。
将催芽的豇豆分为三等分 (每份 80粒以上),分别浸
入以下 3种根瘤菌菌液中 10 min:(1)含 1-1根瘤菌
的菌液 100 mL;(2)含 1-2根瘤菌的菌液 100 mL;
(3)含 1-1根瘤菌菌液 50 mL和 1-2根瘤菌菌液
50 mL的混合液。
2.4.3　供试根瘤的获得　将不同浸种处理的豇豆
340　　　　　　　　　　　　　　激　光　生　物　学　报　　　　　　　　　　　第 17卷
种子进行盆栽。盆土均为采自前茬栽种豇豆的同一
田间自然土 , 并于 121 ℃灭菌 1 h。盆钵直径为
20 cm,每盆播种四粒种子 ,并相对应再接种以上 3
种根瘤菌菌液 20 mL。每处理播种 30盆 ,随机摆放 ,
待种子萌发两片子叶展开时 ,间苗 ,使每盆留 2株长
势较一致的幼苗 。于幼苗长至 50 d时 ,随机取出不
同根瘤菌菌液处理的豇豆根系 ,每处理取 15株。小
心洗净根系后 ,随机采摘各根系成熟根瘤。
2.4.4　根瘤中类菌体 DNA的提取　具体操作参
照文献 [ 3 ]的方法 ,并略有改动。
2.4.5　根瘤中类菌体 DNA的 AFLP分析 　方法
同 2.3.4。
2.4.6　不同处理根瘤菌占瘤率的测定 　从混合
接种试验的豇豆根系随机选取 50个根瘤提取 DNA,
按 2.3.2方法 AFLP扩增 ,用 5 %聚丙烯酰胺凝胶电
泳分离得到电泳图谱后 ,比较所得的 AFLP指纹图
谱 ,分别记录与不同供试出发菌株具有相同谱带的
数量 ,并按下式计算某种根瘤菌的占瘤率 [ 4] 。
N=A÷B×100 %
上式中 , N代表占瘤率 ;A代表泳道中根瘤类菌
体 DNA的 AFLP指纹与某一出发菌株 AFLP指纹具
有相同带谱的泳道数量;B代表根瘤类菌体的 AFLP
指纹的总泳道数 ,即试验中调查的总根瘤数。
陈强等 [ 4]认为每条泳道是从一个根瘤中提取类
菌体 DNA进行 AFLP反应后形成的 ,代表了一个根
瘤 ,因此可代表某个菌株侵入豇豆根系后形成根瘤
的数量。作者认同该观点 ,在本试验中也采用了这
一方法。
3　结果与分析
3.1　传代次数对土著根瘤菌 AFLP带型的影响
供试豇豆土著根瘤菌同一温度下不同培养时间
的 AFLP指纹图谱见图 1。图 1显示 ,不论是被木霉
代谢产物处理过还是未被处理 ,其 24代和 96代的
AFLP图谱基本一致 ,表明供试菌体经过多代培养 ,
在供试的试验条件下其遗传特性是稳定的 ,未发生
改变。
3.2　温度对供试菌株 AFLP带型的影响
实验中 37 ℃条件下 ,供试的 4个根瘤菌均能够
生长 ,表现出较好的耐高温性 ,实验结果表明 ,供试
的所用菌株在 37 ℃条件下 ,多代培养后 ,其遗传特
性仍具有较好的稳定性。 (图 1)
1:Mark;2-5:1-2, 2-2, 3-2, 4-2(27 ℃ 24代);6-9:1-2, 2-2, 3-2, 4-2(27 ℃ 96代);10-13:1-2, 2-
2, 3-2, 4-2(37℃ 24代);14-17:1-2, 2-2, 3-2, 4-2(37 ℃ 96代);18-21:1-1, 2-1, 3-1, 4-1(27 ℃
24代);22-25:1-1, 2-1, 3-1, 4-1(27 ℃ 96代);26-29:1-1, 2-1, 3-1, 4-1(37 ℃ 24代);30-33:1-1,
2-1, 3-1, 4-1 (37 ℃ 96代);34:Mark
图 1　不同培养条件下供试根瘤菌 AFLP指纹图谱
Fig.1　AFLPfingerprintsofRhizobiumvignaafterdifferenttreatment
　　结果表明纯培养条件下 , AFLP指纹图谱具有较
高的稳定性 ,可完全用于研究供试根瘤菌在土壤中
的结瘤状况 。
3.3　根瘤类菌体 DNA的 AFLP图谱
从分别接种了 1-1和 1-2纯培养的根瘤菌的豇
豆根系上随机采集 3个根瘤 ,提取 DNA作 AFLP分
析 ,其指纹图谱见图 2。
341第 3期　　　　　　　　罗赫荣等:哈茨木霉发酵液中肽类物质对豇豆土著根瘤菌竞争结瘤的影响　　　　　　　
0:M;1-3:单独接种 1-2根瘤菌所结根瘤中类菌体 DNA图谱;4-5:单独接种 1-1根瘤菌所结根瘤
中类菌体 DNA图谱 DNA图谱;6-48:混合接种根瘤菌所结根瘤中类菌体 DNA的图谱
图 2　混合接种试验根瘤类菌体 DNA的 AFLP指纹图谱
Fig.2　TheAFLPpatternsgeneratedbybacteroidsDNAisolatedpeanutrootnodulesinoculatedby
mixtureinoculumofstrains1-1 and1-2
　　图 2显示 ,同一根瘤菌在植株上所结根瘤类菌
体 DNA的 AFLP指纹图谱高度一致 ,表现出很好的
重复性。 1-2菌株所结根瘤中类菌体 DNA的指纹图
谱与培养基中纯培养的对应出发菌株指纹图谱相
比 ,特征性谱带绝多数吻合 ,但在分子量为 200 bp位
置上多出一明显条带 ,几次重复均为该结果;经木霉
代谢产物处理的 1-1菌株其所结根瘤中类菌体 DNA
的指纹图谱与培养基中纯培养的对应出发菌株指纹
图谱则无明显特征谱带的差异。
表 1　混合接种试验中供试根瘤菌的占瘤率的统计
Tab.1　Thenoduleoccupancyratefortextedstrains
ofmixedrhizobiainoculation
菌株
Strain
与出发菌株 AFLP谱带
相同的根瘤数(个)
Thenumberofnoduleswiththesame
AFLPpatternsasoriginalstrain
占瘤率(%)
Nodule
occupancy
1-1 26 60.47
1-2 17 39.53
图 3　不同处理类菌体 DNA的 AFLP分析树状图
Fig.3　UPGMAdendrogramgeneratedfromAFLPpatternsofrhizobiumDNA
342　　　　　　　　　　　　　　激　光　生　物　学　报　　　　　　　　　　　第 17卷
3.4　供试菌株的占瘤率
从混合接种试验的 10株豇豆植株根系随机采
集了 50个根瘤 ,提取类菌体 DNA进行 AFLP指纹分
析 ,将其中 43个 PCR产物与相对应的出发菌株单菌
株接种所结根瘤中类菌体 DNA的 AFLP产物(作为
参比物 )同时进行电泳 (图 2),对其带型进行分析
后 ,计算出各菌株的占瘤率 ,统计结果见表 1。
表 1结果表明 ,经木霉代谢产物处理后的豇豆土
著根瘤菌竞争结瘤能力显著高于对照菌株 ,两者的占
瘤率相差了 1.53倍 ,实验结果也可见图 2和图 3。
3.5　AFLP结果分析
实验中 ,在图 2的电泳图谱上不同菌株间迁移
速率相同的带 (片段长度一样 )被认为是同一性状 ,
相应与每个菌株 ,在此位置上有扩增带的编码为
“1” ,无扩增带的编码为 “0” ,用 NTSYS软件进行聚
类分析 ,结果见图 3,图 3中菌株的编号同图 2。
由图 3可看出 ,经木霉肽类代谢产物处理后 ,供试
根瘤菌的遗传相似性较高 ,在 92.2 %相似水平上都聚
为了一类 ,此类中共包含 28个菌株(其中 4, 5为单独
接种 1-1根瘤菌所结根瘤中的类菌体菌株);而未经木
霉代谢产物处理的菌株遗传相似性差点 ,在 86.5 %的
相似水平上才聚为一类 ,其中包含了 20个菌株 (其
中 1, 2 , 3为单独接种 1-2根瘤菌所结根瘤中的类菌
体菌株)。全部供试菌株在 81 %的相似水平上聚为
一类 ,这说明经木霉肽类代谢产物处理后 ,使土著根
瘤菌的遗传性状与出发菌株相比发生了变异 。
4　讨论
近十年来 , AFLP技术已广泛应用于原核及真核
基因组指纹图谱及基因定位研究 ,实验证明其能反
映出各种基因组 DNA丰富的遗传信息 ,且结果稳定
可靠 。前人的研究表明 , AFLP指纹技术具有较高的
分辨率 ,可以区分用其它方法无法区分的不同菌株 ,
所以该方法现已较普遍地用于在亚属的水平上对细
菌进行分类和鉴定 [ 7-8] 。这也是本实验中应用该技
术对土著根瘤进行研究的依据。
但在纯培养条件下 ,供试根瘤菌菌株经过多次
传代后 ,菌株的 AFLP指纹是否稳定 ? 不同温度条件
下培养菌株后 ,尤其是在湖南 ,豇豆生育期中高温天
气较多的情况下 ,共生的根瘤菌是否也具有相应的
适应性 ,其 AFLP指纹图谱是否还具有较好的稳定
性 ? 这是 AFLP技术能否用于本论文中根瘤菌生态
研究和菌种选育的关键。实验结果表明 ,供试豇豆
土著根瘤菌菌株在高温(37 ℃)下连续多代培养(96
代 )以及在根瘤内 ,其 AFLP指纹图谱都是稳定的 ,这
也与陈强等 [ 4]研究结果相符 ,他们实验结果也表明 ,
传代次数和一定范围内的高温对花生的 AFLP指纹
无明显的改变 ,在不改变菌株遗传特性 ,即不使用突
变株的前提下 ,就可以直接测定已知菌株的竞争结
瘤能力。
此外 ,人们在对细菌进行分类和鉴定研究中 ,也
发现作为建立在 PCR基础上的 DNA指纹技术 , AFLP
指纹图谱分析可通过对染色体 DNA限制性片段的
选择性扩增 ,并选择合适的 AFLP引物和限制性内切
酶 ,很容易控制 AFLP指纹图谱中电泳条带的数目 ,
便于分析 ,同时还具有无需事先了解所研究 DNA的
序列 ,并具高分辩率 、高重复性与高灵敏度等优点 ,
被认为可以在亚属的水平上对细菌进行分类和鉴
定 。 Janssen等人选用 147 株已知细菌种菌株对
AFLP指纹技术作为细菌分类中的一种新方法进行
评价。他们发现 AFLP指纹技术分析结果与 DNA-
DNA杂交 ,细胞脂肪酸分析结果都具有较好的一致
性 。另外 ,他们的研究结果还表明:AFLP指纹技术
在区别高度相关的菌株 (属于同一个种或同一个生
物型的菌株)方面颇具潜力。利用 AFLP指纹图谱 ,
也可较易地将土著根瘤菌原始出发菌株与经木霉代
谢产物处理的土菌株分辨开。
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