全 文 ： 基础研究
哈茨木霉发酵液中肽类物质对
豇豆根瘤结构和功能的影响*
魏　林 1, 2 , 梁志怀 2 , 张志光 3* , 罗赫荣 2
(1. 湖南农业大学生物科学与技术学院 , 湖南 长沙 410128;
2.湖南省植物保护研究所 ,湖南 长沙 410125;3.湖南师范大学生命科学学院 , 湖南 长沙 410181)
摘　要:通过树脂吸附 、离子交换 、薄层层析 、高效液相色谱系统等分离 、纯化方法 , 从哈茨木霉 (Trichoderm a
harzianum)T2-16菌株发酵液中分离得到一种对豆科作物生长具促进作用的物质 , 通过质谱等方法鉴定为肽类物
质 。为探明该活性物质对豆科作物的促生机制 ,用该活性物质对豇豆种子浸种处理后 , 进行盆栽实验 ,通过对盆
栽实验中根瘤结构与固氮活性变化的研究 , 结果显示 , 该活性物质可增加根瘤侵染组织的面积和根瘤细胞中类
菌体的数量 , 降低根瘤细胞液泡化程度 , 促进根瘤中公共细胞周膜较多形成 , 加快类菌体的发育成熟 , 提高根瘤
豆血红蛋白的含量 , 从而提高根瘤的固氮活性。
关键词:哈茨木霉;肽类物质;根瘤;显微结构;固氮活性
中图分类号:Q945. 13
文献标识码:A
文章编号:1007-7146(2006)01-0084-06
Effects of Peptide in the Ferm entation L iquid ofTrichoderma harzianum
on NoduleM icrostructure and Function ofCowpea
WEI Lin
1, 2 , LIANG Z hi-huai2 , ZHANG Zh i-guang3* , LUO He-rong2
(1. Co llege o f B io log ica l Science and Techno logy, Hunan Agricultua l University, Chang sha 410128, Hunan;
2. Hunan P lant P ro tec tion Research Institute, Changsha 410125, Hunan;
3. L ife Science C ollege of Hunan Norm al Unive rsity, Changsha 410081, Hunan)
Abstract:Various m e thods inc luding m ultip le co lum n laye rs , TLC , HLPC, UV andMS w e re adop ted in the iso la tion,
purification and identifica tion of the g row th promo ting sub stance in the ferm ented liquid o f Trichoderma harzianum T2-16.
The test result sugge sted the g row th prom o ting substancew as a k ind o f peptide. The mechanism o f g row th p rom o ting sub-
stance w as stud ied. The e ffec ts on nodule m ic rostruc tu re and nitrogen-fix ing of cowpea w ere studied th rough it wa s ap-
p lied by seed soak ing in g reenhouse pot tests. The re sults is as follow s:The ra tio o f cen te r tissue( tissue infected) and
the ce lls in the nodules o f cow pea trea ted by grow th prom oting substance had m uch bigger and le ss vacuo les than those in
trea ted by w a te r. The num be r o f bac te ro id in pe r ce ll and the content of leghaem og lob in of cowpea nodu le trea ted by
g row th prom oting substance w as a lso rem arkably inc reased. M eanwh ile, the comm on peribacte ro id mem branes w e re ap-
peared in a high frequency than those treated by w a te r. The resu lts showed tha t cow pea treated by g row th prom o ting sub-
stance had highe r p roduc tion o f leghaem og lob in, diffe rent m icro structure and bac te rio id ultra structure of cowpea nodule
w hich led to a h igher nitrogenase ac tiv ity of peanu t nodu le.
第 15卷第 1期
2006年 2月 　　　　　　　　　
激　光　生　物　学　报
ACTA　LASER　B IOLOGY　SIN ICA　　　　　　　　　　　Vo.l 15 No. 1Feb. 2006
* 收稿日期:2005-06-30;修回日期:2005-08-01
基金项目:湖南省自然科学基金(03JJY4013;04JJ3075)
作者简介:魏林(1970 - )女 , 博士. 主要从事作物病害生物防治研究工作. (电话)13808412170
*通讯作者(电话)0731-8871819;(电子信箱)we ilincn@163. com
Key words:Trichoderm a harzianum;peptide;nodu le;m ic rostructu re;nitrogen-fixing
　　根瘤菌与豆科植物的共生固氮作用在改良土
壤 ,提高农作物产量 ,改善生态环境等方面有着十分
重要的意义 。因此 ,提高作物根瘤的固氮活性 ,在农
业和环境保护中具有积极的作用。
已有研究表明:根瘤的形态结构 、根瘤中类菌体
的超微结构与豆科植物的固氮能力有着密切的联
系 [ 1] 33。而这些因素在受到不同外界条件影响时 ,都
会发生改变 ,进而影响根瘤的固氮活性 [ 2] 。
本实验研究中 ,发现哈茨木霉(Trichoderma harzi-
anum)T2-16菌株在适宜的发酵培养基中培养所得到
的发酵液 ,在提高豆科作物结瘤能力和根瘤固氮酶
活性方面具有显著的促进作用 [ 3] ,并通过树脂吸附 、
离子交换 、薄层层析 、高效液相色谱系统等分离 、纯
化的方法 ,从哈茨木霉 T2-16菌株发酵液中分离得到
该种对豆科作物生长具促进作用的活性物质 ,通过
紫外 、质谱等分析 ,确定该物质是分子量为 1032的
肽类物质(实验结果另文发表 ),但该肽类物质对豆
科作物根瘤中与固氮活性密切相关的因素有何影响
尚未明了。目前 ,有关木霉菌或木霉发酵产物对豆
科作物—根瘤菌这一固氮体系中与固氮活性相对应
诸因素的作用 ,国内外均未见有研究报道。本论文
以豇豆为材料 ,研究分离得到的 T2-16菌株发酵液中
肽类物质浸种处理后 ,对豇豆根瘤形态结构和类菌
体超微结构等的影响 ,以期从微观的角度探明木霉
提高豆科作物固氮活性的机制。
1　材料与方法
1. 1　材料
豇豆品种:为 “特选 28-2” ,系江西省丰城市津南
区种子公司生产 。挑选其中大小基本一致 、颗粒饱
满 、各部分结构完整且健康无病的种子用于实验。
木霉菌株:从采自湖南不同生态区多种作物的
根围土中分离得到不同木霉菌 200余株 ,通过对不
同菌株对植物病原菌拮抗性 、发酵培养时生长速度 、
营养物质需求等方面的生物学特性研究 ,筛选出各
方面性状较好的哈茨木霉 T2-16菌株 ,作为实验菌株 。
将该菌株在 PDA平板固体培养基上于 26 ℃条件下
培养 7天待用 。
1. 2　实验方法
1. 2. 1　种子预处理　　将供试豇豆种子经 75 %
酒精 1 m in、0. 1 %升汞 10 m in表面消毒后 ,分别浸
入盛有 20 m L哈茨木霉 T2-16肽类促生活性物稀释
500倍液和 20 mL灭菌水的小烧杯中 ,浸泡 6 h后 ,
在 28 ℃、相对湿度 95 %条件下 ,萌发 2天 。
1. 2. 2　哈茨木霉 T2-16发酵液中肽类物质对豇豆
根瘤形态结构的影响　　挑选不同浸种处理 、萌发
较一致的豇豆种子 ,进行盆栽。盆土均为采自前茬
栽种豇豆的同一田间自然土。盆钵直经为 20 cm ,
每盆播种 3粒种子 ,每处理播种 50盆 ,随机摆放 ,待
种子萌发 2片子叶展开时 ,间苗 ,使每盆留 1株长势
较一致的幼苗。于幼苗长至 10天时 ,随机取出不同
处理的豇豆根系 ,每处理取 15株。小心洗净根系
后 ,随机采摘不同处理的豇豆根系上直经 3 mm左右
的幼嫩根瘤。 45天后 ,同样方法 ,随机采摘不同处理
的成熟根瘤。对幼嫩根瘤与成熟根瘤分别进行石蜡
切片和透射电镜制片 ,观察根瘤的内部结构。
石蜡切片 :取不同浸种处理下的成熟根瘤 , FAA
固定 ,酒精系列脱水 ,石蜡包埋 ,切片厚 7 μm ～ 10
μm ,番红 -固绿染色 ,中性树脂封固。在 O lympus光
学显微镜下观察并拍照。
透射电镜制片:参照何一 [ 4] 等方法 。取样后立
即分别摘取豇豆成熟根瘤 (直径 3 mm左右 )和幼小
根瘤(直径 1 mm左右),洗净后切成近 1 mm ×1 mm
小块 ,放于 2. 5 %戊二醛的 0. 1 mo l /L磷酸缓冲液
(pH 7. 0)中 ,在室温下预固定 4 h,用同种缓冲液冲
洗后 ,再在含有 1 %的锇酸缓冲液低温下(4 ℃)固
定 2 h,冲洗后 , 再经丙酮系列脱水 , 最后包埋在
Spurr’ s树脂中 , 45 ℃温箱中聚合 12 h ,再移入 60 ℃
的温箱中聚合 24 h。包埋块经修块后 ,分别做半薄
切片和超薄切片后 ,将其放到 200目的已用 Form er
制好的铜网上 ,在蜡盘中分别用柠檬酸铅和醋酸双
氧铀染色 5 m in ～ 6 m in,然后在透射电镜上观察。
1. 2. 3　哈茨木霉 T2-16发酵液中肽类物质对豇豆
根瘤中豆血红蛋白含量的影响 　　分别随机取一
定量的 1. 2. 2中两处理的新鲜成熟根瘤 ,在 5 ℃的
磷酸缓冲液(0. 1 mo l /L , pH 6. 8)中研磨匀浆 ,磷酸
缓冲液的用量为根瘤体积的 4倍左右。磨碎的悬浊
液用细薄棉布过滤 ,滤液在 100 ×g、5 ℃下离心 15
m in,弃掉沉淀物 ,上清液继续在 39 000 ×g、5 ℃下离
心 20 m in,溶解沉淀物 ,分光光度计测定豆血红蛋白
含量 [ 5] 。
1. 2. 4　哈茨木霉 T2-16发酵液中肽类物质对豇豆
根瘤固氮酶活性的影响　　根瘤固氮酶活性采用
乙炔还原法测定 [ 6] 。获取 1. 2. 2中两处理的单株豇
85第 1期　　　　　　　　　魏　林等:哈茨木霉发酵液中肽类物质对豇豆根瘤结构和功能的影响　　　　　　　　　
豆地下部 ,连根带根瘤剪下 ,立即置于干净自制的
500 mL密闭容器中 ,注入 40 mL高纯度乙炔。在 30
℃无光条件下反应 1 h后 ,抽取 0. 5 mL气体 ,在气相
色谱仪上测定乙烯释放量。测定条件为:柱温 80
℃,检测室 80 ℃,气化室 80 ℃,出口 100 ℃,空气流
量 400 mL /m in,氮气流量 30 mL /m in,氢气流量 35
mL /m in。
固氮量按下列公式计算:
C2H4 nmo l /plant h
　 =实验温度系数 (mm /mL)×标准进样量(mL)样品进样量(mL)×标准峰高 (mm) ×
气体积(mL)×样品峰高(mm)
反应时间(h)
2　结果与分析
2. 1　哈茨木霉 T2-16发酵液中肽类促生活性物质
对豇豆根瘤结构的影响
经哈茨木霉 T2-16发酵液中肽类促生活性物质浸
种处理后 ,豇豆所形成的根瘤基本结构与清水浸种
处理的无明显的差异 ,都由 4个部分组成 ,即由外向
内依次为:保护层 、皮层 、鞘细胞层和中心组织。但
是通过比较两者的中心组织却可发现 ,经该促生活
性物质浸种处理的豇豆根瘤的中心组织(侵染组织 )
中被根瘤菌侵染的细胞数量明显增多 ,中心组织在
根瘤中所占的比例也显著高于清水对照 (图 1, 图
2);清水浸种处理的根瘤皮层与鞘细胞层细胞中晶
体及颗粒状内含物明显比该促生活性物浸种的多 ,
含细胞核的细胞数也显著多于 T2-16促生活性物浸种
处理的 ,说明在相同的时间内 , T2-16发酵液中肽类促
生活性物质浸种处理后 ,可促进豇豆根瘤的提早成
熟 ,进行固氮作用(图 3 ,图 4)。观察切片还可看到 ,
经该促生活性物浸种处理的侵染细胞体积明显较对
照大 ,细胞内几乎没有液泡 ,整个细胞质中充满了变
形的根瘤菌类菌体 。此外 ,该促生活性物浸种处理
的根瘤中 ,几乎没有观察到淀粉的积累 ,而对照根瘤
中积累了较多的淀粉粒。据报道 ,淀粉粒主要存在
于豆科植物根瘤的非含菌细胞里 [ 7] ,本实验中对照
处理的根瘤中非含菌细胞比促生活性物处理多 ,因
此淀粉粒也就多于处理 。这也说明促生活性物浸种
处理的根瘤中碳水化合物代谢活动比对照活跃(图
5 ,图 6)。
根瘤菌进入寄主细胞后 ,发育成有周膜包裹的
类菌体 ,从而具有固氮能力 。电子显微镜观察 ,可发
现经该肽类促生活性物浸种处理的豇豆成熟根瘤
中 ,受侵染细胞细胞质中充满了类菌体 ,单个细胞内
类菌体的数量明显多于对照 (图 7 ,图 8),并且在类
菌体周膜中 ,常出现多个类菌体并存的现象;而清水
浸种处理的豇豆根瘤中的类菌体周膜中以只有一个
类菌体的为多 ,很少见一个以上的类菌体存在同一
个周膜中 (图 9,图 10)。
电镜观察正在发育的幼小根瘤类菌体 ,处理与
对照的外形较为一致 ,多为椭圆形 ,细胞质浓密 。前
人研究表明 [ 8] ,在根瘤成熟过程中 ,根瘤类菌体中会
慢慢积累聚-β-羟基丁酸 (PHB)这一物质 ,电镜下可
看到 ,经该肽类促生活性物浸种处理的豇豆幼年根
瘤类菌体中已有聚 -β-羟基丁酸形成 ,呈现为大小不
一的电子透明颗粒 (图 11);而清水浸种处理的豇豆
根瘤中的类菌体刚现雏形 ,仅形成了周膜 , 还未见
PHB形成(图 12)。表明该肽类促生活性物浸种处
理后 ,可促进侵入宿主细胞中的根瘤菌生长及类菌
体的成熟发育。
2. 2　哈茨木霉 T2-16发酵液中肽类促生活性物质对豇
豆根瘤豆血红蛋白含量和根瘤固氮功能的影响
豆科植物根瘤中豆血红蛋白的含量是反映其固
氮功能强弱的重要指标 ,其浓度越高 ,根瘤的固氮酶
活性也越高 [ 9] 。经哈茨木霉 T2-16发酵液中肽类促生
活性物质和清水浸种处理后 ,豇豆根瘤中豆血红蛋
白的含量和根瘤固氮能力见表 1。
表 1　T2-16发酵产物对豇豆根瘤血红蛋和根瘤固氮功能的影响
Tab. 1　E ffects o f T2-16 fe rmen tation filtrate on leghaemog lobin con tent and nitrogen fixation o f cowpea nodule
处理
T rea tm ents
豆血红蛋白含蛋
Leghaem og lobin con ten t(μm o l /p lan t) 乙炔还原力A cety lene reduc tion(C2H4 nm o l /plant h)
T2-16发酵产物
T2-16 fe rm entation filtrate 0. 33 1850
对照 ck 0. 21 1149
86　　　　　　　　　　　　　　激　光　生　物　学　报　　　　　　　　　　　第 15卷
87第 1期　　　　　　　　　魏　林等:哈茨木霉发酵液中肽类物质对豇豆根瘤结构和功能的影响　　　　　　　　　
88　　　　　　　　　　　　　　激　光　生　物　学　报　　　　　　　　　　　第 15卷
实验结果表明 ,该肽类促生活性物浸种后 ,豇豆所结
根瘤中的豆血红蛋白的含量比对照有较大的提高 ,增
加量高达 57. 14 %;固氮酶活性也得以提高 ,与对照
相比固氮酶活性提高 61. 01 %。表明根瘤中豆血红
蛋白含量增加 ,也是提高豇豆固氮活性的重要原因 。
3　讨论
本实验结果表明 ,哈茨木霉 T2-16发酵液中肽类促
生活性物质对豇豆进行浸种处理后 ,可以显著地提高
豇豆根瘤的固氮能力 ,其作用主要表现在:提高了豇
豆根瘤豆血红蛋白的含量 。豆血红蛋白是固氮根瘤
菌侵入豆科植物根部以后所形成的根瘤内部产物 ,占
侵染植物细胞可溶性蛋白的 25 % ～ 30 %[ 1] 35 ,它在
固氮类菌体周围起运输和调解氧的作用 ,能维持豆科
植物根瘤内较低氧分压(pO2), 并有效地把 O 2传递
给类菌体中含铁血红蛋白 ,使固氮酶执行其功能 。因
此 ,其含量的高低直接影响着根瘤的固氮酶活性 。该
肽类促生活性物促进了根瘤豆血红蛋白的合成 ,进而
提高了固氮活性。
对豇豆根瘤形态结构产生了较大的影响。 Sin-
clair和 Se rraj[ 10]研究表明:根瘤的形态结构及其类菌
体的超微结构在一定程度上可反映豆科植物根瘤的
固氮能力。本实验中 ,哈茨木霉 T2-16发酵液中肽类促
生活性物质浸种处理后 ,不仅使豇豆根瘤的中心组织
含菌细胞区域 、侵染细胞中类菌体数量明显增加 ,并
使类菌体公共细菌周膜 (即一个周膜中含有多个类
菌体)大量形成。
对于根瘤菌中的公共细菌周膜 ,现在普遍认为它
是根瘤中根瘤菌发育成熟 (形成类菌体)的形态标
志 ,是一定功能的反映。它的形成具有重要的生物学
意义 ,主要表现为 :有利于增加浸染细胞中单位体积
内细菌的数量 ,使体积相同的细胞中可以容纳更多的
细菌 ,从而提高根瘤的固氮能力 ;二是增加了类菌体
周膜总的表面积 ,促进了类菌体与寄主细胞之间的物
质交换 、信息传递和能量供应。这对固氮活性处于高
峰时期的类菌体尤为重要 ,因为此时它们需要从寄主
细胞那里获得足够的营养和能量。同时又必须将固
定的氨及时通过类菌体周膜输送到寄主细胞中 ,否则
类菌体中氨的浓度过大就会引起氨中毒 [ 11] 400。
本实验的研究结果也证实了这一观点 ,经哈茨木
霉 T2-16发酵液中肽类促生活性物质浸种处理的豇豆
根瘤产生较多的公共细菌周膜 ,增加了类菌体周膜总
的表面积和被侵染细胞中类菌体数量 ,使侵染细胞的
固氮能力得以最大发挥 。这也是哈茨木霉发酵液中
肽类促生活性物质处理后 ,根瘤的固氮活性高于对照
的一个重要原因。
至于根瘤中的公共细菌周膜的来源 ,一般认为有
两种:一种由类菌体与其类菌体周膜分裂不同步产
生 ,另一种则来自类菌体周膜的互相融合 [ 11] 403。在
本试验中 ,未观察到类菌体周膜的相互融合 ,因此不
能判断木霉发酵液中肽类促生活性物质处理后 ,出现
较多的类菌体周膜现象 ,是由于该产物加快了类菌体
的分裂 ,还是因为促进了类菌体周膜的相互融合造成
的 。而国内外也未见有关报道 ,因此有待于进一步研
究 。
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光纤 LPG研究将有望满足此要求。
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