全 文 ：　林业科技开发　2007年第 21卷第 6期 49　
参考文献
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(通讯地址:421900,湖南省衡阳市南岳区)
邓恩桉茎段离体培养再生植株的研究
王以红 1　吴幼媚1　蔡玲 1　黄金使 1　黎兆海2
(1广西林业科学研究院　2广西三门江林场)
摘　要:对 9a生邓恩桉优株树干基部环割促萌 ,以萌芽条的茎段为外植体 ,进行始芽诱导 、不定芽增殖以及再生
植株的培养研究。结果显示:以 0.1%HgCl
2
处理外植体 8 ～ 10min时无菌活外植体得率较高 ,达到 50% ～ 60%;适
宜茎段离体培养的基本培养基为改良 B5 , 即 B5 +NH4NO3 60mg/L;细胞分裂素与生长素组合 6-BA0.18mg/L+
NAA0.14mg/L有利于不定芽的增殖和生长 , 培养 25d时不定芽增殖系数 3, 且生长健壮;单芽在 1/2 B5 +IBA
1.2mg/L+NAA1.6mg/L上生根率为 73.3%。
关键词:邓恩桉;茎段;再生植株
StudyoninVitroCultureandPlantRegenerationfromStemSegmentofEucalyptusdunni∥WANGYi-
hong, WUYou-mei, CAILing, HUANGJin-shi, LIZao-hai
Abstract:Thesuperiortreesofnine-year-oldEucalyptsdunniiwereselectedandtreatedwithgirdlingtopromotesprouting.
Thestemsegmentsfromshootsofeucalyptswereusedasexplantstocarryouttheshootsinduction, adventitiousshootprolif-
erationandplantregeneration.Theresultsshowedthattheexplantsurvivalratewashigherandreachedto50% ～ 60%
whentheexplantsweretreatedwith0.1%HgCl2 for8 ～ 10min.Theoptimalmediumforstemsegmentsinvitroculturewas
themodifiedB5(B5+60 mg/LNH4NO3).The6-BA0.18 mg/L+NAA0.14 mg/Laddedwaspropitioustoproliferation
andgrowthofadventitiousshootandtheproliferationcoeficientreachedto3 after25 days.Theadventitiousshootsgrew
wel.Therootingrateofasingleshootwas73.3% inthemediumofIBA1.2mg/L+NAA1.6mg/L+1/2B5.
Keywords:Eucalyptusdunnii;stemsegment;Plantregeneration
Firstauthor saddress:GuangxiAcademyofForestry, 530001, Nanning, China
收稿日期:2007-07-09　　　　修回日期:2007-08-31
基金项目:广西科技厅科技攻关项目 “耐寒桉良种邓恩桉脱毒及组培
快繁技术研究 ”(编号:0235017-5)。
第一作者简介:王以红(1957-),女 ,高级工程师 ,主要研究方向为林
木生物技术。
　　邓恩桉(EucalyptusdunniMaiden)系桃金娘科桉
树属树种 ,原产澳大利亚 ,我国系统地引进和栽培测
试是在 20世纪 80年代末 [ 1] 。邓恩桉不仅具有生长
快 、成材早 、材性好 、用途广等优良经济性状 ,还具有
耐寒的生态特性 ,在生产栽培上归属于 “耐寒桉 ”类
型 。对耐寒型桉树的研究是我国桉树研究一个新的
起点 ,桉树在北缘区种植受限制的一个最大的因子
是其耐寒性能 [ 2] ,我国当前桉树主要的种植区虽然
集中在以广东 、广西和海南为主的华南地区 ,但在
该地区平均等温线 20℃以北的区域 ,桉树的栽培并
不普遍 ,为栽培选择区 ,即只能选择气温 、地形等条
件适合桉树生长的地块种植 , 而且仍然会受到低
温 、霜冻 、雪等严寒的威胁 ,若栽培的桉树品种抗寒
能力弱 , 一旦遇上严寒则将给生产上造成巨大损
失 。引起寒害或冻害的主要原因一是气候本身的
低温寒冷 ,二是缺乏在该区域生长的抗寒桉树品
种 [ 3] ,因此 ,选育具有抗寒特性且生长经济性状良
好的桉树品种 ,对促进较寒冷区域桉树发展有着非
常重要的意义 。然而邓恩桉在我国较寒冷区域的
种植却一直依靠从国外购进大量种子 ,不仅价格昂
贵且遗传性状不稳定 ,造林后植株个体生长参差不
齐 ,良莠分化较大 ,严重制约着该树种的生产发展。
为了解决邓恩桉在造林上严重缺乏优良种苗的供
需矛盾 ,笔者在 9a生的邓恩桉实生林分中 ,采用 5
株优势木选优法筛选出优良单株 ,对其萌芽条的茎
段进行了离体培养再生植株的研究 ,期望为邓恩桉
在较寒冷区域的推广造林提供具有遗传性状一致
的优良无性系种苗 。
　应用研究
50　 林业科技开发　2007年第 21卷第 6期
1　材料与方法
1.1　试验材料
来自广西三门江林场中选优株 GLD1、 GLD2 、
GLD3和 GLD4 ,年龄 9a生 ,以树干基部萌芽条的茎
段为外植体 。
1.2　试验方法
1.2.1　环割促萌
2 ～ 3月份在中选优株树干离地面 15 ～ 20cm处
环割或半环割 ,剥去约 5cm宽的树皮(包括韧皮部),
芽条在环割带下部萌出。
1.2.2　外植体消毒
采集长 15 ～ 25cm的萌芽条 ,除去叶片和顶芽后
将茎段剪切成带 1 ～ 2个腋芽 、长约 1.5 ～ 2.0cm的
小段 ,按木质化程度将第 1 ～ 4节茎段 、第 5 ～ 8节茎
段分为两组。用 70%的乙醇消毒 10s, 再以 0.1%
HgCl2消毒 ,无菌水清洗 5次后接种。试验设计 4种
处理 , 即 0.1%HgCl2 消毒 6min、 8min、 10min和
12min,每处理 40个外植体 ,培养基为 MS附加细胞
分裂素 6-BA0.5mg/L和生长素 NAA0.2mg/L。不
定期地对外植体的污染 、褐化动态进行观察记录 ,接
种 15d时统计外植体的污染率 、褐化死亡率和无菌
活外植体得率(存活率)。
1.2.3　基本培养基筛选
选择 MS和 B5 ,并在其基础上添加一定量的大量
元素 ,共设计 4种基本培养基 ,即 MS、MS+Ca(NO3)2
60mg/L(改良 MS)、B5 、B5 +NH4NO3 60mg/L(改良
B5)。在 4种基本培养基中分别加入细胞分裂素 6-
BA0.5mg/L和生长素 NAA0.2 mg/L。每处理接种
无菌活外植体 30段 ,以肉眼观察到分化生长的芽时
定为外植体始芽萌动 ,连续观察 120d。
1.2.4　芽增殖和生长
在芽的继代培养中 ,选择改良 B5 、细胞分裂素 6-
BA和生长素 NAA为试验因子 ,以 6-BA0.3mg/L、
0.18mg/L、0.14mg/L和 NAA0.16mg/L、 0.14mg/L、
0.1mg/L为试验水平 ,采用完全随机区组试验设计 ,设
计 9个处理 ,每处理接种芽 10颗 , 3次重复。不定期观
察芽的生长表现 ,培养 25d时以能切割剥离且长大于
0.5cm的单芽为计数标准 ,统计芽的增殖系数 ,并对试
验结果进行方差分析。
1.2.5　单芽生根诱导
采用 1/2改良 B5为基本培养基 ,分别添加浓度为
0.4mg/L、 0.6mg/L、 0.8mg/L、 1.0mg/L、 1.2mg/L、
1.4mg/L、1.6mg/L、1.8mg/L、2.0mg/L单一的生长素
IBA和 NAA,共设计 18个处理。将 IBA和 NAA配制成
0.8mg/L+1.2mg/L、1.0mg/L+1.4mg/L、1.2mg/L+
1.6mg/L、1.4mg/L+1.8mg/L和 1.6mg/L+2.0mg/L
的生长素组合 ,共设计 5个处理。所有的试验采用完
全随机接种 ,每处理接种单芽 20株 , 3次重复共 60
株 。接种后不定期地观察生根动态 ,培养 20d时统
计生根率和根系生长状况。
1.2.6　培养条件
始芽诱导和芽增殖培养基中蔗糖 3%, 琼脂
3.5g/L,单芽生根培养基中蔗糖 1.5%,琼脂 4.5g/L。
培养基用 1mol/LNaOH或 HCl调节 pH值为 5.8 ～
6.5,在恒温 120℃和恒压 1.1个大气压下消毒灭菌
15 ～ 20min。培养室温度 25℃ ±3℃,多采用自然光
照 ,光照强度 2 000 ～ 4 000lx, 接种前期于 800 ～
1 000lx弱光下培养 7 ～ 10d。
2　结果与分析
2.1　不同消毒处理对外植体的影响
用 0.1%HgCl2对两组茎段外植体进行 4种不同
时间的消毒处理。表 1试验结果显示 ,两组茎段外植
体消毒效果相似 ,外植体污染率的趋势是随着消毒时
间的延长而下降;但褐化死亡率则相反 ,以 0.1%
HgCl2消毒茎段 8 ～ 10min,无菌活外植体的得率(存
活率)较高 ,达到 50% ～ 60%,其中第 5 ～ 8节茎段无
菌活外植体的得率比第 1 ～ 4节茎段略高。此外在同
一处理时 ,外植体的褐化死亡率随着木质化程度的增
强呈下降趋势 ,当消毒时间为 10min以上时 ,第 1 ～ 4
节茎段的褐化死亡率明显高于第 5 ～ 8节茎段 ,尤其
消毒 12min时 , 前者比后者褐化死亡率高 18%。
HgCl2是具有良好杀菌效果同时也是毒性较强的一
种消毒剂 ,木质化比较强的茎段 , HgCl2不易通过木
质化的细胞壁到达质膜毒害细胞 [ 4] 。
表 1　不同消毒处理对外植体的影响 /%
处理时
间 /min
第 1～ 4节茎段
污染率 褐化死亡率 存活率
第 5 ～ 8节茎段
污染率 褐化死亡率 存活率
6 82.5 7.5 10.0 77.5 7.5 15.0
8 32.5 12.5 55.0 30.0 12.5 57.5
10 30.0 20.0 50.0 27.5 12.5 60.0
12 22.5 55.0 22.5 25.0 37.5 37.5
2.2　基本培养基对始芽萌动生长的影响
分别在 MS、改良 MS、B5和改良 B5中附加 6-BA
0.5mg/L+NAA0.2mg/L组成 4种培养基 ,将无菌
活外植体接种 ,进行始芽萌动和生长培养试验 ,详见
表 2。试验结果显示 ,邓恩桉茎段外植体接种后始芽
应用研究　
　林业科技开发　2007年第 21卷第 6期 51　
诱导比较容易 ,在 4种基本培养基上均能诱导始芽萌
动 。始芽萌动效果较好的是在 MS和改良 MS培养基
上 ,培养 15d时萌动率分别为 63.3%和 60.0%,芽伸
长 0.2 ～ 0.8cm。这与邓恩桉种子下胚轴在改良 MS
上培养发生不定芽原基的结果比较相似[ 5] ,但随着
培养时间的延长 ,培养基对芽生长的影响逐渐显示出
来 ,芽徒长呈玻璃化 ,至培养 120d时 40% ～ 80%的
芽褐化死亡。外植体在 B5培养基上前期表现也较
好 ,培养 30 ～ 40d芽伸长 ,培养 60d开始产生丛生
芽 , 但培养 120d时绝大部分芽相继出现黄化 、褐化
而导致死亡。邓恩桉具有适宜在酸性或微酸性条件
下生长的特性 , B5培养基可能因缺乏铵盐 ,培养基的
pH会向碱性方向漂移的缘故[ 6] ,改良 B5是在 B5中
添加 NH4NO3 60mg/L改善培养基成分 ,使之适宜邓
恩桉的生长特性。在改良 B5中外植体始芽萌动率略
低为 56.7%,且前期培养 30 ～ 40d时芽伸长比较缓
慢 ,但后期生长表现良好 ,培养 120d时 80%的始芽
出现丛生芽 ,生长健壮 。
表 2　基本培养基对外植体始芽萌动 、生长的影响
培养基 外植体段
培养 15d时芽萌动情况
萌动数
/段
萌动
率 /%
芽生长
数 /个·段 -1
芽高度
/cm
培养 30～ 120d时芽生长情况
MS 30 19 63.3 1～ 2 0.2 ～ 0.8 30～ 40d时芽明显伸长 ,玻璃化;120d时 80%的芽褐化死亡
改良 MS 30 18 60.0 1～ 2 0.2 ～ 0.6 30～ 40d时芽伸长 ,玻璃化 , 120d时 40%芽褐化死亡
B5 30 14 46.7 1～ 2 0.1 ～ 0.5 30～ 40d时芽伸长 , 60d开始出现丛生芽 , 120d后芽逐步褐化死亡
改良B5 30 17 56.7 1～ 2 0.2 ～ 0.6 30～ 40d时芽缓慢伸长 , 60 d开始出现丛生芽 , 120d时 80%出现丛生芽 ,生长健壮
2.3　不同激素组合对不定芽增殖培养的影响
在继代培养中既能使芽有较高的增殖速度又能
健壮生长的主要影响因子除基本培养基外 ,还有细胞
分裂素与生长素的组合和浓度配比 。切取初期培养
的健壮单芽分别接种于不同激素配比的培养基内 ,培
养 25d对各处理的芽增殖情况进行统计和方差分
析 ,其结果见表 3。
表 3　不同激素组合对不定芽增殖培养的影响
6-BA/
mg·L-1
NAA/
mg·L-1
增殖数
/颗
增殖
系数 芽丛形态特征
0.13 0.10 20 2.0 芽高 1.5 ～ 2cm,生长健壮
0.13 0.14 10 1.0 芽高 1.5 ～ 2cm,生长健壮
0.13 0.16 10 1.0 芽高 1.5～ 2.0cm,长势纤弱
0.18 0.10 40 4.0 芽高 1.0 ～ 1.5 cm,愈伤组织较多
0.18 0.14 30 3.0 芽高 1.2～ 1.5cm,生长健壮
0.18 0.16 18 1.8 芽高 1.5 ～ 2cm,长势纤弱
0.30 0.10 45 4.5 叶小 ,芽茎极粗短 ,玻璃化严重 ,愈伤组织多
0.30 0.14 40 4.0 叶小 , 芽茎粗短密集 , 玻璃化严重 ,愈伤组织多
0.30 0.16 35 3.5 叶小 , 芽茎较粗短密集 , 玻璃化 ,愈伤组织多
　　通过双因素方差分析(表 4)认为 , 6-BA、NAA浓
度之间组合和 6-BA×NAA的交互作用对不定芽增
殖存在极显著性差异 ,且二者浓度比值与不定芽的增
殖系数和生长质量密切相关 。本试验显示比较适宜
不定芽增殖的 6-BA浓度为 0.18mg/L,当它与 NAA
浓度比值大于 1.8时 , 虽然芽有较高的增殖系数
4.0,但由于细胞分裂能力过强 ,抑制着生长素结合态
的形成及氧化酶活性 ,导致大量的愈伤组织发生 [ 7] ;
两者比值为 1.1时 ,细胞伸长能力强于细胞分裂能
力 ,芽伸长过快而细弱;两者比值为 1.3时 ,细胞分裂
及其伸长速度比较协调 ,芽生长健壮 。可见 ,激素组
合 6-BA0.18mg/L+NAA0.14mg/L是试验中最适
宜邓恩桉不定芽增殖培养的 ,培养 30d芽增殖系数
为 3.0 ,且芽生长健壮 ,未出现玻璃化 。
表 4　方差分析结果
变异来源 自由度
增殖颗数
SS F
增殖系数
SS F
6-BA 2 3242.666 7 470.71＊＊ 32.426 7 470.71＊＊
NAA 2 892.666 7 129.58＊＊ 8.926 7 129.58＊＊
6-BA×NAA 4 185.333 3 13.45＊＊ 1.853 3 13.45＊＊
2.4　单一生长素组合对单芽根系诱导的影响
切取生长健壮的继代单芽 ,分别接种于 1/2改良
B5添加不同浓度的生长素 NAA和 IAA培养基上进
行根系的诱导 ,培养 20d时其生根状况如表 5。表 5
结果表明 ,生长素 IBA和 NAA均能诱导邓恩桉单芽
的生根 ,但生根率都不是很高 ,各自对根系诱导的作
用差别也不很明显 , NAA浓度为 1.6mg/L时生根率
最高达到 63.3%, IBA浓度为 1.4mg/L时最高的生
根率是 61.7%。当再随着 IBA或 NAA浓度升高时 ,
邓恩桉的生根率并未得到相应的提高 ,反而呈下降趋
势 。在邓恩桉的系列生根培养中 ,其根系被诱导的同
时均伴有愈伤组织的发生 ,而且愈伤组织是随着生长
　应用研究
52　 林业科技开发　2007年第 21卷第 6期
素浓度的提高而愈加严重的。
表 5　单一生长素对邓恩桉单芽生根的影响
IBA/mg·L-1 生根率 /%
愈伤＊
组织 NAA/mg·L-1
生根
率 /%
愈伤＊
组织
0.4 0 无 0.4 0 无
0.6 8.3 无 0.6 0 无
0.8 28.3 + 0.8 18.3 无
1.0 38.3 + 1.0 36.7 +
1.2 51.7 + 1.2 43.7 +
1.4 61.7 ++ 1.4 55.0 +
1.6 58.3 ++ 1.6 63.3 +
1.8 41.7 +++ 1.8 53.3 ++
2.0 31.7 +++ 2.0 48.3 ++
　注:接种数均为 60株;+表示愈伤组织轻度 , ++表示愈伤组织一
般 , +++表示愈伤组织严重。
2.5　生长素组合对单芽生根的影响
将不同浓度的 IBA和 NAA配制成 5种生长素组
合 ,对邓恩桉单芽进行生根培养 , 20d时生根率的统
计结果如表 6。
表 6　生长素组合对邓恩桉单芽生根培养的影响
IBA+NAA
/mg·L-1
接种
数 /株
生根
数 /株
生根
率 /%
根量
/条·株 -1根系生长状况
0.8+1.2 60 31 51.7 3～ 4 形成少量的愈伤组织
1.0+1.4 60 38 63.3 3～ 4 形成少量的愈伤组织
1.2+1.6 60 44 73.3 4～ 5 形成少量的愈伤组织
1.4+1.8 60 40 66.7 4～ 5 形成较多的愈伤组织
1.6+2.0 60 33 55.0 4～ 5 形成很多的愈伤组织
　　生长素 IBA和 NAA搭配组合对邓恩桉单芽根系
诱导的促进作用是比较明显的 ,不仅生根率得到了提
高 ,根系的数量也有所增加 ,大部分小植株每株生长
有 4 ～ 5条根 , 在 5种生长素组合试验中 , 以 IBA
1.2mg/L+NAA1.6mg/L生长素组合的生根率较高
达 73.3%。
3　结论与讨论
(1)采用 0.1%HgCl2消毒邓恩桉优株萌芽条离
体茎段 ,效果较好的处理时间是 8 ～ 10min,无菌活外
植体得率 50% ～ 60%,在同一消毒处理时 ,外植体的
褐化死亡率随着木质化程度的增强而呈下降趋势 。
为提高接种成功率 ,除选择在放晴天气里采集材料
外 ,萌芽条具备一定的木质化也是非常重要的 。
(2)通过 MS、改良 MS、B5 、改良 B5等基本培养
基的比较试验 ,显示邓恩桉组织培养要求培养基内营
养成分比较丰富 ,但某些元素过量或不足对芽生长不
利 , B5 +NH4NO3 60mg/L即改良 B5可作为较适宜的
基本培养基 。
(3)当邓恩桉茎段外植体的始芽被诱导萌动后 ,
其不定芽的分化和生长就不适宜在较高浓度激素尤
其是细胞分裂素与生长素比值较大的激素组合中培
养 。以 6-BA0.18mg/L+NAA0.14mg/L组合对芽
增殖较为适宜 ,不定芽增殖系数 3,且生长健壮 。但
在 6-BA0.3mg/L+NAA0.1 ～ 0.16mg/L组合上 ,
不定芽增殖系数较高在 3.5以上 ,但芽粗短且玻璃化
严重。这可能是因为 6-BA浓度大 ,细胞分裂能力过
强 ,妨碍芽的正常伸长生长。随着继代培养次数的增
加 ,芽体内内源激素会逐渐积累 ,为避免对继代芽以及
往后芽的不定根诱导产生不利影响 ,建议适时采用较高
浓度激素组合 6-BA0.18mg/L+NAA0.14mg/L与较
低浓度激素组合 6-BA0.13mg/L+NAA0.1mg/L交
替使用。
(4)邓恩桉优株继代单芽的生根诱导是采用 1 /2
改良 B5为基本培养基的。在一定浓度范围内单一的
生长素 IBA或 NAA均能诱导生根 ,但生根率都不是
很高 , NAA浓度为 1.6mg/L时生根率最高达到
63.3%, IBA浓度为 1.4mg/L时最高的生根率是
61.7%。生长素 IBA和 NAA组合使用有利于进一步
促进邓恩桉优株单芽根系的诱导和生长 ,当在 IBA
1.2mg/L+NAA1.6mg/L的生长素组合上 ,生根率
较高达 73.3%,每株有 4 ～ 5条根系 。但诸多试验显
示 ,邓恩桉不定根的诱导比较困难 ,一是生根率不太
高 ,二是根系生长不多 , 且常伴随愈伤组织的发生 。
在邓恩桉组培研究中 ,如何提高不定根的诱导率和促
进根系良好生长 , 仍成为国内外研究学者的攻关
重点。
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应用研究